何首乌叶斑病的病原鉴定

学科代码： 070401 学 号： 2009407075 本科毕业论文（设计）题目：何首乌叶斑病的病原鉴定学 院： 环境与生命科学学院 专 业： 生物科学 班 级： 2009级 学生姓名： 吴隆滔 指导教师： 张国辉 2013年3月07日凯里学院本科毕业论文目录目录I摘要II关键词IIAbstractIIKeywordsII1 前言12 材料与方法12.1材料的采集12.2病原菌的分离、鉴定12 结果与分析22.1 病症的观察与描述22.2 病原菌的培养性状及形态32.3 显微镜的镜检及病原鉴定33 讨论与结论4参考文献6致谢7何首乌叶斑病的病原鉴定吴隆滔（凯里学院环境与生命科学学院，）摘要：笔者于2012年4月至5月，对贵州省三穗县的野生何首乌(Polygonum multiflorum Thunb. )叶斑病的标本采集和研究。通过组织分离法从叶片中分离得到病原菌，并在PSA培养基上培养，经观察菌落的特征和显微观察法观察菌丝形态特征，鉴定出引起何首乌的叶斑病的病原菌是丝核菌（Rhizoctonia）。并针对当前研究的现状，对今后的研究方向提出了展望。关键词：何首乌；叶斑病；病原菌鉴定；丝核菌 Identification of the leaf spot disease on Polygonum multiflorum Wu Longtao(Department of Environment & Biological Science, Kaili College, 556011)Abstract: Though collecting and researching the specimen of leaf spot in wild Polygonum multiflorum of Sansui County in Guizhou Province from April to May in 2012.The pathogen was obtained by tissue isolation,and cultured on PSA medium.Based on observing the characteristics of colony .The microscopic examination method showed that,the disease was caused by Rhizoctonia.Considered the status quot of the current study,advice and suggestions were provided and future research orientation was prospectedKeywords: Polygonum multiflorum；leaf spot；identification of pathogen；RhizoctoniaII1 前言何首乌(Polygonum multiflorum Thunb. )为蓼科(Polygonaceae)蓼属(Polygonum L.)多年生草本植物。种类繁多且多可入药1。何首乌为常用的中药主要是块根入药，分为生首乌和制首乌。生首乌有润肠、解毒等功效，制首乌有补肾、精血、壮骨之用，更能乌须发之效。其实，何首乌全株都可入药，中药成为夜交藤2。主产河南、广东、贵州、江苏、湖北、四川。何首乌是贵州主产的中药之一，全省范围类都分布有野生的3。作为国内中药产地之一的贵州省，长期与来都是多为野生的，但随着经济与社会的发张，贵州组不扩大了重要的栽培，然而影响中药质量的最大文题就是中药的病害4。近几年贵州在黔东南州凯里、施秉、雷山等县、市已建立了何首乌栽培基地，而叶斑病严重的影响到何首乌的产量和品质5。何首乌的叶斑病多在夏季多雨季节发病，受害后叶片出现枯死病斑，病斑破裂脱落成孔洞，后期病斑上有小黑点，最后植株死亡。也有在初发病时，叶片产生黄白色病斑，后变褐，中心部分有时穿孔，病斑多使整个叶片变褐枯死，故也有人称为褐斑病6。因此本文对何首乌叶斑病进行初步的病害分析及其鉴定，为何首乌的病虫害防治提供一定的依据。2 材料与方法2.1材料的采集2.1.1 标本采集2012年4月至5月在贵州黔东南三穗县滚马乡大山沟采集野生有病斑的何首乌叶片标本，用于实验分离和鉴定。2.1.2症状特点观察通过观察病害叶片的形态、病害部位的特征及病斑的颜色状况和病斑的大小等相关特征，并详细记录与拍照7。2.2病原菌的分离、鉴定2.2.1病原菌的分离与培养观察2.2.1.1相关试剂与设备7-875%乙醇、0.1%升汞、链霉素、蒸馏水；恒温培养箱、电磁炉、高压蒸汽灭菌锅、微波炉、冰箱、解剖器等。PSA培养基：称取200 g马铃薯，洗净、去皮、切碎，加水1000 ml煮沸30 min，纱布过滤；在过滤后的溶液里加入1020 g蔗糖和1720 g琼脂，充分溶解后趁热纱布过滤；将溶液分装到试管和三角瓶中；121 灭菌20 min，冷却后备用。2.2.1.2病原菌的分离利用组织分离法对何首乌病态叶片进行病原菌的分离9-10。首先切取病健交界处的病组织2-4 mm的小块，先置于70%乙醇中浸2 s，接着把病组织移入0.1%的升汞溶液中浸2min，然后再把病组织转移到无菌水中漂洗3遍。 2.2.1.3病原菌的培养9-10将分离的组织接种到PSA培养基上培养，每个培养皿放置3块，将培养皿倒置，在30的电热恒温箱里培养3-5 d后， 挑取组织周围的菌丝接种到加有链霉素的培养基平板上继续培养5-7 d。2.2.1.4病原菌的形态观察病原菌接种培养后，每隔1 d进行观察一次，并详细记录病原菌的生长状况，形态变化，拍照备用。2.2.2病原菌鉴定2.2.2.1相关试剂与设备蒸馏水，酒精灯，解剖器，显微镜等。2.2.2.2病原菌的鉴定7-8对何首乌病原菌的鉴定采用传统的光学显微镜观察法。用灭菌后的移植针挑取少许菌丝，放在加有浮载剂（蒸馏水）的载玻片上，盖上盖玻片，置于显微镜下观察。观察菌丝的颜色，菌丝是否有隔和分支；是否有垂直的菌丝，观察分生孢子的颜色，形态结构。记录和拍照。2 结果与分析2.1 病症的观察与描述何首乌发病主要部位是叶片，受害后叶片出现枯死病斑，病斑破裂脱落成空洞，后期病斑上出现棕红色的小斑点，最后植株枯死。初发病时，叶片产生黑色病斑，后变褐，中心部分有时转空，病斑多时整个叶片变褐枯死 。病斑大小0.1-0.8 cm0.3-1.1 cm，有明显的病健交界 ，发病严重时整片叶子都会烂掉然后脱落（图1）。图1 何首乌叶斑病病症图 2.2 病原菌的培养性状及形态在PSA培养基上，病原菌生长较快，菌落成辐射状生长，圆形边缘整齐。菌丝初为白色，后渐变成灰色。菌落初期为乳白色，成絮状或绒状（图2）。3-4天后，菌落中央开始出现灰色并逐步变黑。菌落表面平滑，干燥。菌落四周培养基无明显的变化，但其菌丝中央的培养基变黑11-12。AB图2 何首乌叶斑病病原菌的菌落图A：正面观 B：背面观2.3 显微镜的镜检及病原鉴定丝核菌有自己特殊的特征，无孢子；大多的菌核内外结构均一；多寄生于活植物的根、叶部位；菌丝分支处溢缩；分支菌丝有隔膜且具桶孔；呈直角或锐角分支等13。丝核菌根据细胞核的数目有单核丝核菌、双核丝核菌和多核丝核菌12。显微镜下（1040）观察到菌丝多分枝且大多数呈直角分支，菌丝分支发源处有明显溢缩，菌丝有隔，无孢子。菌丝淡黄色（图3）。结果表明。引起何首乌叶斑病病症的病原菌为丝核菌（ Rhizoctonia）。丝核菌属半知菌亚门无孢目丝核菌属。 图5何首乌叶斑病病原菌的菌丝（1040） 3 讨论与结论叶斑病是危害植物的严重病症之一，尤其对中药材的影响更为突出。直接影响到何首乌的质量和成活率，给中药种植基地造成了巨大的经济损失。贵州是国内的主要中药产区之一，何首乌的种植主要集中再黔东南州的县市3,贵州省黔东南州的夏天天气闷热多雨，降雨日数较多，相对湿度较大14，因此适宜微生物的生长，特别容易引起何首乌叶斑病的发生。叶斑病主要是由于真菌病原物引起的，不同植物的叶斑病病原物有所不同，甘草(Glycyrrhiza uralensis)叶斑病的病原菌为豆链格孢( Alternaria azukiae)15，香蕉(Musa paradisiaca)叶斑病病原菌主要有三种：香蕉生球腔菌（Mycosphaerella.musicola J.L.Mulder.）、斐济球腔菌（M.fijiensis Morelet.）和芭蕉球腔菌（M.Eumusae）16，z栀子（Gardenia jasminoides）叶斑病的病原菌属于拟盘多毛孢属( Pestalotiopsis Steyaert) 真菌17。同种植物有可能又不同种的真菌引起，香蕉就有三种。2007年桑维钧等人对何首乌叶斑病的调查研究显示何首乌叶斑病的病原菌为掌状拟盘多毛孢Pestalotiopsis palmarum (Cke.) Stey.5，本次调查实验得出引起何首乌叶斑病的病原菌为丝核菌（ Rhizoctonia）。何首乌的叶斑病的研究目前还处于起步阶段，何首乌的研究多集中于药理与栽培方面18-19，对于叶斑病的防治没有明确的研究，都是农药防治。叶斑病的病原菌鉴定和防治的正式仅有桑维钧等的研究报告，但未继续研究和大量研究，故本次试验可以为以后的实验提供一定的参考。今后研究的重点应包含以下几个方面：（1）全面收集黔东南州内的何首乌叶斑病菌株，了解不同菌株的分布；（2）系统鉴定黔东南州内的何首乌叶斑病的病原菌；（3）进一步研究何首乌病原菌的致病特性；（4）加强对何首乌叶斑病的防治研究，提出合理的抑制病原微生物的综合方法；（5）大力培育无病的何首乌植株，大力推广防治技术，生产出高品质的何首乌，满足市场需求。参考文献 1 谭凯丽，廖海民等.何首乌药理作用研究进展J.山地农业生物学报，2010，29（1）：72-75.2 肖培根.新编中药志(第1卷)M.北京: 化学工业出版社, 2002.3 龙光全.何首乌主要病虫害的发生规律与防治J.植物医生，2011,24（6）:24-25.4 黄剑，张智广，黄荣茂，等.贵州省重点药用植物病害调查研究J.农药，2002,41（10）:6-9.5 桑维钧，李小霞，吴文辉，等.防治何首乌叶斑病的室内药剂筛选J.农药，2007,46（1）:60-61.6 卢隆杰，卢苏.何首乌病虫害防治技术J.安徽:植物医生,2008,21(2):21-22.7 张国辉，张文华，刘冬莲，等. 八月瓜炭疽病的病原菌鉴定及病害分析J.中国农学通报，2011,27(13):277-288.8 张国辉，蔡凌云，张文华，等.大血藤炭疽病的病原鉴定及病害分析J.中国农学通报，2012，28(15):207-210.9 许文耀.普通植物病理学实验指导M.北京:科学出版社,2006:69-73.10 方中达.植病研究方法M.北京:农业出版社,1979.11张敬泽，商鸿生，等.草地早熟禾和高羊茅病原丝核菌的物种鉴定J.草业学报，2003,12（4）:31-34.12 任飞娟，常聚普，贺伟，等.河南省苹果新病害丝核菌叶枯病病原鉴定J.中国果树，2011（4）:38-41.13 李华荣.丝核菌的菌丝融合群及其遗传多样性研究的新进展J.菌物系统，1999,18（1）:100-107.14 王孜昌,王宏艳.贵州省气候特点与植被分布规律简介J.贵州林业科技,2002,30(4):46-49.15 阎合，徐秉良，梁巧兰，等.甘草叶斑病的发生与病原菌鉴定J.2009,35(3):111- 11416 王国芬，黄俊生，谢艺贤，等.香蕉叶斑病的研究进展J.2006,23(1):9