野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达.doc

野生型MLK3真核表达载体的构建及其表达 作者：金磊，岳军，杜彩萍，侯筱宇【摘要】 目的 构建野生型MLK3真核表达质粒并转染至COS-7细胞中表达。方法 以大鼠海马总RNA为模板,通过RT-PCR分段扩增MLK3的序列，采用酶切、链接的方法先将目的基因克隆至pGEM-T，筛选正确的质粒后，再亚克隆至pcDNA3.1(+)。以脂质体转染法将构建好的重组质粒转染至COS-7细胞，通过免疫印迹鉴定重组质粒的表达。结果 限制性内切酶酶切和测序结果表明，扩增出的野生型MLK3的序列正确。免疫印迹显示，转染的重组质粒在相对分子质量92103处有相应条带出现。结论 成功构建了MLK3的真核表达质粒，重组质粒在COS-7细胞中高效表达。 【关键词】 MLK3;克隆;真核表达Abstract:Objective To construct the recombinant of wild-type MLK3 eukaryotic expression plasmid and to express the recombinant in transfected COS-7.Methods According to the cDNA sequence of MLK3 (GenBank, BC081952), the sequence of wild-type MLK3 fragments were expanded by RT-PCR, using rat hippocampal total RNA as the template. Then these fragments were cloned into the plasmid of pcDNA3.1(+). The recombinant of pcDNA3.1-MLK3 was transfected into COS-7 cells by the mediation of lipofectamine reagents. Immunoblot method was used to determine the expression of MLK3 proteins.Results The target gene was confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing. The immunoblotting analysis indicated that the recombinant of MLK3 was successfully expressed in COS-7 cells.Conclusion The eukaryotic expression plasmids of MLK3 were successfully constructed and the recombinant plasmid were highly expressed in COS-7 cells.Key words： MLK3; clone; eukaryotic expressionMLK3(Mixed lineage kinase 3)是MAPKKK(Mitogen-activated protein kinases kinases kinases)家族的MLKs亚家族成员，是一种丝/苏氨酸蛋白激酶，它通过磷酸化作用激活丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinases， MAPK)通路的丝/苏氨酸蛋白激酶，介导其下游信号通路激活1。MLK3由SH3(Src homology 3)结构域、激酶结构域(Guanaylate kinase，GK)、亮氨酸拉链(leucine zipper)、Cd4c2/Rac(CRIB)相互作用序列、富含脯氨酸结构域 (praline-rich region domain， PRD)组成2。大鼠体内MLK3基因全长2553 bp，蛋白编码序列850个氨基酸。研究表明，MLK3选择性地在中枢神经系统表达，其活化与多种神经退行性疾病，如阿尔茨海默病(Alzheimer disease, AD)、帕金森病(Parkinson disease)以及脑卒中3有关。细胞外多种刺激均可激活MLK3，活化的MLK3激活MAPK信号通路引起细胞凋亡4。本室前期研究结果表明：淀粉样蛋白(A)激活MLK3-MKK7-JNK3信号通路是阿尔茨海默病发病机制中重要因素之一，使用MLK3的抑制剂K252a抑制MLK3的活性对A引起的细胞凋亡具有保护作用5。因此，本实验构建野生型MLK3的真核表达质粒，用于转染体外培养的细胞，为深入研究神经退行性疾病的发病机制奠定基础。1 材料和方法1.1 材料1.1.1 载体、菌株与细胞株 pGEM-T载体、真核表达载体pcDNA3.1(+)、大肠杆菌JM101、细胞株COS-7均为本室保存。1.1.2 试剂 RNAgents Total RNA Isolation System、Access RT-PCR System、Wizard PCR preps DNA Purification System、琼脂糖(Agarose)、低熔点琼脂糖(Agarose， LMP)均购自Promega公司;限制性内切酶EcoRI、Kpn I、Nhe I、和 T4 DNAligase购自New England Biolabs公司;质粒小制备试剂盒、中制备试剂盒、Lipofectamine 2000、LB培养基、LB琼脂均购自Invitrogen公司;1 kb DNA ladder标准相对分子质量DNA购自TAKARA及New England Biolabs公司;兔源MLK3 多克隆抗体购自Cell Singal公司，AP标记的羊抗兔二抗均购自 Sigma公司;兔源actin 多克隆抗体购自Santa cruz公司;引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成;其他常用试剂均为国产分析纯。1.2 方法1.2.1 引物设计与合成 根据Genbank中的大鼠MLK3基因编码序列(BC081952)，分3段分别设计上下游引物P1/P2、P3/P4、P5/P6，其中在总上游引物(P1)的5端引入Nhe 酶切位点，在总下游引物(P6)5端引入EcoR酶切位点(下划线)，引物P3、P4、P5中具有序列自身酶切位点Kpn(斜体加粗)，引物均由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。P1：5-GCTAGCATGGAGCCCTTGAAGAACC-3(总上游)P2：5-CCACACCATAGGCTACCGCAAGACAGT-3P3：5-CTGGGGAGGTACCCTACCGT-3P4：5-GGTACCACGTGGCTTCATCC-3P5：5-GGTACCTAGATTCAGATGAC-3P6：5-GAATTCTCAGGGCCCTGCTTCTGGT-3(总下游)1.2.2 目的基因的扩增 以SD雄性大鼠海马为材料，用RNA抽提试剂盒提取大鼠海马总RNA，以相应上下游引物进行RT-PCR扩增MLK3 cDNA序列片段，分别为MLK3A(1964;964 bp)、MLK3B(9651776;812 bp)、MLK3C(17772553;777 bp)。1.2.3 真核表达载体的构建 1%低熔点琼脂糖凝胶回收目的基因片段，分别连入 pGEM-T载体，筛选阳性重组子测序分析。将测序正确的重组子分别经相应酶切，得到MLK3的序列片段A、B和C，利用MLK3cDNA分子内部存在的2个KpnI酶切位点，将MLK3序列片段按照C、A、B的顺序亚克隆至pcDNA3.1(+)。转化感受态宿主菌JM101，提取的质粒经Nhe I、EcoRI双酶切鉴定重组子，阳性重组子进行序列测定。1.2.4 COS-7细胞的培养与转染 在37、5%CO2的环境下，含10%小牛血清(CS)的高糖DMEM培养基中培养COS-7细胞。将重组质粒和脂质体分别稀释于优化培养基中重组质粒(g)脂质体(l)=12.5混匀，静置5 min后将质粒与脂质体混合，室温放置20 min，在此期间用Hanks液润洗细胞2次，加入优化培养基后置于37、5%CO2恒温培养箱孵育，20 min后将质粒与脂质体的混合物加到含优化培养基的细胞培养瓶中，4 h后更换含10%CS的DMEM培养基。40 h收集细胞。1.2.5 蛋白含量测定 收集转染的COS-7 细胞，超声破碎后，按改良Lowry 法测定蛋白质含量。1.2.6 免疫印迹分析目的蛋白在COS-7细胞中的表达 含相同蛋白量的样品经10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至硝酸纤维素膜上。将膜置封闭液( 3% BSA )中室温孵育4 h，MLK3抗体工作液(12000)中4孵育过夜，洗涤缓冲液(TBST) 洗膜(3 min5次)，加入AP标记的二抗工作液(110000)，室温孵育2 h，TBST 洗膜(3 min5 次)，水洗。使用NBT/BCIP 试剂盒，在新鲜配制的AP显色液中显色，去离子水洗涤终止反应。扫描膜上显色条带。2 结 果2.1 扩增MLK3cDNA片段 以大鼠海马总RNA为模板通过RT-PCR技术扩增出MLK3cDNA局部片段，琼脂糖凝胶电泳鉴定与预期分子量大小相符，分别位于1 kb、0.8 kb、0.7 kb附近(图1)。结果表明：MLK3cDNA片段扩增成功。将目的基因片段分别连入pGEM-T载体，筛选阳性重组子测序分析。2.2 真核表达载体pcDNA3.1(+)-MLK3的构建 将测序鉴定正确的重组子用相应的内切酶切下，再亚克隆至载体pcDNA3.1(+)中，经内切酶消化后，琼脂糖电泳鉴定显示：载体片段与目的基因片段大小与预期一致(图2)，测序结果表明序列正确(图3)。2.3 重组质粒在COS-7细胞中的表达 将重组质粒转染至COS-7细胞，以未经转染和转染pcDNA3.1(+)的COS-7细胞作为阴性对照，以抗MLK3的抗体进行免疫印迹分析。转染pcDNA3.1(+)-MLK3组，在相对分子质量约92 kD处可检测到明显条带(图4)，而阴性对照组没有条带显示。结果表明，重组质粒pcDNA3.1(+)-MLK3可以在COS-7细胞中高效表达。3 讨 论细胞凋亡在调节神经退行性疾病的病理过程中起着十分重要的作用，MAPK信号通路是细胞凋亡的主要信号转导通路之一,可被细胞外多种刺激通过MAPKKK-MAPKK-MAPK所激活。MLK3作为其通路上游激酶，其激活与否对于调节MAPK信号通路的活化具有重要作用。研究表明：MLK3通过激活MKK4/7激活JNK3及P38，调节下游通路，引起细胞凋亡4。但是MLK3在脑病中的作用及其自身功能调控的机制尚未阐明。近年来关于阿尔茨海默病的研究显示淀粉样蛋白(amyloid- peptide， A)可以激活JNKs6，JNKs是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，非活化的JNKs存在于胞质中，被激活后可以磷酸化其底物转位至胞核，启动凋亡基因的转录表达，从而导致神经元死亡。JNK通路的激活在阿尔茨海默病的发病机制中起着重要作用,用MLK3特异性抑制剂CEP-1347抑制JNK通路可以减少神经元的凋亡，对神经退行性疾病有治疗作用7。因此研究A作用神经元后JNK通路激活的机制，可能为阿尔茨海默病的发病机制的研究及治疗提供重要线索。PSD-95是组成兴奋性突触的突触后致密物质中的一个主要蛋白,它属于膜相关的鸟苷酸激酶(membrane-associated guanylate kinases, MAGUK)蛋白家族中的一员,在兴奋性突触的PSD中募集信号蛋白，在介导蛋白质之间的相互作用中发挥着重要作用8-9。PSD-95由N-端3个PDZ结构域、1个SH3结构域和C-端无活性的鸟苷酸激酶结构域组成10。研究表明PSD-95与MLK3可以特异结合形成PSD-95-MLK3复合物，而PSD-95在突触后募集各种信号蛋白并拉近它们与MLK3的空间距离，使信号转导得以顺利进行。有文献报道GluR6-PSD-95-MLK3组成信号转导模块，GluR6使MLK3活化进而激活MAPK信号通路介导细胞凋亡11。因此，PSD-95与MLK3的相互作用可能是调控MLK3活化的重要因素。MLK3可通过苏氨酸277位和丝氨酸281位发生自身磷酸化，又可通过其自身连接发挥自身抑制功能，MLK3的自身结合和它的激活有着密切的关系。MLK3基因序列第52位酪氨酸特异性识别自身469位脯氨酸并与之结合，自身结合后的MLK3失去活性，突变52位酪氨酸或469位的脯氨酸均能使其活性增强2。结构域与其配体的特异结合作为分子接头介导信号转导蛋白的靶向定位，结构域在细胞的信号转导及信号网络的形成中具有重要作用，抑制结构域与配体的结合，可以阻断信号在细胞内的转导，因此有可能作为药物作用的靶点。例如MLK3的富含脯氨酸结构域中具有核心序列“P-X-X-P”，该序列被认为是可以特异结合SH3的基础12，因此MLK3羧基末端的众多核心序列可能在蛋白质相互作用的过程中发挥着重要作用，而目前对于其结构的具体功能还不清楚。本研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.1(+)-MLK3，同时它在哺乳动物细胞COS-7 中也得到了高效表达。这为我们进一步探讨MLK3的调控机制及分子结构与功能奠定了坚实的基础。【参考文献】 1 Ip YT, Davis RJ. 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