无菌试验方法和验证课件

Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,无菌实验方法验证 2010.12 王彦忠,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,内容介绍 1. 微生物实验室的要求； 2. 2010版药典无菌检查法的主要增修订情况； 3.无菌检验方法验证的要求； 4. 无菌检查的注意事项和GMP检查的重点。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,一、微生物实验室的要求,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：,人员,培养基,菌种,实验室的布局和运行,设备,文件,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,人员：,人员的专业背景； 从事药品微生物试验工作的人员应具备微生物学或相近专业只是的教育背景。 人员培训应覆盖仪器设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等； 实验人员应依据所在岗位和职责接受相应的岗前培训，包括：仪器设备操作、微生物检验技术和实验室生物安全等方面的培训，检验人员必须熟悉相关检测方法、程序、检测目的和结果评价，经考核后方可上岗。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,人员：,应通过内部质量控制、能力验证或使用标准菌株等方法评估检验人员的能力。 如有必要（如一段时间内由于人员的原因偏差重复出现或显示某种不良趋势），需要对其进行再培训并重新评估。当使用一种非经常使用的方法或技术时，有必要再检测前确定微生物检测人员的操作技能（并不意味着熟练的人员就不需要进行再培训或者能力再评估）。 所有人员的培训、考核内容和结果均应记录归档。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,培养基的制备 配制培养基的水应该是纯化水，并且需要记录所用纯化水的制备日期。 脱水培养基应完全溶解于水中，再行分装与灭菌。配置时如需要加热助溶，须注意不能加热过度，否则颜色会变深。 培养基灭菌一般采用湿热灭菌技术，特殊培养基可采用薄膜过滤除菌。 通常按照生产商提供或使用经过验证的参数进行培养基的灭菌。商品化的培养基必须附有灭菌方法。 对于一些热敏感的培养基不能使用湿热灭菌技术。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,培养基的制备 培养基应采用验证合格的灭菌程序灭菌。应对高压灭菌器的蒸汽循环系统进行验证，确保在一定装载方式下的正常热分布。 如培养基使用不适当的加热和灭菌条件，可能会引起颜色变化、透明度降低、琼脂凝固力或pH的变化。 温度缓慢上升的高压灭菌器可能导致培养基过热，过度灭菌可能会破坏绝大多数的细菌和真菌培养基的促生长能力。 应确定每批培养基灭菌后的pH值（25下测定）。 如无特殊规定，通常pH的范围不能超过规定值的0.2,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,培养基的制备 应对分装后的培养基进行质量检查，并记录批数量、有效期及无菌情况等信息。 通常需要对制成平板或分装于试管的培养基进行下列检查： 容器和盖子不得破裂； 装量应相同； 尽量避免形成气泡； 固体培养基表面不得产生裂缝或涟漪； 在冷藏温度下不得形成结晶； 不得污染微生物。,培养基：,培养基的灭菌 a.湿热高压蒸汽灭菌法：依115 121或132，应用于培养基灭菌、试验器械、工作服、橡胶物品灭菌和实验室废弃物，也可用于玻璃器皿的灭菌。一般12130min 因为湿热中菌体吸水，蛋白质容易凝固，因蛋白质含水量增加，所需凝固温度降低；湿热的蒸气有潜热存在。所以效果比同温度下干热好。 b.干热法：利用物理学，171-1小時、160-2小時、121-3小時 : 玻璃器皿,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,培养基的贮藏 自配培养基应标记名称、批号、配制日期等信息，商品化的成品培养基应标记名称、批号、生产日期和失效期等信息。 自制的培养基应再验证的条件下贮藏； 商品化的成品培养基应按照说明书上的要求进行贮藏，以最大限度的减少水份的流失。 灭菌后的培养基应尽快从灭菌器内取出，琼脂培养基应防止冷冻，因为冷冻可能破坏凝胶特性。容器应密闭，防止水分流失；琼脂平板宜临用新配，如置冰箱保存，一般不超过一周，如需延长，则应对保存期进行验证,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,培养基的贮藏 固体培养基灭菌后只允许再融化一次，以避免培养基过度受热造成培养基质量下降或微生物污染。一般采用水浴加热或流通蒸汽的方式再融化培养基，如使用微波炉，应避免过度加热和水分流失。融化后的培养基应置4550的水浴中保温，时间不得超过8小时。 倾注培养基时，应擦干培养基容器外表面的水分，避免容器外壁的水滴进入培养基中造成污染。 使用过的培养基应按照国家污染废物处理相关规定进行,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,质量控制试验 实验室应制订培养基质量控制程序。 所有配制好的培养基均应进行质量控制试验。 培养基质量控制的项目有：pH值、适用性检查和定期的稳定性检查以确定有效期。 当培养基的配制和灭菌程序等均已验证，则同一批次的脱水培养基的适用性检查试验可只进行一次。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,培养基：,质量控制试验 如果培养基的制备过程未经验证，那么每一批培养基均要进行适用性检查试验，试验菌种除根据培养基的用途从相关附录中进行选择，也须增加从环境及产品中分离的常见污染菌株。 用于环境监控的培养基须特别防护，用于关键区域监控的培养基宜双层包装和终端灭菌，以防出现假阳性。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：,人员,培养基,菌种,实验室的布局和运行,设备,文件,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,菌种：,由于菌种可能是微生物试验中最敏感的影响因素之一，因此实验室应该详细规定菌种的处理和保藏方法，以尽可能的减少菌种污染和生长特性的改变。 菌种的来源：已认可的国内或国外菌种保藏机构的标准菌株，或与标准菌株所有相关特性等效的商业派生菌株。 标准菌株的复活或培养物的制备应按供应商提供的说明或按已验证的方法进行。 由标准菌株复活得到的为标准储备菌株；应对标准储备菌株进行纯度和特性确认；建议采用冻干、液氮或超低温（小于-30 ）保存的方法。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,菌种：,使用标准储备菌株制备工作菌株。 冷冻菌株一旦解冻转种制备工作菌株后，不得重新冷冻和再次使用。 工作菌株的传代次数不得超过5代。 从菌种保藏机构获得的标准菌株为第0代，以防止过度的传代增加菌种变异的风险。 代的定义：活的培养物接种到微生物生长的新鲜培养基中培养，任何亚培养的形式均被认为是转种或传代一次。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,菌种：,实验室应建立文件化的程序管理菌种（从标准菌株到工作菌株）。 通常该程序包括： 标准菌种的申购记录； 从标准菌株到工作菌株操作及记录； 菌种必须定期转种传代，并作纯度、特性等检查项目； 每支菌种都应注明其名称、标准号、接种日期、传代数 菌种生长的培养基和培养条件； 菌种保藏的位置和条件。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：,人员,培养基,菌种,实验室的布局和运行,设备,文件,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,实验室的布局和运行：,实验室布局的原则：最大程度防止微生物的污染，防止检验过程对环境和人员造成危害。 实验室应具备：满足无菌检查、微生物限度检查和无菌采样等活动的独立设置的洁净室（区）或隔离系统；配套的细菌（真菌）实验室、培养室、准备区、样品接受和贮藏区、标准菌株贮藏区、污染物处理区和文档处理区等辅助实验室；上述区域应明确标识。 应建立洁净区的使用、维护、验证等活动的标准操作规程。操作规程中应详细描述对进出洁净区域的人和物的要求、洁净度检测的频率、消毒和清洁维护的方法、尘埃粒子的标准、浮游菌和沉降菌的标准、消,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,实验室的布局和运行：,毒剂的种类应定期更换，使用的消毒剂应无菌。 实验室的操作应避免交叉污染。 如需对培养物进一步分析，如再培养、染色、微生物签定或其他确定试验应在实验室的活菌操作区进行。任何出现微生物生长的培养物不得在实验室无菌区域内打开。不能再实验室的活菌操作区域或邻近区域进行抽样，以防止在取样过程中使样品受到微生物的污染，以减少假阳性的结果出现。 应建立实验室生物安全的应急控制预案。 应建立微生物实验废弃物的处理规程。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：,人员,培养基,菌种,实验室的布局和运行,设备,文件,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,设备：,实验室的仪器设备完成相应的验证和校验并形成相应的操作、维护和校验的标准操作规程后方可正式使用，使用要有记录。 微生物实验室所用的仪器设备应定期校准，并记录。校准的周期和校验的内容根据仪器的类型和设备在实验室产生数据的重要性而定。 培养箱、冰箱等重要设备应确保状态正常，并有措施保证其运行状态正常和受控。工作的连续性。 可以使用备用设备以保证试验菌株和微生物培养的连续性。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,设备：,培养箱、冰箱、灭菌器等应对关键参数(如:温度/压力)进行连续观测和记录，应评估发生的偏差对以前实验结果的影响并采取必要的纠正措施。 水浴锅、培养箱、冰箱和生物安全柜等应定期清洁和消毒。 无菌器具应具有正确地清洗、灭菌措施并形成标准操作规程，无菌器具应有明显的标识以易于同非无菌器具加以区别。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,我们将按照以下几部分对微生物实验室进行介绍：,人员,培养基,菌种,实验室的布局和运行,设备,文件,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,文件：,一般包括以下内容： 人员培训与资格确认； 设备验证、校验和维修； 设备使用中的运行状态（如：关键参数和使用记录）； 培养基制备、贮藏和质量控制； 检验过程中的关键步骤； 数据记录与结果计算； 数据偏离的调查如：OOS；,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,文件原始记录：,原始记录应包含所有关键的实验细节，以便确认数据的完整性，通常至少包括以下内容： 实验日期； 检品名称； 实验人员姓名； 实验方法； 实验结果； 偏差（如果涉及）； 实验参数（设备、菌种、培养条件、培养基信息等）； 复核人的签名。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,结果的判断：,主要是对不符合标准的结果进行判断。 导致不符合的原因： 实验过程中的污染； 样品污染了超过限度标准的微生物。 对前一种原因，应充分考虑实验室环境、抽样条件、样品检验过程等环节。 如确定为第一种原因，则应判结果无效，重新进行实验。 对重试应加以监控。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,二、 2010版药典无菌检查法的主要增修订情况,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 前言； 培养基灵敏度检查； 稀释液、冲洗液及其制备方法； 方法验证试验； 薄膜过滤法； 培养及观察。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 前言： 新增规定： 1、防止污染的措施不得影响供试品中微生物的检出； 2、日常检验还需要对环境进行监控； 3、无菌检查人员必须具备微生物专业知识，并经过无菌技术的培训。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 2) 培养基灵敏度检查： 新增稀释后的工作用菌液的保存条件和保存期限：“菌液制备后若在室温下放置，应在2小时内使用，若保存在28，可在24小时内使用。黑曲霉孢子悬液可保存在28，在验证过的贮存期内使用。”,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 3) 稀释液、冲洗液及其制备方法： 在原有 1. 0.1%蛋白胨水溶液 2. pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液 的基础上新增加： “可根据供试品的特性，选用其他经验证的适宜的溶液作为稀释液、冲洗液。”,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 4) 方法验证试验： 验证试验用菌种及菌液制备在培养基灵敏度所用菌种的基础上，删除了铜绿假单胞菌，增订了大肠埃希菌。 是因在验证试验的实践中，发现作为革兰氏阴性杆菌代表的铜绿假单胞菌在验证试验中对大部分抗生素不敏感，而大肠埃希菌对抗革兰氏阴性杆菌为主的抗生素敏感性较好。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 5) 薄膜过滤法： 新增规定： 1、抗生素供试品应选择低吸附的滤器及滤膜； 2、对每片滤膜的总冲洗量不得过1000ml； 3、所用冲洗量、冲洗方法同验证试验。 删除项： 删除原直接接种法中-内酰胺类或黄胺类供试品项 因该两类供试品的无菌检查以采用薄膜过滤法加中和剂更好。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,中国药典10版同05版的主要差别： 6) 培养及观察： 对于培养14天后，不能从外观上判断有无微生物生长时，删除了：“或划线接种于斜面培养基上” 的规定。 同时删除了可根据斜面是否有菌生长而判断的规定。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,三、无菌检验方法验证的要求,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,通常无菌分析方法验证包括： 培养基的灵敏度； 菌种和菌液制备； 薄膜过滤法； 直接接种法； 验证结果的判断。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,一、培养基的灵敏度检查： 1.菌种： 枯草芽孢杆菌 CMCC（B）63 501 金黄色葡萄球菌 CMCC（B）26 003 生孢梭菌 CMCC（B）64 941 铜绿假单胞菌 CMCC（B）10 104 白色念珠菌 CMCC（F）98 001 黑曲霉菌 CMCC（F）98 003,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,一、培养基的灵敏度检查： 2.菌液制备： 接种金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物至营养肉汤培养基中或营养琼脂培养基上，接种生孢梭菌的新鲜培养物至硫乙醇酸盐流体培养基中，30-35 培养18-24小时；接种白色念珠菌的新鲜培养物至改良马丁培养基中或改良马丁琼脂培养基上，23-28 培养24-48小时，上述培养物用0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含菌数小于100cfu的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物至改良马丁琼脂斜面培养基上，23-28 培养5-7天，加入3-5ml含0.05(ml/ml)聚山梨酯80的0.9无菌氯,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,一、培养基的灵敏度检查： 2.菌液制备： 化钠溶液，将孢子洗脱。然后，采用适宜的方法吸出孢子悬液至无菌试管内，用含0.05(ml/ml)聚山梨酯80的0.9无菌氯化钠溶液制成每1ml含孢子数小于100cfu的孢子悬液。 3.培养基接种： 取每管装量为12ml的硫乙醇酸盐流体培养基9支，分别接种小于100cfu的金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2支，另1支不接种作为空白对照，培养3天；取,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,一、培养基的灵敏度检查： 3.培养基接种： 每管装量为9ml的改良马丁培养基5支，分别接种小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另1支不接种作为空白对照，培养5天。 4.结果判断： 空白对照管应无菌生长，若加菌的培养基管均生长良好，判断培养基的灵敏度检查符合规定。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,二、菌种和菌液的制备： 除大肠埃希菌外，金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌、白色念珠菌、黑曲霉同培养基灵敏度检查，大肠埃希菌的菌液制备同金黄色葡萄球菌。 三、薄膜过滤法： 取每种培养基规定接种的供试品总量按薄膜过滤法过滤，冲洗，在最后一次的冲洗液中加入小于100cfu的试验菌，过滤。取出滤膜接种至硫乙醇酸盐流体培养中或改良马丁培养基中，或将培养基加至滤桶内。另取一装有同体积培养基的容器，加入等量试验菌，作为对照。置,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,三、薄膜过滤法： 规定温度培养3-5天。 四、直接接种法： 取符合直接接种法培养基用量要求的硫乙醇酸盐流体培养基8管，分别接入小于100cfu的金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌外、枯草芽孢杆菌、生孢梭菌各2管；取符合直接接种法培养基用量要求的改良马丁培养基4管，分别接入小于100cfu的白色念珠菌、黑曲霉各2管。其中1管接入每支培养基规定的供试品接种量，另1管作为对照，置规定温度培养3-5天。,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,五、结果判断： 同对照管比较，如含供试品各容器中的试验菌均生长良好，则说明验证通过，供试品的该检验量在该检验条件下无抑菌作用。如含供试品的任一容器中的试验菌生长微弱、缓慢或不生长，则说明供试品的该检验量在该检验条件下有抑菌作用，应采用增加冲洗量、增加培养基的用量、使用中和剂和灭火剂、更换滤膜等方法，消除供试品的抑菌作用，并进行验证，对于有抑菌作用的供试品详细的验证方法参见“微生物限度检查方法验证部分内容”。,无菌检查验证实验：,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,Reported by Wang Yanzhong 2010.12,Global Manufacturing and Supply,四、无菌检查的注意事项和GM