属源单克隆抗体

3.鼠源单克隆抗体,鼠源单克隆抗体,3.1 鼠源单克隆抗体的产生历史 3.2 鼠源单克隆抗体的原理与制备 3.3 鼠源单克隆抗体的应用,3.1 鼠源单克隆抗体的产生历史,1975年Khler 和Milstein 仙台病毒使小鼠骨髓瘤细胞和羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合产生的杂交瘤细胞 分泌抗羊红细胞抗体的能力，永生的特性,研究为利用B细胞杂交技术制备单克隆抗体翻开了新的历史篇章 获得了1984年诺贝尔生理和医学奖,鼠源单克隆抗体的产生历史,杂交瘤技术的历史渊源： 1847年Bence Jones在骨髓瘤患者病人尿中发现本周蛋白，后经证实，其实质为抗体的轻链。,鼠源单克隆抗体的产生历史,1957年Bernet提出了抗体产生的细胞系选择学说（克隆选择学说）：,鼠源单克隆抗体的产生历史,（单克隆抗体）,1965年Sachs等用矿物油刺激Balb/C小鼠，诱生出骨髓瘤，称为P3。,鼠源单克隆抗体的产生历史,1972年Milstein 等用8-杂氮鸟嘌呤（azaguanine）对骨髓瘤细胞进行诱导，筛选出缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine-guanine-phosphoribosyl transferase, HGPRT）的细胞系，称为P3-X63-Ag8。,鼠源单克隆抗体的产生历史,1964年Littlefield创建了融合细胞的筛选技术，利用两种不同生化缺陷型的双亲细胞进行杂交，借助于含有次黄嘌呤、氨甲喋呤及胸腺嘧啶的HAT的选择性培养基，淘汰双亲细胞及非杂交融合细胞，选择杂交细胞。 H hypoxanthine 次黄嘌呤 A methotrexate 氨甲（甲氨 ）喋呤 T thymine 胸腺嘧啶,鼠源单克隆抗体的产生历史,细胞融合是杂交瘤抗体技术的基础 人们早就观察到在某细情况下或在体外培养中偶尔会有少数细胞可发生自发融合 1958年冈田等用高浓度的仙台病毒使小鼠艾氏腹水癌细胞发生融合,鼠源单克隆抗体的产生历史,1975年Kao 和Chaylu提出用聚乙二醇（polyethylene glycol ,PEG） 作为细胞融合剂，融合率比仙台病毒高数百倍。 目前作为融合剂的主要是PEG的衍生物。,鼠源单克隆抗体的产生历史,上世纪80年代末Zimmermana报道了电融合技术： 在电场中沿电力线排列的细胞在高脉冲电场的作用下，细胞膜局部区域的脂双层之分子结构遭到破坏，出现微孔，细胞膜的通透性增加，继而相邻细胞融合。融合率与PEG相比呈几何级数的增加。,鼠源单克隆抗体的产生历史,杂交细胞合成抗体不存在等位基因排斥,鼠源单克隆抗体的产生历史,单克隆抗体的主要优点： 它是由一个独立的细胞克隆产生的抗体，是一种十分明确的化学制品 提供了用不纯抗原制备纯抗体的理想方法。,鼠源单克隆抗体的产生历史,发展： 杂交瘤与B淋巴细胞的融合或杂交瘤与杂交瘤的融合以产生双功能抗体， 鼠骨髓瘤与人淋巴细胞的融合或人骨髓瘤与人淋巴瘤细胞的融合产生人单克隆抗体的技术相继出现。,鼠源单克隆抗体的产生历史,1984年用DNA技术改造鼠单克隆抗体使之人源化 1989年出现噬菌体展示抗体库(phage display antibody library) 转基因小鼠的出现使得分子生物学技术与鼠单克隆抗体技术结合起来 20年代80年代比利时Louvain大学成功培育出用于制备杂交瘤的大鼠-Lou大鼠，培育了产生kappa-1a和kappa-1b两种不同轻链的同种异型大鼠。,鼠源单克隆抗体的产生历史,3.2.1 鼠源单克隆抗体的制备原理,3.2 鼠源单克隆抗体的原理与制备,生化缺陷型骨髓瘤细胞和B细胞进行融合后，在体系中有5种细胞： 随机融合产生的融合细胞： 骨髓瘤细胞和B细胞， 骨髓瘤细胞和骨髓瘤细胞， B细胞和B细胞 未融合的细胞： 骨髓瘤细胞 B细胞 筛选是关键,鼠源单克隆抗体的制备原理,1960年Barski在研究细胞杂交时发现，两种体细胞融合后，其中一些杂交细胞的核具有双方亲代的特征。 1963年Littlefield首先提出了用选择性培养基分离杂交瘤细胞的方法。以后，Schwader将小鼠的骨髓瘤细胞和人的外周淋巴细胞融合，所得到的杂交瘤细胞可以同时分泌人和鼠的免疫球蛋白。,鼠源单克隆抗体的制备原理,1975年Khler和Milstein用仙台病毒将小鼠的骨髓瘤细胞与致敏的小鼠脾细胞融合，产生的杂交瘤细胞具有两个亲本的特性。经过反复的单细胞培养，形成既能分泌特异性抗体，又具有肿瘤细胞可在体外生长繁殖特征的单细胞株。 从此开创了有目的的大量生产单克隆抗体的方法,鼠源单克隆抗体的制备原理,1.细胞生物合成DNA的主要途径-从头合成途径：,鼠源单克隆抗体的制备原理,四氢叶酸（FH4）作为甲基供体，参与嘌呤环和胸腺嘧啶的合成 氨甲喋呤是二氢叶酸还原酶的不可逆抑制剂，阻止FH2FH4,故可阻止DNA的生物合成。,2.补救途径合成DNA-节约利用途径 需要次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT）和胸腺嘧啶核苷激酶（thymidine kinases, TK）,鼠源单克隆抗体的制备原理,次黄嘌呤+5-磷酸核糖焦磷酸(HGPRT)次黄嘌呤核苷酸+PPi；,HGPRT,脱氧胸苷 （TK）dTMP,HGPRT TK 两种酶缺一不可: HGPRT- or TK-,诱变骨髓瘤细胞：用 8-杂氮鸟嘌呤（azaguanine,8-AG）或6-硫代鸟嘌呤筛选HGPRT突变的细胞。 HGPRT的特异性差，在嘌呤核苷酸的合成中可将8-杂氮鸟嘌呤或6-硫代鸟嘌呤掺入到DNA中，引起细胞死亡，只有缺失该酶的突变细胞能存活。,鼠源单克隆抗体的制备原理,m,核酸补救合成,m,核酸从头合成,核酸,氨甲喋呤(A),(-),次黄嘌呤(H)胸苷(T),TK,HGPRT,TK-,HGPRT-,获得了对HAT的敏感性 -在有HAT的培养基上不能生长,缺乏HGPRT或TK的细胞同时不能利用补救途径合成DNA,氨甲喋呤（A）抑制了从头合成途径,突变骨髓瘤细胞与脾细胞融合后： 脾脏B细胞为DNA合成的补救途径提供HGPRT，所以杂交细胞可在HAT中存活增殖.产生均一的、具特异性的抗体-单克隆抗体 未融合的骨髓瘤细胞 B细胞,鼠源单克隆抗体的制备原理,3.2.2小鼠单克隆抗体的制备 准备 融合 融合后管理,3.2.2.1 融合前的准备工作 1组织培养材料的准备 1)主要设备： 一般有组织培养能力的实验室均具有研制杂交瘤的基本条件。必要的仪器 超净工作台、CO2恒温培养箱、倒置显微镜、普通显微镜、离心机、液氮储存器、水浴恒温装置、冰箱、培养液过滤装件、多孔培养板、塑料器皿及其它实验室常用的材料。,小鼠单克隆抗体的制备,2)组织培养用水： 一般都采用去离子水，将蒸馏水经超滤装激过滤后，即可除去其中的绝大部分离子 在整个室验过税中部应该使用符合规格的用水。,小鼠单克隆抗体的制备,3)培养基： 制备单克隆抗体最常用的培养基有两种 一种是改进的Dulbeccos Modified Eagle Medium (DMEM). DMEM又有两种，一种是高糖的(4500mg/L)，另 一种是低糖的(1000mg/L).用于小鼠融合的常为含高糖DMEM 另一 种为RPMI1640，用于制备人单抗,小鼠单克隆抗体的制备,4)血清：胎牛血清 补充一定量的马血清融合细胞会迅速生长，同时又可节省一些胎牛血清 对于融合亲代细胞的培养一般采用含10胎牛血清 但在融合、筛选及随后的克隆中一般用含20的胎牛血清培养基，一旦筛选出所需要的杂交瘤细胞后，可以将所含胎牛血清浓度逐步降低到10或低至5,小鼠单克隆抗体的制备,根据需要在用前可以将血清灭活，即放在56 水浴中温育30分钟，以破坏血清中补体的活性。 在56 保温45分钟可以杀伤支原体 血清分装成每次需要的数量， -20 保存 反复冻融会影响血清的质量。,小鼠单克隆抗体的制备,5)抗生素： 常见的微生物污染主要来自病毒、细菌、真菌及支原体 细菌的污染可以用抗生素来控制 青霉素100Uml和链霉素100gml,小鼠单克隆抗体的制备,真菌的污染 难以防范 这主要是环境中，特别是温热湿热的环城是霉菌生长的良好环境 当发现有真菌污染时，最好的方法是将其销毁,小鼠单克隆抗体的制备,支原体污染: 支原体大小为0.22m左右，约有1%可以通过0.22m滤菌器. 支原体污染细胞后，培养基中酚红指示剂除了显示比较酸性的情况外并不发生混浊，细胞病理变化轻微或不显，所以很难发现 融合时，杂交瘤的产生会受到明显影响，在融合后一周左右，即可注意到许多融合细胞突然崩解,小鼠单克隆抗体的制备,支原体不耐热可以在41恒温培养过夜，但这种方法需要知道细胞对热处理的耐受程度 如果具有重要价值的杂交瘤细胞被支原体污染，不仅影响抗体的分泌特性，而且也影响其应用 这时可采取的补救办法为将杂交瘤细胞或骨髓瘤细胞接种于小鼠腹腔内，利用机体的免疫系统来清除细胞表面的支原体,小鼠单克隆抗体的制备,2小鼠免疫 1)抗原： 任何能引起免疫反应的物质都可以作为抗原 抗原在体内引起的免疫反应与机体对抗原的识别有关,小鼠单克隆抗体的制备,抗原： 可溶性抗原 如蛋白质、碳水化合物或核酸 颗粒性抗原 如病毒、细菌和细胞等.一般颗粒性抗原都具有较强的免疫原性,小鼠单克隆抗体的制备,用1g的可溶性蛋白抗原免疫小鼠，即可以产生强烈的免疫反应，但一般在初次免疫中都用10-20g的抗原量.当有足够的抗原时，可以一次注射50g，很少有一次超过200g 颗粒性抗原由于能很快地被吞噬，所以是非常好的免疫原 对于可溶性抗原，可将其固相化在琼脂糖上而成为颗粒性抗原,小鼠单克隆抗体的制备,抗原： 由于重组DNA技术的进展,能很容易地制备出许多蛋白抗原 这些重组蛋白有极好的抗原性，并可大量制备，在单抗的制备中十分有用 这些蛋白可以纯化,以可溶性或固相化的形式进行免疫,小鼠单克隆抗体的制备,抗原： 活细胞也可以作为免疫原以制备针对细胞表面或内部抗原的单抗 在制备抗肿瘤细胞的单克隆抗体时，应尽可能保证肿瘤组织细胞的纯度,小鼠单克隆抗体的制备,抗原： 核酸的抗原性很弱，通常是将其作为半抗原交联到载体蛋白上 碳水化合物分子量超过50，000，大而复杂的会引起中等程度的反应，但重复免疫并不总能产生继发反应，大剂量又会引起耐受，所以注射剂量应加以严格的控制,小鼠单克隆抗体的制备,2)动物选择：一般选择六周龄的雌性Balbc小鼠免疫 因融合所用骨髓瘤细胞来自该品系的小鼠，这样便于所获得的杂交瘤可接种于Balbc小鼠，获得含抗体的腹水。 当检测的免疫动物的血清中出现所需要的抗体时再开始做融合,小鼠单克隆抗体的制备,3)免疫途径： 腹腔 皮下淋巴样器官 静脉 皮内或肌肉内注射 腹腔内注射是最常用的免疫途径.腹腔较其它位置能注射更多的免疫原，而且抗原不会直接进入血液循环系统中,小鼠单克隆抗体的制备,当用活细胞做为抗原进行腹腔注射时，一般不用佐剂 细胞应经PBS等溶液充分洗涤,小鼠单克隆抗体的制备,为了增加抗原的免疫原性： 可将抗原交联到琼脂糖珠或聚丙烯酰胺等一些载体上 蛋白抗原固定化到硝酸纤维膜上，也可使其形成良好的免疫原性 将含有抗原的硝酸纤维膜直接移植到小鼠皮下 或将含有抗原的硝酸纤维膜研碎之后悬浮于PBS，或用二甲基亚砜或丙酮溶解硝酸纤维膜之后再悬浮于PBS或加入完全福氏佐剂乳化后进行腹腔注射,4)载体： 除了白蛋白、钥孔戚血蓝蛋白等，任何一种小的、惰性的、无毒的、能固定抗原并可使抗原缓慢释放的物质都可作为载体 抗原与载体的结合可以是特异性的或非持异性的,小鼠单克隆抗体的制备,载体： 常用的载体可分为珠体和膜两类 珠体对抗原有高度的亲和力而不改变它的结构 珠体能与配基如蛋白A共价交联，而配基与免疫原可有特异的亲和力 连接暴露的氨基、羧基、羟基、或巯基的衍生物珠体可制成珠体-配基- 抗原复合物,小鼠单克隆抗体的制备,载体： 脂质体是由磷脂化合物构成的多层囊泡 各种免疫原可包裹镶嵌在脂质体的多层膜间。由于它在体内能被巨噬细胞迅速吞噬在细胞内被缓慢地消化并逐步释放因而具有较强的增强免疫原性的作用,小鼠单克隆抗体的制备,载体： 硝酸纤维膜、尼龙膜和阳离子尼龙膜也可以分别与亲水性蛋白质、疏水物质，以及寡核苷酸、DNA和RNA结合. 可以直接将抗原滴于膜上亦可在电泳后印迹转移到膜上，取抗原区带用于免疫,3.2.2.2 融合 一次成功的融合取决于：在此之前的免疫及融合后可靠的筛选 一个熟练的，有工作经验的工作人员从取脾脏分离细胞，到融合接种于培养板的整个过程只需要约2小时 而从免疫开始到最后克隆出稳定的杂交瘤，如幸运的话则至少要三个月的时间,小鼠单克隆抗体的制备,1细胞准备 1)小鼠骨髓瘤细胞： 在一些品系小鼠腹腔中注射矿物油可诱生骨髓瘤,小鼠单克隆抗体的制备,一些骨髓瘤之间的衍生关系,小鼠单克隆抗体的制备,小鼠骨髓瘤细胞： 骨髓瘤细胞具有分泌抗体的各种必要的内部机制，也分泌些球蛋白 为避免杂交瘤分泌一种以上的抗体，通常用于融合的骨髓瘤系都是经过筛选而缺失抗体产生及分泌能力. 细胞冻存于液氮,小鼠单克隆抗体的制备,2)骨髓瘤细胞的复苏： 在融合前一周，复苏冻存的细胞 取出冻存管立即放置到37-39温水浴中 待融化后取出细胞，洗涤除去冷冻液 悬浮于含20胎牛血清的DMEM或RPML-l640完全培养液中 细胞计数和检查活力：活力应大于90,小鼠单克隆抗体的制备,骨髓瘤细胞的复苏 细胞培养液可以加入8AG或6-TG，以消除或预防HGPRT缺失的回变 经l-2天的稳定生长之后，细胞即可以进入对数生长期,小鼠单克隆抗体的制备,骨髓瘤细胞的复苏 长期体外培养对产生较高融合率的骨髓瘤细胞亲代细胞并不利，应培养扩增一批细胞，并及时冻存用作下一次融合,3)脾细胞的分离： 一般都用同一种系的细胞融合 常用的骨髓瘤和免疫脾细胞均来自于Balbc小鼠，这样产生的杂交瘤也可在Balb/c小鼠中生长。 与 兔、牛等动物种系B细胞融合产生杂交瘤的可能性很小,小鼠单克隆抗体的制备,脾细胞的分离： 末次免疫后35天，断颈处死小鼠后，消毒 取出脾脏后,注入无血清培养液使其胀大 再用弯曲的注射针头多点刺破脾被膜，用挤压的方法使淋巴细胞从中逸出.,小鼠单克隆抗体的制备,2细胞融合,细胞融合中偶然性和盲目性很显著 提高效率： 富集对抗原具有特异性的B细胞-抗原捕获法(antigen-panning)：先将抗原固相化，与抗原致敏的淋巴细胞相混合。只有表面含有特定抗体的B细胞才能与包被在基质上的抗原发生反应，并使B细胞粘附在基质上洗去不粘附的淋巴细胞，留下的细胞用于融合,小鼠单克隆抗体的制备,将抗原直接交联到骨髓瘤细胞表面上，再与被免疫的淋巴细胞一起孵育 B细胞表面上的抗体与其所对应的包被在骨髓瘤细胞表面的抗原产生特异的结合而使两种细胞相互聚集，在这状态下用PEG或电脉冲处理，就会显著地增加具有特异抗体活性的细胞融合。,小鼠单克隆抗体的制备,1)融合技术： 一般脾细胞与骨髓瘤细胞为510 ：1比例混合。 洗涤细胞 将试管放进含有37-40水。在1.52分钟的时间内逐滴加入预热的50PEG,然后用预温的无血清培养液缓慢地滴入融合混合物，同时轻轻地转动试管。,小鼠单克隆抗体的制备,融合技术： 细胞洗涤，加入完全培养液 细胞可培养在96孔板中，或加入24孔板中,小鼠单克隆抗体的制备,注意 小心将无血清培养液滴加入融合混合细胞时,在离心和高浓度PEG的作用下，由于脱水而皱缩的细胞会由于加入无血清培养液而很快地膨胀，使细胞膜处于一种不稳定的状态中 当渗入的液体太快、太多，细胞可能胀破 当处于高渗下的细胞在缓慢滴加无血清培养液过程逐步与外环境相平衡时，处于不稳定状态下的细胞膜就很容易融合在一起,小鼠单克隆抗体的制备,融合技术： 融合细胞于37、5%二氧化碳培养箱中过夜 从各培养孔中吸出一半培养液加入2浓度的HAT选择培养液，继续培养、定期观察 培养板中应另加入未经融合的骨髓瘤细胞作为对照细胞. 以观察他们对HAT选择培养基的敏感性,小鼠单克隆抗体的制备,融合技术： 当对照组细胞都死亡后，可以将HAT筛选培养换成为HT培养液，以促进杂交瘤的生长.与此同时，需要及时检测杂交瘤生长孔中是否有免疫球蛋白的分泌，是否有特异性抗体存在 对于有持异性分泌的细胞应及时克隆、扩增、冻存或分成几个备份去培养，以防止由于后期污染而丢失,小鼠单克隆抗体的制备,2)融合频率的提高： PEG的毒性 细胞特性 操作过程 等都会影响融合频率,小鼠单克隆抗体的制备,融合频率的提高： Miyahara等人将50ngm1秋水仙胺于融合前处理骨髓瘤细胞，使细胞周期发生一定的变化，有助于提高融合率，杂交瘤细胞克隆数量较对照组增加2627 Siraganian等人则将免疫动物的脾细胞于融合前给予体外致敏,或致敏后再回输到经x线照射的同系受体小鼠中，经这样处理的脾细胞，由于抗原的刺激，使B细胞激活而增殖，在融合中可以明显地增加分泌特异性抗体的杂交瘤的百分比,小鼠单克隆抗体的制备,融合频率的提高： Norwood提出PEG与二甲基亚矾(DMSO)联合用作为融合剂，可提高融合频率,小鼠单克隆抗体的制备,饲养层细胞的加入有助于促进杂交瘤的生长： 成纤维细胞 胸腺脾脏淋巴细胞 健康小鼠腹腔中收集腹腔渗出细胞，主要是巨噬细胞 各种不同的细胞培养上清作为条件培养液,小鼠单克隆抗体的制备,3融合剂 早就观察到在病理状态下，或在体外培养中偶然有少数细胞能“自发融合形成多核巨细胞,小鼠单克隆抗体的制备,1)引起融合的病毒： 用作促融合的病毒约有10多种 最有效的是副粘病毒，其中副流感病毒1号仙台病毒具有良好的诱导细胞融合的效果 1958年冈田报道，在体外实验可用高浓度的仙台病毒使小鼠艾氏腹水癌细胞融合,小鼠单克隆抗体的制备,仙台病毒： 它的促融合机制主要是病毒表面有神经氨酸酶的作用 当病毒位于两个细胞之间病毒突起上的神经氨酸酶即可降解细胞膜上的糖蛋白，使细胞膜局部凝集在病毒颗粒的周围，在高pH、钙离子条件下，局部细胞质膜可以发生融合,小鼠单克隆抗体的制备,HVJ（Hemagglutinating virus of Japan） 乙型副流感病毒.属副粘病毒属，具包膜，其中含有分子量为6-7106的RNA，但不是蛋白质合成的模板.不耐热，几乎可凝集所有种类的红血球，而且有溶血性,2)引起融合的化学试剂： 聚乙二醇可以作为细胞融合剂. Pontecorvo在1975年报道PEG能有效地促进两种单层细胞生长的哺乳类动物细胞融合，其融合率较用仙台病毒高100-300倍,小鼠单克隆抗体的制备,聚乙二醇 Galfer 报道PEG可使小鼠骨髓细胞与大鼠脾细胞融合产生的杂交瘤分泌大鼠抗体 PEG也可使细菌、酵母、植物细胞融合 现在 使细胞融合的促融剂有五、六十种， 作为杂交瘤的促融合剂则主要都是PEG衍生物，或在结构上与PEG有关 它们的共同特点都是有亲水性如聚乙烯醇(po1yvinl alcoho)、聚乙烯吡咯烷酮(po1yvinyl pyrro1idone ,MWl0,000),小鼠单克隆抗体的制备,聚乙二醇 PEG的确切作用并未完全了解,小鼠单克隆抗体的制备,聚乙二醇 PEG的聚合程度对融合的影响：平均分子量为4006000的各种PEG在1060的浓度范围内都能使细胞发生融合 融合率的高低会因分子量和浓度的不同而有差别.分子量为l0004000之间的PEG；在浓度为3050时，可获得最佳的融合效果 可使细胞膜产生不稳定的特性，所以也有一定的毒性,小鼠单克隆抗体的制备,PEG溶于PBS或Hanks液中 如用Eagle s MEM（Minimum Essential Medium）培养液溶解PEG，该培养液含有HEPEsHEPEs进入细胞会产生一定的毒性 用碳酸氢钠溶液调整pH. 用调整pH后的PBS或含葡萄糖的Hanks液稀释PEG会得到很好的重复性,小鼠单克隆抗体的制备,其他影响因素： DMSO的存在可以减少由 于渗透压变化引起的休克 Ca2+可促进细胞的聚集 温度会影响细胞膜脂双层的动力学状态，温度在37或稍高有利于融合，温度过低则会影响融合率 培养液中的蛋白质有稳定膜结构的作用，可以阻挠细胞膜的融合，因此在融合过程中应充分洗涤细胞，使细胞悬液中不含有血清,3)细胞电融合技术： 自70年代末、80年代初出现了电脉冲介导的基因转移(e1ectroporation technique gene transfer)和细胞电融合技术(electrical mediated cell fusion or electro fusion)。,小鼠单克隆抗体的制备,细胞电融合技术： 1987年Zimmermann首先报道了细胞电融合现象 当细胞位于电融合室电介质溶液中，并对融合室施加正弦交变电场,使细胞在电场中沿电力线成串排列 进一步在高幅脉冲电场的瞬时作用下，细胞膜局部区域的双层脂分子受到的外电场压力超过了它们作为有序排列的弹性作用，导致该区域膜结构的紊乱，出现许多穿膜微孔，细胞膜的通透性增加，而相邻细胞的紧密接触部位的微孔就有物质的交流，形成膜桥(membrane bridging)和质桥(cytoplasmir bridging)继发产生细胞融合,细胞电融合技术: 非特异性细胞电融合技术: 是指在进行细胞电融合时，细胞间的相互接触是无选择性的,小鼠单克隆抗体的制备,特异性电融合技术: 利用生物素(biotin)抗生物素（卵白素avidin）抗原抗体桥,使具备特异性抗体的B细胞与骨髓瘤细胞配对接触，然后施加高电压脉冲使其融合,（Avidin Biotin -Peroxidase Complex technique, ABC技术）,小鼠单克隆抗体的制备,百度 ：单克隆抗体制备的一种特异电融合方法研究， 科学通报 1989，16期，胡强华，郑昌学，1256-1259 参考文献 Mathew，MSLo et al，Nature，310(1984)，792一794.,PUBMED: Mathew，MSLo etal，Nature，310(1984)，792一794. The antigen, covalently conjugated to avidin, binds to the surface immunoglobulins on B-cells. This B-cell-antigen-avidin complex binds to biotin covalently attached to the surface of myeloma cells.,4杂交瘤细胞的选择性培养 细胞融合后五种细胞成分的混合: 未融合的脾细胞 未融合的骨髓瘤细胞 脾细胞与脾细胞细胞融合形成的同核体(homokaryons) 骨髓瘤与骨髓瘤形成的同核体 脾细胞与骨髓瘤融合形成的异核休(heterokaryons),小鼠单克隆抗体的制备,杂交瘤细胞的选择性培养 理论上推测大约105个脾细胞中，可能形成1个杂交瘤细胞 在HAT选择培养基中 氨甲喋呤是主要成分 胸腺嘧啶核苷和次黄嘌呤分别作为TK和HGPRT酶的底物 补充胰岛素到选择培养基中，有助于促进杂交瘤的生长,选择培养基的作用原理,细胞类型M 正常 HAT 5BudR 8Aza 正常培养细胞 + + TK缺乏细胞 + + HGPRT缺陷细胞 + + 杂交瘤细胞 + + ,杂交瘤细胞的筛选 替代HAT的筛选方法是利用荧光激活的细胞分离器(FACS)分离融合的细胞 利用罗丹明B或异硫氰酸荧光素(FITC)交联的长链脂肪酸，它们可以可逆地与细胞膜结合,杂交瘤细胞的筛选 方法：FITC荧光素标记的脂质染料与骨髓瘤细胞共孵育，而新分离的脾细胞用罗丹明B荧光染料标记，洗去过多游离的染料，将两种细胞混合，融台.然后用FACS分离同时具有FITC和罗丹明B荧光的融合细胞，并直接克隆到加有饲养细胞的96孔板中,Flow CytoMeter,(三) 融合后的管理,1筛选 在大量杂交瘤克隆出现时，如果用于免疫的不是纯抗原 * 鉴别出克隆生长孔中是否有免疫球蛋白分泌 * 特异性筛选（如果用纯抗原则可直接筛选）,筛选 有三类筛选方法： 抗原捕获抗体 抗体捕获抗原 功能筛选,筛选-抗体捕获法,2克隆 由单个细胞繁殖，扩增而形成性状均一的细胞集落的过程即称为克隆,克隆 融合后在培养板中往往出现多个克隆，它们相互竞争生长 克隆是确保杂交瘤所分泌的抗体具有单克隆性，以及从细胞群中筛选出具有稳定表型的关键一步,克隆 克隆这一过程应该及早进行，避免无关克隆的过度生长 一旦克隆成功，对这一克隆细胞再连续克隆几次，同时应该检测上清中抗体的特性 如果原先有阳性抗体分泌，但克隆过程中未能发现有任何阳性孔，很可能是出于不分泌细胞或分泌无关抗体细胞的过度生长，也可能是由于具有特异分泌的杂文瘤本身分泌表型不稳定的缘故,细胞克隆技术 有限稀释技术(limited dilution technique) 软琼脂克隆技术(soft agar cloning technique),有限稀释技术,是指从具有阳性分泌孔收集杂交瘤细胞，经逐步稀释，使每孔只有一个细胞 一般每45天更换部分培养液，镜检观察，选择只有一个集落的培养孔，并检测上清抗体分泌情况,由于杂交瘤细胞中染色体数较正常情况下多一倍，细胞处于不稳定状态 在细胞分裂时，染色体的分配不平衡，会使杂交瘤细胞在分裂增殖过程中丢失抗体分泌能力 因此克隆一次是不够的，而且也不能把这样选出的阳性培养认为克隆 通常至少要35次才能获得稳定基因型和稳定分泌的细胞,软琼脂克隆技术,用含20血清的完全培养液配制0.5琼脂培养基进行克隆： 将1ml不同数量的细胞混悬液与1m1约42的0.5琼脂液在室温中混匀.然后倾到在培养皿中 37，5CO2，培养一周后，可在显微镜下直接观察和采集克隆,软琼脂克隆技术,转移到96孔或24孔培养板中 再检查培养孔上清抗体分泌情况，反复进行数次软琼脂克隆，直到克隆能从低密度细胞繁殖的板上出现时，才可以认为这是单克隆的细胞群 这种方法的特点是细胞容易在半固体培养基上存活与增殖,软琼脂克隆技术,3. 单克隆抗体的大量制备 体外体内 体外法还可利用发酵罐 进行大量生产,1)体外培养： 在细胞培养瓶中进行杂交瘤细胞的培养，血清用量2.5-5%。 当培养液上清含有高浓度的抗体时，无须纯化即能满足实验需要时，可以用离心法收集上清，使用或分装冻存 也可以用体积更大的旋转培养瓶,2)体内培养生产单克隆抗体： 骨髓瘤和脾细胞均来自Balb/ c小鼠，融合产生的杂交瘤与Balbc小鼠同源，因而将杂交瘤接种于腹腔中可诱导产生大量的腹水，同时分泌大量抗体于腹水中，其抗体浓度可高达3-5mgml,体内培养生产单克隆抗体 将处于对数生长期的杂交瘤经洗涤，注入小鼠腹腔，在注入杂交瘤前一周可腹腔注射降值烷(pristane)0.5m1。 降值烷能有效地抑制小鼠腹腔巨噬细胞和淋巴细胞的免疫功能,体内培养生产单克隆抗体 优点: 在短时间内获得相当数量的单克隆抗体，一般每只小鼠可最少获得1ml腹水，也可多至10m1，但多数在56ml。腹水中抗体可达3-5mg/ml，足可供实验室应用 缺点：由于在腹水中可能混有小鼠本身的抗体，给纯化带来一定的困难，而且在腹腔中制备的抗体应用到临床上，则应仔细检