《高效液相色谱分析》PPT课件.ppt

第9章 高效液相色谱分析,High performance liquid chromatography (HPLC),第一节 概 述,GC只适合分析较易挥发、且化学性质稳定的有机化合物，而HPLC则适合于分析那些用GC难以分析的物质。HPLC的应用范围远远超过GC。,高效液相色谱法是继气相色谱之后，20世纪70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术。,1.高效液相色谱法定义,指一种用液体为流动相的色谱分离分析方法。它在经典色谱理论的基础上，采用了高压泵、化学 键合固定相高效分离柱、高灵敏专用检测器等新实验技术建立的一种液相色谱分析法。 高压：150-350105 Pa 高效：大于3万塔板/米（GC：103塔板/米） 高灵敏：10-9 g （紫外检测）、10-11 g （荧光检测）,2.高效液相色谱法与经典液相色谱法的比较,经典液相色谱法，流动相在常压下输送，分析周期长。 高效液相色谱法流动相改为高压输送（最高输送压力可达3.5107Pa）,色谱柱是用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱； 柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。 因此，高效液相色谱具有分析速度快、分离效能高、自动化等特点。 所以称它为高压、高速、高效液相色谱法。,3.HPLC在药物分析中的作用,药品质量标准 在药物分析中，HPLC已成为对各类药物及其制剂进行鉴别、检查、杂质分离及含量测定的重要手段，以下以中国药典和美国药典为代表说明HPLC在药品质量标准中的作用。,Atomic Absorption Spectroscopy 原子吸收光谱 Nuclear Magnetic Resonance 核磁共振 Infrared ray 红外光谱 Fluorescence spectrum 荧光光谱 TI 滴定分析法,药物分析研究方法 以我国分析试验室杂志中的药物分析综述统计分析见表,HPCE 高效毛细管电泳法,3.高效液相色谱法与其他分离方法的比较,4.应用 非挥发性和热不稳定组分的分析，在工业、科学研究，尤其是在生物学和医学等方面应用极为广泛。 如氨基酸、蛋白质、核酸、烃、碳水化合物、药品、多糖、高聚物、农药、抗生素、胆固醇、金属有机物等分析。,1.化学键合固定相: 目前应用最广、性能最佳的固定相 a. 硅氧碳键型： SiOC b. 硅氧硅碳键型：SiOSi C 稳定，耐水、耐光、耐有机溶剂，应用最广；,c. 硅碳键型： SiC d. 硅氮键型： SiN,第三节 HPLC的固定相和流动相,一.固定相,使用条件 为控制样品在分析过程的解离，常用缓冲液控制流动相的pH值，但需要注意的是，C18和C8使用的pH值通常为2.57.5（28）。 太高的pH值会使硅胶溶解，太低的pH值会使键合的烷基脱落。,化学键合固定相的特点,（1）传质快，表面无深凹陷，比一般液体固定相传质快； （2）寿命长，化学键合，无固定液流失，耐流动相冲击；耐水、耐光、耐有机溶剂，稳定； （4）选择性好，可键合不同官能团，提高选择性。,固定相类型 极性固定相：正相色谱 以极性有机基团如胺基（-NH2）、腈基（-CN）、醚基（-O-）等键合在硅胶表面制成的 非极性固定相：反相色谱 是C18、C8和苯基键合相的填料，,反相色谱是当今液相色谱的最主要分离模式。,2.液-固吸附固定相,种类：硅胶、氧化铝、分子筛、聚酰胺等； 结构类型：全多孔型和薄壳型； 粒度：510 m；,应用： 对于异构体分离和族分离是最有效的方法，如农药异构体分离，石油中烷、烯、芳烃的分离。 缺点是容易产生不对称峰和拖尾现象。,各组分的出峰顺序(正相色谱） 极性较小组分，吸附力较弱，容易解吸，先流出。 极性较大组分滞留作用大，后流出。,二、液相色谱的流动相,1. 流动相特性 流动相组成改变，极性改变，可显著改变组分分离状况,2. 流动相类别,按流动相组成分：单组分和多组分； 按极性分：极性、弱极性、非极性； 常用溶剂： 己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水。 采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间。,3. 流动相选择,在选择溶剂时，溶剂的极性是选择的重要依据。 常用溶剂的极性顺序： 水(最大) 甲酰胺 乙腈 甲醇 乙醇 丙醇 丙酮 二氧六环 四氢呋喃 甲乙酮 正丁醇 乙酸乙酯 乙醚 异丙醚 二氯甲烷氯仿溴乙烷苯四氯化碳二硫化碳环己烷己烷煤油(最小),4. 选择流动相时应注意的几个问题,（1）尽量使用色谱纯试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（5）应与检测器相匹配。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,（4）黏度小些为好 否则造成传质速率缓慢，柱效下降。,三、 液-液分配色谱,固定相与流动相均为液体（互不相溶）； 基本原理：组分在固定相和流动相上的分配； 流动相：对于亲水性固定液，采用疏水性流动相， 流动相的极性小于固定液的极性（正相 ）; 流动相的极性大于固定液的极性（反相 ）。,液液分配色谱,固定相：早期涂渍固定液，固定液易流失，较少采用； 化学键合固定相：将各种不同基团通过化学反应键合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。C18柱（反相柱）。,四、离子交换色谱法,原理 基于离子交换树脂上可解离的离子与流动相中具有相同电荷的溶质离子进行可逆交换，根据这些离子对交换剂具有不同的亲和力进行交换达到平衡。,如磺酸基和羧酸基可以用于阳离子的分离，季胺盐可以用于阴离子的分离。,阳离子交换：,阴离子交换：,离子交换树脂上可以离解的离子和流动相中具有相同电荷的的溶质离子之间进行的可逆交换，根据这些离子对交换剂有不同的亲和力而被分离。,以阳离子交换为例,不同的样品阳离子与交换基团的作用力大小不同，电荷密度大的离子与交换基团的作用力大，在树脂中的保留时间就长，于是不同的离子相互分离。,以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。 凝胶色谱又常被称作体积排斥色谱、空间排阻色谱。 比固定相孔径大的溶质分子不能进入孔内，迅速流出色谱柱。 比固定相孔径小的分子才能进入孔内而产生保留，溶质分子体积越小，进入固定相孔内的机率越大，于是在固定相中停留（保留）的时间也就越长,五、凝胶色谱,凝胶过滤色谱（gel filtration chromatography, GFC）： 以水或缓冲溶液作流动相的凝胶色谱法。主要适合于水溶性高分子的分离。 凝胶渗透色谱（gel permeation chromatography, GPC）： 以有机溶剂作流动相的凝胶色谱法。主要适合于脂溶性高分子的分离。如甲苯和四氢呋喃能很好地溶解合成高分子，所以GPC主要用于合成高分子的分子量（分布）的测定。,1.流程图,第四节 高效液相色谱仪,高效液相色谱仪由 高压输液系统、进样系统、分离系统、检测系统、记录系统 等五大部分组成。 分析前，选择适当的色谱柱和流动相，开泵，冲洗柱子，柱子达到平衡而且基线平直。 用微量注射器把样品注入进样口，流动相把试样带入色谱柱进行分离，分离后的组分依次流入检测器，最后和洗脱液一起排入废液缸。,当有样品组分流过检测器时，检测器把组分浓度转变成电信号，经过放大，用记录器记录下来得到色谱图。 色谱图是定性、定量和评价柱效高低的依据。,(1) 高压输液泵 A、主要部件之一，压力：1535MPa。 B、应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定、可调、耐腐蚀等特性,2.主要部件,(2) 脱气装置 流动相为什么要脱气,流动相溶液往往因溶解有氧气或混入了空气而形成气泡。 气泡进入检测器后会在色谱图上出现尖锐的噪音峰。 气泡进入流路或色谱柱中会使流动相的流速变慢或出现流速不稳定，致使基线起伏。 气泡一旦进入色谱柱，排出这些气泡则很费时间。 溶解气体还可能引起某些样品的氧化或使溶液pH值发生变化。,脱气方法 离线超声波振荡脱气和在线真空脱气。 a. 超声波振荡脱气： 将配制好的流动相连容器放入超声水槽中脱气10-20min。 这种方法比较简便，又基本上能满足日常分析操作的要求，所以，目前仍广泛采用。,b. 真空脱气装置,将流动相通过一段由多孔性合成树脂膜制造的输液管，该管外有真空容器，真空泵工作时，膜外侧被减压，分子量小的氧气、氮气、二氧化碳就会从膜内进入膜外而被脱除。 一般的真空脱气装置有多条流路，可同时对多个溶液进行脱气。,为什么要进行梯度洗脱？ 在进行多成分的复杂样品的分离时，经常会碰到前面的一些成分分离不完全，而后面的一些成分分离度太大，且出峰很晚和峰型较差。 为了使保留值相差很大的多种成分在合理的时间内全部洗脱并达到相互分离，往往要用到梯度洗脱技术。,(3) 梯度洗脱,梯度洗脱操作 在液相色谱中流速（压力）梯度和温度梯度效果不大，而且还会带来一些不利影响，因此，液相色谱中通常所说的梯度洗脱是指流动相梯度，即在分离过程中改变流动相的组成或浓度。,定义：流动相中含有两种（或更多）不同极性的溶剂，在分离过程中按一定的程序连续改变流动相的配比和极性，以提高分离效果。 例如，甲醇-水40:60到45:55到50:50 优点：分离时间缩短，分辨能力增加，峰形改善,梯度洗脱装置,高压梯度: 利用两台高压泵，将两种不同极性的溶剂按一定的比例送入梯度混合室，混合后进入色谱柱。,低压梯度: 一台高压泵, 通过比例调节阀, 将两种或多种不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。,混合就在比例阀中完成。因为比例阀是在泵之前，所以是在常压（低压）下混合，在常压下混合往往容易形成气泡，所以低压梯度通常配置在线脱气装置。,(4) 进样装置,流路中为高压力工作状态， 通常使用耐高压的六通阀进样装置，,(5) 高效分离柱,柱体为直型不锈钢管，内径16 mm（常用4.6mm或3.9mm），柱长540 cm（常用15cm或25cm）。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。 与GC色谱柱不同。,a. 紫外检测器 基于Lambert-Beer定律，即被测组分对紫外光或可见光具有吸收，且吸收强度与组分浓度成正比。 应用最广，对大部分有机化合物有响应。 特点： 灵敏度高； 线形范围高； 流通池可做的很小（1mm 10mm ，容积 8L）； 对流动相的流速和温度变化不敏感； 波长可选，易于操作。,(6) 检测器,紫外吸收检测器有三种类型： 固定波长紫外吸收检测器：低压汞灯提供固定254 nm或280 nm紫外光。 可变多波长检测器：氘灯做光源，光栅分光 光二极管阵列检测器photodiodearray detector（PDAD，PDA, DAD）：钨灯和氘灯组合光源，进入检测池的不是单色光，而是一段紫外波长上的光。,b. 荧光检测器（Fluorescence detector）,高灵敏度、高选择性； 对多环芳烃，维生素B、黄曲霉素、卟啉类化合物、农药、药物、氨基酸、甾类化合物等有响应。,原理： 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、生化物质，如有机胺、维生素、激素、酶等，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。 荧光强度与激发光强度、量子效率和样品浓度成正比。 有的有机化合物虽然本身不产生荧光，但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。,特点： 有非常高的灵敏度和良好的选择性，灵敏度要比紫外检测法高2-3个数量级。而且所需样品量很小，特别适合于药物和生物化学样品的分析。,用于检测阳离子和阴离子，在离子色谱中应用最多。其检测原理是根据组分在某些介质中电离后所产生的电导的变化而测定该组分的含量。 ECD工作时需保持恒温，它不适用于梯度洗脱。 电导检测器的构成： 由电导池、测量电导率所需的电子线路、变换灵敏度的装置和数字显示仪等几部分组成，电导池是其核心。,C.电导检测器（ECD）,D.示差折光检测器 (RID),又称折射率检测器。原理：基于样品组分的折射率与流动相溶剂折射率有差异，当组分洗脱出来时，会引起流动相折射率的变化，这种变化与样品组分的浓度成正比。,绝大多数物质的折射率与流动相都有差异，所以RI是一种通用的检测方法。 虽然其灵敏度比其他检测方法相比要低1-3个数量级。对于那些无紫外吸收的有机物（如高分子化合物、糖类、脂肪烷烃）是比较适合的。 在凝胶色谱中是必备检测器，在制备色谱中也经常使用。,E.蒸发散射光检测器（ ELSD）,ELSD是基于溶质的光散射性质的检测器。由雾化器、加热漂移管（溶剂蒸发室）、激光光源和光检测器（光电转换器）等部件构成 色谱柱流出液导入雾化器，被载气（压缩空气或氮气）雾化成微细液滴，液滴通过加热漂移管时，流动相中的溶剂被蒸发掉，只留下溶质， 激光束照在溶质颗粒上产生光散射，光收集器收集散射光并通过光电倍增管转变成电信号。,因为散射光强只与溶质颗粒大小和数量有关，而与溶质本身的物理和化学性质无关，所以ELSD属通用型和质量型检测器。 适合于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品的检测。与示差折光检测器相比，它的基线漂移不受温度影响，信噪比高，也可用于梯度洗脱。,电学和电化学检测器： 安培检测器 电导检测器 库仑检测器 介电常数检测器 极谱检测器,美国Waters公司 600E 高效液相色谱仪,生物化学和生物工程 医药 食品分析 环境分析 精细化工,第七节 HPLC的应用,HPLC在各领域的主要应用,1. 环境中有机氯农药残留量分析 固定相：薄壳型硅胶(37 50m) 流动相：正己烷 流 速：1.5 mL/min 色谱柱：50cm2.5mm(内径) 检测器：示差折光检测器,可对水果、蔬菜中的农药残留量进行分析。,液固吸附色谱,2. 稠环芳烃的分析,固定相：十八烷基硅烷键合相(ODS) 流动相：20%甲醇-水 100%甲醇 线性梯度淋洗，2%/min 流 速：1mL/min 柱 温：50 C 柱 压：70 104 Pa 检测器：紫外检测器,反相色谱，梯度洗脱,液相色谱实验所需的基本参数 流动相：种类及配比，等度或梯度 固定相：色谱柱类型及内径、长短 流动相输送系统参数：流速 检测器参数：紫外检测波长，灵敏度等 温度控制 进样量 以上参数即构成一个具体的HPLC方法；亦称色谱条件,四、制备型液相色谱 preparative liquid chromatography,获得高纯物质（色谱纯）的有效方法。 半制备柱（内径8mm，长度15 30cm），一次制备量.1mg；,1.色谱柱的柱容量（柱负荷） 对分析柱：不影响柱效时的最大进样量； 对制备柱：不影响收集物纯度时的最大进样量； 超载：进样量超过柱容量。柱效迅速下降，峰变宽。 超载可提高制备效率，以柱效下降一半或容量因子k降低10%为宜。,2. 液相制备色谱的方法,收集组分时，通常有以下情况： （1）可获得良好分离，主峰 使用制备柱，超载提高效率； （2）两主成分之间的小组分； 超载，分离切分使待分离组分成为主成分（富集）后，再次分离制备。,3. 制备型液相色谱,制备型液相色谱：结构与分析型一样，但泵流量大、进样量大、采用制备柱；柱后馏分收集器。 制备柱：内径2050mm，柱长50cm。,液相色谱与气相色谱的比较 液相色谱所用基本概念和基本理论基本一致。 液相色谱所用的仪器设备和操作条件与气相色谱不同，所以，液相色谱与气相色谱有一定差别，主要有以下几方面：,（1）应用范围不同 GC仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。致使其应用受到一定程度的限制，只有大约20%的有机物能用气相色谱分析； HPLC则不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，大约占有机物的70 - 80%。,（2）流动相的作用不同 气相色谱的流动相载气是色谱惰性的，不参与分配平衡过程，与样品分子无亲和作用，样品分子只与固定相相互作用。 液相色谱流动相液体也与固定相争夺样品分子，为提高选择性增加了一个因素。也可选用不同比例的两种或两种以上的液体作流动相，增大分离的选择性。,（4）色谱柱： GC填充柱16m，毛细管柱20100m，螺旋型； HPLC 15cm或25cm，直型。,（3）操作条件： GC需高温； HPLC通常在室温下进行，高压（液体粘度大，峰展宽小）。,(5)分离效率不同 HPLC：大于3万塔板/米 （GC：103塔板/米）,(6)仪器构造不同 HPLC:脱气装置，高压泵 GC：汽化室，温控系统,HPLC的特点和实际应用,1、利用其高柱效（n=104块/米），有效分离极复杂 体系中的痕量组分。 正相色谱分离有机溶剂中的物质 反相色谱分离水溶液中的物质-生化物质。 2、用离子型固定相建立的离子交换色谱和离子对 色谱法分析离子型体的含量。（蛋白质、氨 基酸、常见阴阳离子等） 3、利用多孔凝胶固定相建立空间排阻色谱法可分 离高分子化合物。,综上所述，高效液相色谱法具有高柱效、高选择性、分析速度快、灵敏度高、重复性好、应用范