诱导细胞凋亡的信号转导.ppt

诱导细胞凋亡的信号转导,死亡受体介导的细胞凋亡,凋亡与疾病 一、凋亡与恶性肿瘤 肿瘤的发生不仅与细胞过度增殖有关，还与凋亡障碍有关。 Oncogenes “anti-apoptic”genes Cell division cell death 肿瘤治疗新思路：诱导肿瘤细胞的凋亡,二、凋亡与免疫系统功能障碍 （一）凋亡对免疫系统功能有重要调节作用 1、淋巴细胞：在发育过程中有凋亡发生； 在晚期，当与抗原相互作用时亦发生 凋亡。 2、胸腺发育过程中的自然凋亡过程,（二）凋亡与免疫缺陷性疾病 典型例子是AIDS 1、HIV-1感染后可引起CD4+T淋巴细胞的 凋亡，且可能由病毒被膜蛋白复合体 gp120介导。 2、AIDS患者外周血淋巴细胞Fas/Apo水平 明显提高，可迅速诱导细胞凋亡。 由此，通过控制凋亡过程是否可以预防或延缓AIDS的进展。,三、凋亡与神经退行性病变 神经元是non-proliferating, long-lived, terminally differentiated cell。 神经元等非增殖细胞发生凋亡的意义： 1、避免细胞重新进入细胞周期，特别是遇 到致转化刺激信号时。如向终末分化的 细胞中转染oncogene可引起细胞凋亡， 而非增殖。,2、为了器官生存的需要 A deleted cell is more advantageous than a damaged cell, even when the cell is irreplaceable. This is analogous to what is frequently referred to as “better dead than wrong” for dividing cell,四、凋亡与心脏病 （一）心脏传导障碍和心律失常 心脏传导系统在胚胎早期就已形成。新生儿窦房结主要有大量起搏细胞（P细胞）和少量胶原组成，而成人则为少量P细胞和大量胶原构成，可能是P细胞凋亡的结果。因此P细胞凋亡不足或过度均可引起心律失常。,（二）心肌缺血和再灌注损伤 心肌缺血再灌注后可引起心肌细胞的凋亡，由于心肌组织中吞噬细胞数量有限，故而凋亡细胞可以激发性引起炎性反应，招引中性粒细胞浸润，进而导致心肌组织坏死（心肌梗塞）。,五、凋亡与衰老等,细胞凋亡的检测,随着研究技术的提高和对凋亡的认识不断深入，检测凋亡的方法已从细胞、染色质到分子水平日趋完善和成熟。 1. 形态学检测 2. DNA降解分析 3. 凋亡酶学分析 4. 凋亡相关蛋白分析 5. 流式细胞分析,一细胞凋亡的形态学分析,细胞凋亡的形态学变化主要表现为：细胞皱缩(cell shrinkage)，失去细胞连接(cell junction)，微绒毛(microvilli)消失，发泡(blebbing)，染色质浓集并靠近核膜，形成沿核膜收缩的新月状体(crescents)，形成凋亡小体(apoptotic body)等。,细胞凋亡的形态学检测方法,二. DNA降解分析,DNA降解过程的特点： 1. 发生于凋亡早期，由内源性核酸内切酶激活引起 2. DNA在核小体连接部位断裂，产生180200bp为最小单位的单体或寡聚体片断 3. DNA碎片可被细胞膜包裹，形成凋亡小体,(一) DNA凝胶电泳 原理：凋亡细胞降解产生一系列规则的DNA片断，其电泳结果呈典型的“ 梯状带”(ladder)；而坏死或凋亡后坏死细胞的DNA分解是随机的，产生的碎片分子量大小不一，在电泳时形成“ 涂片状”(smear)。 普通琼脂糖凝胶电泳、Southern blotting、放射自显影(32PdATP或32PdCTP连接到DNA片断的3 端),(二) 原位标记法 TUNEL(TdT mediated dUTP nick end labeling)终末脱氧核糖核苷酸转移酶介导的原位缺口末端标记技术。 原理：在TdT的作用下，带有标记物的dUTP被连接在断裂DNA3末端，然后通过相应的方法检测标记物，从而判断是否有凋亡发生。 应用范围：石蜡包埋的组织切片、冰冻组织切片、培养细胞、组织中分离的细胞,(三) ELISA法 原理：以抗组蛋白抗体包被微孔板壁，加入标本，凋亡细胞的核小体可与抗体结合，再加入抗-DNA片断-POD复合物，与核小体中的DNA片断结合，最后加入POD显色底物，以酶标仪测定光密度以进行定量分析。,三. 凋亡酶学分析,1. 内切核酸酶(endonuclease, DNase) 种类：DNase （内质网、高尔基体), DNase （溶酶体、胞核)，NUC18（胞核，胸腺细胞中) 等 作用：使DNA断裂成180200bp或其倍数的片断 激活机制：CAD(caspase-activate DNase) ICAD(inhibtor of CAD) 检测：Western Blotting,2. Caspases家族 Caspase是半胱氨酸基天冬氨酸特异性蛋白酶(cysteinyl aspartate specific proteinase)的缩写，共有13个家族成员。可将人体内的caspases分为三个亚家族：ICE亚家族，caspase-1,4,5, 主要参与炎症反应；Yama亚家族，caspase-3, 6, 7, 8,10, 主要参与细胞凋亡；Nedd-2亚家族，caspase-2,9，参与细胞凋亡。 启动型：caspase8,9,10 执行型：caspase3,6,7,Caspases 蛋白酶的共同特点 1. 均为天冬氨酸特异性的半胱氨酸蛋白酶； 2. 均含保守的五肽序列(Gln-Ala-Cys-Arg-Gly,QACRG) 3. 均以无活性的酶原形式存在，经蛋白裂解激活 4. 常有异构体形式存在 5. 裂解的最适序列为含Asp的四肽,Caspases作用的一些底物 PARP：DNA修复酶 DNA-PK：参与双链DNA断裂修复的酶 核纤层蛋白(lamins)：核膜的重要结构蛋白 胞衬蛋白(fodrin)：大多数真核细胞 骨架的组成成分，裂解后参与凋亡小体或blebbing的形成 U1小核糖体蛋白的70kD蛋白(U1-70kD)：参与RNA的剪接,其他凋亡相关的酶： 丝氨酸蛋白酶：GranzymeA ,B ,1 Calpains 转谷氨酰胺酶(T Gase): tT Gase 诱导型一氧化氮合成酶(iNOS),Caspases的检测 1. Caspase-3活性测定(FIENA法) 荧光测定免疫吸附法(flurometric immunosorbent enzyme assay, FIENA), caspase-3可作用于连接荧光素的特异底物乙酰化天冬氨酸-谷氨酸-颉氨酸-天冬氨酰胺(Ac-DEVD), 产生发荧光的裂解产物AFC，且caspase-3活性与Ac-DEVD-AFC分解的量或自由荧光AFC产生荧光的强弱成正比，故可定量检测 2. 蛋白印迹法 Caspases作用底物的检测 PARP89kD的检测,四. 凋亡相关蛋白分析,1. Bcl-2家族 促进凋亡：Bax, Bal, Bcl-Xs, Bad, Bid, Bik, Bim, Hrk, Bok等 抑制凋亡：Bcl-2, Bcl-Xl, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl-1等 均含有BH(Bcl-2 homology)结构域，通过此结构域以二聚体形式调控凋亡。 2. 其他相关蛋白