落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用

落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用落新妇苷纳米硒的合成及其抗氧化作用摘 要以落新妇苷作为表面修饰剂制备纳米硒溶胶，通过紫外可见分光光度法、傅里叶红外色谱分析法对落新妇苷纳米硒进行表征，并利用高效液相色谱法测定落新妇苷纳米硒中落新妇苷的具体含量；最后通过对羟自由基、氧自由基清除能力及还原力的测定，评价落新妇苷纳米硒溶胶的抗氧化活性。结果显示，与落新妇苷原料相比，落新妇苷纳米硒的紫外特征吸收峰及傅里叶红外光谱中的羟基均发生偏移，证明落新妇苷成功修饰在纳米硒表面；通过高效液相色谱法测得落新妇苷纳米硒中落新妇苷的浓度为0.197 g/mL；抗氧化实验中以落新妇苷、Vc做阳性对照，发现落新妇苷纳米硒溶胶对羟自由基和氧自由基的清除力显著提高，且随着落新妇苷纳米硒浓度的增大而增大，同时落新妇苷纳米硒的还原力也有明显提高。本次实验说明落新妇苷成功修饰在纳米硒材料上后，极大的发挥了落新妇苷的生物学价值，增加了落新妇苷的利用率，为落新妇苷的生物应用提供了新的思路和方法。关键词：落新妇苷纳米硒；高效液相色谱法；紫外可见光光度法；傅里叶红外色谱分析法；抗氧化性IAbstractNami was prepared by using astilbe chinensis as surface modifier, and the selenium was characterized by UV-vis spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy ( FTIR ). the content of astilbe chinensis in Nami was determined by HPLC Finally, the antioxidant activity of astilbe chinensis nanoparticles was evaluated by the determination of hydroxyl free radical, oxygen free radical scavenging and reducing power. The results showed that compared with astilbe chinensis, the ultraviolet characteristic absorption peak of astilbe chinensis and the hydroxyl group in Fourier transform infrared spectrum indicated that astilbe chinensis was successfully modified on the surface of Nami Determination of astilbe chinensis in selenium Nami by high performance liquid chromatography .The concentration of astilbin measured astilbin nano selenium by HPLC was 0.197 mu g/mL; antioxidation experiment in astilbin and Vc as positive control, found that the scavenging capacity of nano selenium sol by astilbin on hydroxyl radical and oxygen free radicals increased significantly, and increases with the drop of astilbin Nanoselenium at the same time, the concentration of the reducing power of astilbin nano selenium can be improved significantly. This experiment shows that astilbin successfully modified in nano selenium material, exerts its biological value of astilbin, increase the utilization rate of astilbin, provides new ideas and methods for the biological application of astilbin.Keywords: astilbin nano selenium; HPLC; ultraviolet visible spectrophotometry; analysis of Fourier transform infrared chromatography; antioxidation14引 言落新妇苷(astilbin，图1)，2(R):3(R)-3,4,5,7-4羟基黄烷酮-3-L-吡喃鼠李糖苷，是一种从传统中药土茯苓(Rhizoma Smilacis Glabrae)中提取的二氢黄酮类化合物，为土茯苓的有效成分之一1。近年研究发现，落新妇苷广泛存在于自然界多种植物中，如巴西芸香（Dimorphandramollis），葡萄，土茯苓，菝葜，黄杞叶，贯叶连翘，草珊瑚等。落新妇苷具有很强的的抗氧化能力，能有效清除超氧阴离子和羟自由基等2，具有抑制辅酶A还原酶，抑制醛糖还原酶，保护肝脏，镇痛，抗水肿等多种生物学活性，并且具有选择性免疫抑制作用，可以作为免疫抑制剂用于免疫相关疾病的治疗。落新妇苷易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有机溶剂，但其水溶性极差，25 时溶解度仅为250 g/mL，根据中国药典属极微溶解样品，这在一定程度上限制了落新妇苷的生物应用。硒能以多种化学形式存在于生物体内,并通过食物链影响到人体，硒是人类必需的微量元素，对人体健康有着重要作用4，但其营养剂量和可耐受的最高剂量之间范围极窄，容易引起硒中毒。相对于无机硒和有机硒，当单质硒以纳米态存在时具有很高的生物活性和安全低毒性。纳米硒具有抗氧化性和抗癌性，可以预防和治疗多种疾5。因此，无毒且高生物活性的纳米硒作为药物、保健品等被广泛的用于生物、医药领域。为获取稳定的纳米材料,其有效方法之一是加入修饰剂。本实验选用落新妇苷为修饰剂制备纳米硒溶胶，既可以克服落新妇苷水溶性差的特点，又能克服无机硒和有机硒毒性大这一缺点。通过评价落新妇苷纳米硒溶胶对羟自由基、氧自由基的清除效果，证明落新妇苷纳米硒有望成为一种高效的、稳定的新型抗氧化材料，为落新妇苷修饰纳米硒这一技术能更好地运用在食品、医疗卫生等领域提供了理论依据，也为水溶性极差的落新妇苷的生物应用开阔了新的前景。图1 落新妇苷分子结构1 试验材料与方法1.1 主要试剂落新妇苷（纯度为80%） 南京景竹生物科技有限公司亚硒酸钠 山东西亚化学工业有限公司维生素C 上海蓝季科技发展有限公司 邻苯三酚 天津市大茂化学试剂厂盐酸 天津市大茂化学试剂厂磷酸二氢钠 天津市大茂化学试剂厂无水乙醇 天津市大茂化学试剂厂双氧水 天津市大茂化学试剂厂过硫酸钾 天津市大茂化学试剂厂绿矾 天津永大化学试剂开发中心水杨酸 天津永大化学试剂开发中心磷酸氢二钠 天津永大化学试剂开发中心Tris-HCl 北京索莱宝科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化学试剂厂铁氰化钾 天津市福晨化学试剂厂三氯化铁 西陇化工股份有限公司1.2 仪器与设备超纯水机 厦门精艺兴业科技有限公司JD1000-2电子天平 沈阳龙腾电子有限公司GPX-9248干燥箱/培养箱（两用） 上海跃进医疗器械有限公司HH-数显恒温搅拌循环水箱 上海圣科仪器设备有限公司CL-3型恒温加热磁力搅拌器 巩义市予华仪器有限责任公司UV-5200PC紫外可见分光光度计 上海美析仪器有限公司YP-2压片机 上海山岳科学仪器有限公司IS5傅里叶红外光谱仪 上海力晶科学仪器有限公司TGL-16GB台式离心机 上海书培实验设备有限公司TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂SB-3200DTDN超声波清洗机 宁波新艺生物科技服份有限公司BDC-215KS电冰箱 青岛海尔股份有限公司1.3 主要试剂配制方式 1.3.1 落新妇苷纳米硒合成所需溶液1）60乙醇溶液：量取60 mL无水乙醇并加入40 mL的超纯水，混匀。2） 25 mM的落新妇苷的乙醇溶液：将纯度为80的落新妇苷粉末准确称取0.35 g，溶于60乙醇中6，定量转入25 mL的容量瓶中，并定容至刻度。3）0.1 M的Na2SeO3溶液：准确称取0.17 g Na2SeO3粉末，溶于超纯水中，转入10 mL容量瓶中，并定容至刻度。1.3.2 清除羟自由基所需溶液1）6 mM的绿矾（FeSO47H2O）溶液：准确称取0.17 g绿矾晶体，用超纯水溶解于烧杯中，转入100 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀。2）6 mM的水杨酸溶液：准确称取0.03 g水杨酸，用无水乙醇溶于烧杯中，转入100 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀。3）6 mM的双氧水：准确称取0.07 g 30H2O2溶液于100 mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，摇匀。1.3.3 还原力测定所需溶液1）磷酸缓冲液（0.2 mol/mL, pH=6.6）：甲液-M（磷酸氢二钠十二结合水）：称取7.16 g溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100mL的容量瓶中； 乙液-M（磷酸二氢钠）：称取2.5 g溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中,取40 mL甲液，60 mL乙液混合，即配制成目标液。2）铁氯化钾溶液（1%）：称取1 g铁氰化钾溶于烧杯中，加蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。3）三氯乙酸溶液（10）：称取10 g三氯乙酸溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。4）三氯化铁溶液（0.1%）：称取0.1 g的三氯化铁溶于烧杯中，用蒸馏水定容于100 mL的容量瓶中。1.3.4 清除超氧阴离子所需溶液1）Tris-Hcl溶液（50 mM，pH=8.2）：称取0.61 g样品于烧杯中，加入80 mL去离子水，加浓盐酸调pH为8.2，再移入100 mL容量瓶中定容。2) 邻苯三酚溶液（25 mM）：准确称取邻苯三酚0.32 g，用超纯水溶解于烧杯中，转入100 mL容量瓶，定容至刻度，摇匀。3) HCl溶液（10 mM）：准确吸取0.08 mL浓度为12 mol/L HCl于100 mL容量瓶中，并用超纯水定容至刻度，摇匀。1.3.5 标准溶液1) 落新妇苷标准溶液：准确称取落新妇苷标准品1 mg溶于1 mL 60%乙醇中，摇匀。2) Vc溶液：准确称取0.02 g Vc，用超纯水溶解于烧杯中，转入100 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，摇匀，低温避光保存。2 试验方法2.1 落新妇苷的纳米合成取配制好的0.1 M Na2SeO3溶液0.5 mL，25 mM落新妇苷乙醇溶液8 mL，按顺序加入小烧杯中，以450 r/min转速在室温条件下用CL-3型恒温加热磁力搅拌器搅30 min,待溶液由无色变成稳定的砖红色胶体后，将溶胶移入离心管，在6000 r/min的条件下离心10 min，取出上清液，将沉淀用60%乙醇洗涤并重新分散得到稳定的纳米硒溶胶。2.1.1 高效液相色谱法对落新妇苷纳米硒的定性和定量分析色谱条件：色谱柱：C18 Agilent Eclipse Plus；流动相：乙腈（A）-0.1%乙腈水溶液（B）；流速：1.0 mL/min；检测波长：290 nm；柱温：40 ；进样量：10 L将1 mL落新妇苷标准溶液及其纳米硒溶胶用1 mL射器分别注入进样瓶中，用0.22 m的滤头过滤，然后放入贮液器准备进样。当待测样品从进样器注入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，然后进入检测器，由记录仪将检测器送出的信号记录下来得到色谱图。2.1.2 紫外可见分光光度法鉴定落新妇苷纳米硒的合成将上述重新分散后的落新妇苷纳米硒溶胶，用60%的乙醇溶液稀释成样液，采用紫外可见光光度法在200-700 nm的波长范围内对样液进行波谱扫描，以60%乙醇溶液做基准线校正液，将落新妇苷醇溶液与落新妇苷纳米硒样液的紫外光谱进行对比。2.1.3 傅里叶红外光谱分析法鉴定落新妇苷纳米硒的合成将上述重新分散后的落新妇苷纳米硒溶胶再次离心10 min后，将所得的沉淀放入干燥箱干燥，以待备用：然后取1-2 mg溴化钾晶体研细均匀，置于干燥的模具中，压成透明薄片，用红外色谱仪扫描以扣除背景影响；接着将落新妇苷原料和干燥后的落新妇苷纳米硒分别与溴化钾研细混匀(颗粒径小于2 m)，压成透明薄片，在4000-400 cm-1范围内进行红外波谱扫描，记录红外谱图。2.2 抗氧化试验2.2.1 清除羟自由基利用H2O2与FeSO4混合产生OH，在体系内加入水杨酸能有效地捕捉OH并产生有色物质，该物质在波长510 nm处有最大吸收。参照文献7的方法，在单位体积下，将落新妇苷纳米硒溶胶配制成浓度为0、10、20、30、40、50 g/mL的样液于6支试管中，依次加入 1mL 6mM FeSO4溶液和6 mM H2O2，静置10 min后加入1 mL水杨酸，混匀静置30 min，然后在510 nm处测吸光度值Ai；其他条件不变，以1 mL超纯水代替水杨酸测吸光度Aj；空白对照组以1 mL超纯水代替样品溶液测吸光度A0。以落新妇苷原料、Vc为阳性对照，计算羟自由基的清除率E：羟自由基清除率（%）E=（A0-Ai+Aj）/A0100式中：A0为空白对照组的平均吸光度值，Ai为试样的平均吸光度值，Aj为超纯水代替水杨酸组的平均吸光度值。以样品浓度为横坐标，羟自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，将三者进行比较，得出他们之间的关系。2.2.2 清除超氧阴离子采用邻苯三酚自氧化法测定,邻苯三酚在碱性条件下，能迅速自氧化产生O2-，在320 nm处有光吸收，加入一定量的自由基消除剂可对O2-产生不同的抑制作用,进而导致吸光值的变化。参照文献8的方法，将落新妇苷纳米硒溶胶配制成浓度为0、2、4、6、8、10 g/mL的样液，备用；取12支相同规格的试管，依次加入2.25 mL的TrisHCl（50 mmol/L pH=8.2）溶液和1 mL的超纯水，在25 下水浴20 min，之后依次加入1 mL上述配好的待测样品，再加入0.25 mL 25 mmol/L的邻苯三酚溶液，混合后在25 oC水浴中反应6 min，6 min后加入0.5 mL HCl（10 mmol/L）溶液终止反应。在320 nm处测其吸光度值Ai，在其他处理不变的情况下，以0.25 mL超纯水代替邻苯三酚测吸光度Aj，以1 mL超纯水代替样品溶液测吸光度A0。以落新妇苷、Vc为阳性对照。超氧阴离子自由基的清除率S的计算公式为： 超氧阴离子自由基清除率（%）S=（A0-Ai+Aj）/A0100式中：A0为空白对照的平均吸光度值，Ai为试样的平均吸光度值，Aj为超纯水代替邻苯三酚组的平均吸光度值。以样品浓度为横坐标，超氧阴离子自由基清除率为纵坐标建立标准曲线，得出他们之间的关系。2.3 还原力的测定采用普鲁士兰法来评价落新妇苷纳米硒溶液的还原力。参照文献9的方法。在单位体积下，将落新妇苷纳米硒溶液配制成浓度为0、10、20、30、40、50 g/mL的样液置于试管中，依次加入0.2 mol/L磷酸盐缓冲液1.25 mL和1%的铁氰化钾溶液1.25 mL，混匀后于50 水浴中保温20 min后，快速冷却，再加入1.0 mL 10%三氯乙酸，以3000 r/min的转速离心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.1%的三氯化铁溶液0.25 mL，再加1.75 mL超纯水，充分混匀，静置10 min，在700 nm处测定其吸光值Ai，以落新妇苷、Vc作阳性对照。3 结果与分析3.1 落新妇苷的纳米合成3.1.1 高效液相色谱法对落新妇苷纳米硒的定性和定量分析在一定的色谱操作条件下，每种物质有一定的保留值，而被测物质的质量mi与检测产生的信号色谱峰的面积Ai或峰高hi成正比，即：mi=iAi或mi=ihi式中，i、i为比例常数，分别成为峰面积和峰高绝对校正因子。图2.1 落新妇苷标准溶液色谱图图2.2 落新妇苷纳米硒的色谱图如图2.1与2.2所示，落新妇苷标准溶液的峰面积A0=1.11275104 mAu*s，保留时间T0=17.845 min，落新妇苷纳米硒的峰面积A=0.0438104mAu*s，T=17.810min。将落新妇苷纳米硒的色谱图与落新妇苷标准溶液的进行对比，发现其保留时间偏差很小，在同一操作条件下，可将其视为同种物质，由此证明落新妇苷成功修饰在纳米硒上，其浓度为0.197 g/mL。3.1.2 紫外可见分光光度法鉴定落新妇苷纳米硒的合成将落新妇苷纳米硒样液与落新妇苷醇溶液的紫外光谱进行对比，如图3所示。落新妇苷是一种二氢黄酮醇苷，在291、325 nm处各有一吸收峰10。在其他条件相同的情况下，落新妇苷修饰纳米硒后在291 nm处的特征吸收峰发生位移，往长波方向移动2 nm，即吸收峰红移。由此可以判断，落新妇苷成功修饰在纳米硒表面。图3 落新妇苷纳米硒与落新妇苷的紫外光谱图3.1.3 傅里叶红外光谱分析法鉴定落新妇苷纳米硒的合成将落新妇苷纳米硒样液与落新妇苷醇溶液的红外光谱进行对比，如图4所示。落新妇苷具有酚羟基、苯环、羰基的特征吸收峰。落新妇苷原料羟基的峰出现3447.96cm-1处，合成后的落新妇苷纳米硒羟基的峰出现在3396.59cm-1处，说明合成后的羟基发生了蓝移，羟基参与了合成，落新妇苷成功修饰在纳米硒微表面。图4 落新妇苷纳米硒样液与落新妇苷醇溶液的红外光谱3.2 抗氧化试验3.2.1 羟自由基清除力的测定落新妇苷纳米硒溶液、落新妇苷醇溶液、Vc溶液对羟自由基的清除作用如图5所示。从图5知，随着浓度的增大，这三者的清除效果越大，在浓度为50 g/mL时落新妇苷纳米硒溶液、落新妇苷醇溶液、Vc溶液对羟基的清除率分别为98.09%、66.69%、47.97%，清除能力为落新妇苷纳米硒溶液落新妇苷醇溶液Vc,说明落新妇苷成功修饰在纳米硒上后对羟自由基的清除力显著提高。图5 落新妇苷纳米硒、落新妇苷、Vc对羟自由基的清除作用图3.2.2 超氧阴离子清除能力的测定落新妇苷纳米硒溶液、落新妇苷醇溶液、Vc对超氧阴离子的清除作用如图6所示。这三种物质对超氧阴离子的清除率随浓度的增大而增大，清除率强弱为：落新妇苷纳米硒溶液落新妇苷醇溶液Vc。其中，Vc的清除率随浓度的增加变化最小，落新妇苷原料变化最大。图6 落新妇苷纳米硒、落新妇苷、Vc对超氧阴离子的清除作用图3.3 还原力的测定落新妇苷纳米硒溶液、落新妇苷醇溶液、Vc溶液还原力比较如图7所示。这三种物质的还原力随着浓度的增大而增大，还原力强弱为：落新妇苷纳米硒Vc落新妇苷醇溶液。其中，落新妇苷纳米硒溶液的呈现出显著的还原力，而落新妇苷原料的还原力最弱，且随浓度的增大还原力变化最小。图7 落新妇苷纳米硒、落新妇苷、Vc的还原力图4 结论通过对落新妇苷纳米硒样品溶液颜色变化的观察以及运用表征试验对落新妇苷纳米硒进行表征,各个特征峰的偏移说明我们成功的制备出了落新妇苷纳米硒。落新妇苷修饰在纳米硒的表面，使得所制备的落新妇苷纳米硒在水中具有良好的稳定的分散体系。抗氧化实验表明落新妇苷修饰后的纳米硒对于清除羟自由基、超氧阴离子及还原力都有显著提高,落新妇苷纳米硒具有良好的抗氧化效果。这种方法的操作过程简便、所选用的试剂无毒、反应条件温和，所制备落新妇苷纳米硒作为新型抗氧化剂具有良好的应用前景。参考文献1 张