课件：同工酶实验宁波大学.ppt

垂直电泳分离同工酶 （活性染色鉴定法）,实验目的：,理解同工酶的概念及遗传学意义 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳操作技术 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色,同工酶是指能够催化相同的化学反应，但酶分子结构、理化特性乃至免疫学性质不同的一组酶。 它们是由遗传体系决定的在不同组织中表达的蛋白质作用相同,但分子结构、理化特性等不同. 由于同工酶存在蛋白结构及理化性质的不同，在电泳时条带略有差异,因此可用电泳将它们分离开来。 本实验做的是乳酸脱氢酶的分离鉴定,乳酸脱氢酶,用电泳方法将LDH同工酶分离，分析其酶谱，发现脊椎动物各组 织中有五条酶带。每条酶带的酶蛋白都是由四条肽链组成的四聚 体，LDH有两类肽链，A（M）或B（H），各有不同 同工酶的 免疫性质，按排列组合可形成符合于电泳酶带数的五种同工酶。 LDH1及LDH5分别由纯粹的4条B链（B4）和4条A链（A4）形 成，称为纯聚体；而LDH2、LDH3和LDH4都是由两类肽链杂交 而成的，分别可写成AB3、A2B2、A3B，称为杂交体,聚丙烯酰胺凝胶电泳分离蛋白质的原理,净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子进行的电泳，利用蛋白质分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，而在电场中泳动的速度和方向不同，达到分离的目的。,实验器材：,夹心式垂直板电泳槽，梳子，直流稳 压电源（电压300-600V，电流50- 100mA），移液枪（各种量程），烧杯 （100mL），培养皿,实验流程,试剂的配制 仪器的准备 动物组织的样品的获取 分离胶（30分钟） 浓缩胶（30分钟） 电泳（2-3小时） 染色（30分钟） 观察结果,一、试剂： 1.凝胶储备液： 储备液： pH8.9 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，36.6g Tris，加双蒸水到 80ml，调节pH到8.9定容到100ml。 储备液 ： pH6.7 TrisHCl缓冲液：1 M HCl 48ml，5.98g Tris，加双蒸水到80ml，调节pH到6.7定容到100ml。 储备液： 分离胶储备液（30% Acr/Bis）：30g Acr，0.8g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4存放可以保存1个月。 储备液： 浓缩胶储备液：10g Acr，2.5g Bis，用双蒸水定容到100ml，备用，4可以保存1个月。 储备液： 10% Aps（W/V）：1g定容到10ml，-20保存。 储备液： 40%蔗糖：40g蔗糖溶解到60ml双蒸水中。 TEMED 2.电泳缓冲液： Tris6.0g，28.8gGly 加双蒸水到900ml调节pH到8.3，定容到1000ml，使用时稀释10倍。,样品制备,取材： 大黄鱼若干条，解剖取1.肠、2.眼睛、3.鳃、4.肌肉、5.脾、6.鳍、7.肝、8.心脏 放入冰箱保存。 提取酶：取不同组织块，加入提取缓冲液Tris-Hcl(pH=7.0) 此溶液需预冷，组织重量（g）与缓冲液体积（mL）之比为：5,用研钵研磨充分。浆液离心约分钟，转分钟。 取上清液至新管，吸取其中150ul样品，加ul 甘油 和ul溴酚蓝，混匀之后即可点样。,分离胶的制备,将需要的凝胶储备液从冰箱中取出，放置备用。取一100ml烧杯，按表比例混匀之后使用。,配方表,浓缩胶的制备,TEMED最后一个加入，轻轻混匀。移液枪吸取加入约2.0CM左右高度的浓缩胶液，然后插入样品梳，注意不要产生气泡。当浓缩胶上出现水层后表明聚合完成。再放置3060min后可以使用。 加入少量电泳缓冲液，小心拔出样品梳（两端同时向外拔），再注满缓冲液备用。,配方表,点样,加样,样品迁移方向,电 泳,电压和电流：浓缩胶电压100v，分离胶电压180V. 电流流1830mA 溴酚蓝跑至分离胶末端，电泳结束。大约2-3个小时,夹在两块玻璃板之间的凝胶,电泳缓冲液,电泳缓冲液,加在槽中的样品,分子量小,分子量大,电源,电泳示意图,电泳过程中分子迁移的规律，小分子走在前头，大分子滞后。电泳凝胶相当于凝胶过滤中的一个带孔胶粒。,混合样品,带孔胶,按分子大小分离,电泳方向,电泳,小分子,大分子,乳酸脱氢酶染色剂的配制,乳酸钠 0.5ml NAD 25mg PMS 2mg NBT 15mg 0. 2M TrisHcl溶液（PH8.0）10ml 去离子水定容至50ml,染色与观察,将胶从中间切成2块，各自切去一个小角（作为标记），去离子水轻轻从玻璃板上吹下， 置于大培养皿中，去离子水浸洗之后倒入染 染色剂浸没，避光于37度摇床中染色30min。 观察拍照,思考题：,根据实验过程的体会，总结如何做好聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳？哪些是关键步骤？哪些过程中是 为什么要在样品中加入少许溴酚蓝和甘油溶液？分别有何用途？,谢谢,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,The user can demonstrate on a projector or computer, or print the presentation and make it into a film to be used in a wider field,后面内容直接删除就行 资料可以编辑修改使用 资料可以编辑修改使用 资料仅供参考，实际情况实际分析,主要经营：课件设计，文档制作，网络软件设计、图文设计制作、发布广告等 秉着以优质的服务对待每一位客户，做到让客户满意！ 致力于数据挖掘，合同简历、论文写作、PPT设计、计划书、策划案、学习课件、各类模板等方方面面，打造全网一站式需求,感谢您的观看和下载,T