绿原酸纳米脂质体制备与抑菌性分析

62 2014, Vol.35, No.20 食品科学 工艺技术 绿原酸纳米脂质体制备与抑菌性分析 徐贤柱，魏 允，饶 华，王曼莹* （1.江西亚热带植物资源保护与利用重点实验室，江西 南昌 330022；2.江西师范大学生命科学学院，江西 南昌 330022） 摘 要：目的：研究绿原酸纳米脂质体制备及其抑菌性。方法：采用薄膜超声法制备绿原酸纳米脂质体，并用扫描 电镜和粒度仪分析测定其形貌及粒径，考察膜材比、药脂比及超声时间对包封率的影响，最后对其体外稳定性和抑 菌能力进行评价。结果：胆固醇与卵磷脂质量比1 8、绿原酸与膜材质量比1 10、超声时间15 min所制备的绿原酸 纳米脂质体呈椭圆形，形态规整，粒径在110 nm左右，分散性良好，包封率和载药量最高分别达到87.5%和36%； 紫外测试表明绿原酸被成功包覆在脂质体中；体外缓释实验表明，在24 h和14 d中绿原酸纳米脂质体均释放稳定； 在抑菌实验中，绿原酸纳米脂质体与绿原酸和四环素相比具有更持久的抑菌能力。结论：采用薄膜超声法制备的绿 原酸纳米脂质体具有很好的形貌和分散性能，也具有很好持续抑菌能力。 关键词：绿原酸；脂质体；制备；抑菌 Preparation and Antibacterial Effect of Chlorogenic Acid Nanoliposome XU Xian-zhu, WEI Yun, RAO Hua, WANG Man-ying* (1. Jiangxi Provincial Key Laboratory of Protection and Utilization of Subtropical Plant Resources, Nanchang 330022, China; 2. College of Life Sciences, Jiangxi Normal University, Nanchang 330022, China) Abstract: Objective: To investigate the preparation and antibacterial effect of chlorogenic acid (CA) nanoliposome. Methods: CA nanoliposomes were prepared by fi lm-ultrasonic dispersion method and the products were characterized with scanning electron microscopy (SEM) and particle size analyzer. The effects of cholesterol/lecithin mass ratio, CA/film (lecithin + cholesterol) mass ratio and ultrasonication time on the encapsulation effi ciency of liposomes were investigated. Finally, the stability and the bacteriostasis ability of the prepared liposomes were evaluated. Results: Oval-shaped liposomes were prepared by ultrasonication for 15 min at a cholesterol/lecithin mass ratio of 1:8 and a CA/fi lm ratio of 1:10, which showed regular morphology, a particle size of approximately 110 nm in diameter, good dispersity, an encapsulation effi ciency of up to 87.5%, and a drug loading of up to 36%. UV spectroscopy showed that CA was encapsulated successfully into nanoliposomes. In vitro test showed that the drug could be sustained-released from liposomes without a burst release and with stability for 24 h and 14 days. Comparing with CA and tetracycline, the nanoliposomes had better bacteriostasis ability. Conclusion: CA nanoliposomes prepared by fi lm-ultrasonic dispersion method have a regular shape, good dispersion ability and persistent antibacterial ability. Key words: chlorogenic acid; nanoliposomes; preparation; antibacterial activity 中图分类号：TS201.2 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2014）20-0062-05 doi:10.7506/spkx1002-6630-201420013 收稿日期：2014-01-20 基金项目：江西省教育厅青年科学基金项目（GJJ13216）；江西省科技支撑计划项目（20142BBF0008）； 江西亚热带植物资源保护与利用重点实验室开放基金项目（YRD201206） 作者简介：徐贤柱（1981），男，实验师，硕士，主要从事植物活性成分提取及其药理与剂型研究。E-mail：9901189163.com *通信作者：王曼莹（1944），女，教授，学士，主要从事生物化学与分子生物学研究。E-mail： 绿原酸（chlorogenic acid，CA）是从杜仲、金银花 和蒲公英等植物中提取出来的一种活性物质，具有较多的 生物活性，如抗菌、抗病毒、抗肿瘤、降血压、清除自由 基等，是保健品、食品、药品、化妆品等的重要原料1-6。 由于绿原酸难溶于水，在肠道中吸收差，所以应用过程 中受到很大的阻碍。绿原酸是由咖啡酸与奎尼酸形成的 酯，其分子结构中有酯键、不饱和双键及多元酚3 个不稳 定部分，在体内易被蛋白质灭活而失去活性。 研究表明，绿原酸作为一种抗氧化剂，可以有效保 护皮肤免受紫外线的伤害，绿原酸-磷脂复合物可以显著 延长保护时间达4 h以上7。 脂质体包裹的药物可以有效地提高其稳定性和在体 工艺技术 食品科学 2014, Vol.35, No.20 63 内的吸收。脂质体8-10是由胆固醇和卵磷脂形成的一种微型 腔室，具有生物相溶性好、无毒、无免疫原性等优点，修饰 后，能增强靶向性，提高药物的疗效，更重要的是它还具 有缓释的功能，对脂溶性药物包封性好，改变传统给药途 径。关于绿原酸脂质体制备的研究还不多见，本研究采用薄 膜分散超声方法制备CA纳米脂质体，考察膜材比（m（胆 固醇）m（卵磷脂）、药脂比（m（CA）m（膜 材）、超声时间对其包封率的影响，并对CA纳米脂质体 在体外的稳定性和抑菌效果进行评价，对其形貌和粒径进行 表征。 1 材料与方法 1.1 材料与试剂 绿原酸（色谱纯，纯度99%） 湖南远航生物科 技有限公司；大豆卵磷脂 上海蓝季科技有限公司；胆 固醇 上海伯奥生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌、 大肠杆菌 江西师范大学生命学院微生物实验室；四环 素 上海生工生物工程有限公司；无水乙醇、乙醚、氯 仿、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠均为市售分析纯。 1.2 仪器与设备 DelsaNano S粒度仪 美国贝克曼公司；S-3400N 扫描电子显微镜、U-331紫外-可见光分光光度计 日本 Hitachi公司；UV-vis8453紫外吸收光谱仪 美国安捷伦 公司；旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂；超声波清 洗器 昆山超声仪器有限公司。 1.3 方法 1.3.1 CA纳米脂质体的制备 采用薄膜分散超声法11，按比例精确称取大豆卵 磷脂、胆固醇，加入15 mL氯仿溶解，120 r/min转速、 35 旋转减压蒸发除去氯仿。加入乙醇溶解的CA溶液， 120 r/min转速、50 旋转蒸发除去乙醇。加入pH 7.2的 磷酸缓冲液10 mL和适量玻璃珠，120 r/min转速、37 旋转，待溶液浑浊，超声，得CA纳米脂质体。 1.3.2 CA的紫外检测 采用紫外-可见分光光度法在327 nm波长处测定12。 1.3.3 包封率和载药量的测定13-14 称取100 mg CA溶于乙醇，按上述方法制备CA纳米 脂质体。5 000 r/min转速离心，去上清。用乙醇重悬脂质 体，5 000 r/min转速离心，去上清，重复两次洗涤去除 未包封的CA。加入质量分数1%聚乙二醇单辛基苯基醚 （Triton）溶液0.5 mL使脂质体破损溶出CA，并用PBS液 定容，采用紫外-可见光分光光度计测定脂质体中CA的质 量，膜材质量为卵磷脂与胆固醇质量总和。包封率及载 药量的计算如式（1）、（2）所示。 P1 P2 ?100?/%? （1） P2P3 P2 ?100?/%? （2） 式中：P1为原料CA质量/mg；P2为脂质体中CA质量/mg； P3为膜材质量/mg。 1.3.4 不同条件对包封率及载药量的影响 固定药脂比1 10、超声时间15min，考察不同膜材 比（1 2、1 4、1 6、1 8、1 10、1 12）对CA纳米脂 质体包封率及载药量的影响；固定膜材比1 8、超声时 间15 min，考察不同药脂比（12、14、16、18、 1 10、1 12）对CA纳米脂质体包封率及载药量的影响； 固定膜材比18、药脂比为110，考察不同超声时间 （0、5、10、15、20、25 min）对CA纳米脂质体包封率 及载药量的影响。 1.3.5 脂质体形貌及粒径测定15 CA纳米脂质体分散在无水乙醇中，毛细管取少量 滴于硅片表面并通过导电胶粘贴在载物台上，乙醇挥发 干后喷金，最后用扫描电子显微镜观察脂质体的形貌； 在不同条件下分别制备5 个样本，用激光散射粒径仪测 定脂质体的平均粒径和Zeta电位，折射指数1.33、波长 633 nm、入射与散射光束夹角为90。 1.3.6 脂质体稳定性测定16 将CA纳米脂质体分散在生理盐水中，一份在37 条 件下200 r/min转速搅拌，分别在0.5、1、2、4、8、12、 24 h测定其体外释放率；另一份在4 存放，分别在第 2、4、6、8、10、12、14 d测定体外释放率。 1.3.7 抑菌实验17-18 将金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分别接入装培养基斜 面上，37 培养24 h，使菌种活化，再将活化好的菌接 种到平板中，37 培养24 h。用生理盐水将细菌从平板 洗脱制成菌悬液，菌落数调至1108 CFU/ mL。 用打孔器将滤纸打成6 mm的小片并灭菌，将 0.2 mL 1 mg/mL的CA溶液、CA纳米脂质体、空白脂质 体、四环素分别滴加于滤纸片上，控制CA纳米脂质体中 的CA含量为0.2 mg。 分别向培养基表面涂布0.2 mL菌悬液，再将滴加CA 溶液、CA纳米脂质体、空白脂质体的滤纸片贴于培养基 表面，每个皿贴5 片，用四环素纸片做对照，37 培养 24、36、48、60、72、84、96 h后测定抑菌圈直径。 2 结果与分析 2.1 不同因素对CA纳米脂质体包封率的影响 包封率和膜材比存在较大的关系，卵磷脂在成膜过程 中需要胆固醇调节其通透性，当胆固醇含量过高时，会引 起卵磷脂成膜不稳定，从而降低包封率；当胆固醇含量过 低时，膜的通透性下降，也会降低脂质体的包封率。 从图1a可见，CA纳米脂质体包封率随着卵磷脂质量 的增加而增大，当膜材比达到1 8时，包封率达到最高 87.5%。CA纳米脂质体包封率不会随药脂比的改变而存 在显著性差异。 64 2014, Vol.35, No.20 食品科学 工艺技术 如图1b所示，超声时间对CA纳米脂质体的包封率有显 著影响，当超声时间在15 min时，包封率达到最大值。随着 超声时间延长有一部分脂质体会破裂导致包封率下降。 ?/% ? 40 20 80 60 100 a 30 10 70 50 90 0 1 ? 21 ? 121 ? 101 ? 41 ? 61 ? 8 ? ? ?/% ?/min 40 20 80 60 100 b 30 10 70 50 90 0 0252051015 图 1 膜材比和药脂比（a）及超声时间（b）对CA纳米脂质体 包封率的影响 Fig.1 Effect of cholesterol/lecithin mass ratio and CA/fi lm mass ratio (a), and ultrasonication time (b) on the encapsulation effi ciency of liposomes 2.2 不同因素对CA纳米脂质体载药量的影响 ?/% ? 40 20 50 a 30 10 0 1 ? 21 ? 121 ? 101 ? 41 ? 61 ? 8 ? ? ?/% ?/min 30 10 50 b 20 40 0 0252051015 图 2 膜材比与药脂比（a）及超声时间（b）对CA纳米脂质体 载药量的影响 Fig.2 Effect of cholesterol/lecithin mass ratio and CA/fi lm mass ratio (a), and ultrasonication time (b) on the drug loading of liposomes 载药量直接关系到纳米脂质体的应用前景。如图2a 所示，药脂比和膜材比对CA纳米脂质体载药量的影响不 显著；随着超声时间延长载药量会缓慢上升，15 min达 到最大载药量为36%，当超声到20 min时载药量出现显 著下降，分析其析因可能是超声时间延长导致脂质体破 裂，致使载药量下降明显。 2.3 CA纳米脂质体的形貌、粒径和Zeta电位 表 1 CA纳米脂质体粒径和Zeta电位 Table 1 Particle size and zeta potential of CA liposomes 条件 膜材比 1 21 41 61 81 101 12 粒径/nm867.320.72 493.210.57345.79.43117.45.71114.33.3415810.32 Zeta电位/mV 7.341.32 6.731.87 6.361.57 3.210.95 2.981.01 4.321.07 条件 药脂比 1 21 41 61 81 101 12 粒径/nm219.28.79127.75.64120.54.78139.35.34125.74.67133.85.89 Zeta电位/mV 3.270.97 3.030.89 3.151.38 2.520.67 2.780.78 3.330.79 采用膜材比1 8、药脂比1 10、超声时间15 min条件 制备CA纳米脂质体，用于粒径和Zeta电位测定。从表1 可以看出，CA纳米脂质体粒径与膜材比有较大的关系， 当胆固醇与卵磷脂质量比在1 8之后时，粒径可以达到 110 nm左右，CA纳米脂质体粒径随着胆固醇在膜材中比 例减小而变小。在药脂比中，当CA与膜材质量比为1 2 时形成的CA纳米脂质体粒径较大，随着CA比例下降到 1 4以下，其粒径的变化没有显著性。 ?/% ?/% ?/m 80 40 100 60 20 70 30 90 50 10 0 40 20 50 30 10 0 0.0001010.0010.010.1 2.00 m 100 nm 图 3 CA纳米脂质体粒径图与扫描电镜图 Fig.3 Particle size distribution and SEM of CA liposomes 如图3所示，CA纳米脂质体形貌较好、大小较均 一，从粒度分布图中可以看出CA纳米脂质体粒径主要为 100150 nm，粒径分布较窄；从扫描电镜放大2万 倍和 20万 倍时看到CA纳米脂质体成椭圆形，大小均匀，分散 度也较好。 工艺技术 食品科学 2014, Vol.35, No.20 65 2.4 紫外吸收光谱分析 采用膜材比1 8、药脂比1 10、超声时间15 min条件 制备CA纳米脂质体，用于紫外测定。采用紫外吸收光谱 仪分别测定紫外吸收光谱，其结果如图4所示。CA的最 大吸收峰位于327 nm波长处，在空白脂质体中未观测到 该位置有紫外吸收，而CA纳米脂质体中观察到该位置有 明显吸收，这说明了CA被成功地包覆在脂质体中。 ?AU? ?/nm 0.6 0.2 1.0 0.4 0.8 0.0 200500400300 CA CA? ? 图 4 紫外测试图 Fig.4 UV spectra 2.5 CA纳米脂质体稳定性 在膜材比18、药脂比110、超声时间15 min条件 制备CA纳米脂质体，将其置于生理盐水中，在37 、 200 r/min转速搅拌和4 条件下分别测定其体外释放率。 图5a为24 h内测定，可以看出，在前1 h内释放率上升较 快，随后变缓，在24 h内总释放率在7.2%。图5b为14 d内 测定结果，可以看出，4 d内释放率上升较为显著，随着 时间延长，释放率也开始下降，14 d内总释放率没有超过 2.8%。可见CA纳米脂质体性质比较稳定，体外释放速率 较慢。 CA?/% ?/h 3 1 8 a 2 7 6 5 4 0 0.524.012.01.02.04.08.0 CA?/% ?/d 0.5 3.0 b 2.5 2.0 1.5 1.0 0.0 2141246810 图 5 24 h（a）和14 d（b）CA纳米脂质体体外释放率 Fig.5 Stability of CA liposomes in 24 h (a) and 14 days (b) 2.6 抑菌性分析 以四环素为对照，使用膜材比1 8、药脂比1 10、超 声时间15 min条件制备的CA纳米脂质体，分别对金黄色 葡萄球菌和大肠杆菌做抑制实验，比较对两种细菌的抑 制作用。 ?/mm ?/h 8 4 16 12 20a 6 2 14 10 18 0 24968472364860 ? CA CA? ? ?/mm ?/h 8 4 16 12 20b 6 2 14 10 18 0 24968472364860 ? CA CA? ? 图 6 对金黄色葡萄球菌（a）和大肠杆菌（b）的抑菌作用 Fig.6 Inhibitory effect of CA liposomes on Staphylicoccus aureus and Escherichia coli 从图6可以看出，CA抑菌效果比较显著，与四环素 相比无明显差异，抑菌圈直径均大于15 mm，空白脂质 体对两种细菌都没有明显的抑制效果。 CA纳米脂质体有明显的抑菌效果，在24 h内与CA、 四环素相比有明显的降低，但在48 h后，CA和四环素的 抑菌作用下降较为显著，CA纳米脂质体抑菌作用下降缓 慢，抑菌效果明显更强。分析其原因可能是CA、四环素 在培养基上随着时间延长其质量浓度下降导致抑菌作用 下降，而CA纳米脂质体具有缓释作用，随着时间的延长 缓释效果显现，所以到后期的抑菌效果会明显更强。 3 结 论 绿原酸是一种难溶于水、易溶于乙醇的活性物质， 采用脂质体包裹可以使其均匀的分散于水溶液中。纳米 脂质体的制备方法很多，通过不同方法和条件控制包封 率、粒径、缓释效果等指标。同本研究使用的方法相 比，冷冻干燥法制备的脂质体在贮存过程中易发生聚集 和药物渗漏等，脂质体的稳定性和缓释效果差；冻融法制 备脂质体在反复冻融的过程中产生的冰晶容易破损脂质体 膜，影响包封率；复乳法制备的脂质体粒径较大，难以达 到纳米级；反相蒸发法制备的脂质体体积较大，而且更适 用于水溶性药物，所以没有选择此方法19。对纳米脂质体 进行修饰是未来靶向控释给药研究的方向20。 本实验采用薄膜分散超声法制备的CA纳米脂质体有 较好的分散度，粒径控制在110 nm左右，经过扫描电镜观 66 2014, Vol.35, No.20 食品科学 工艺技术 察，脂质体成椭圆形；经紫外光谱吸收测定，CA和CA纳 米脂质体在327 nm波长处有一个最大吸收峰，而空白脂质 体在此处没有，说明CA已经成功包被其中；包封率和载 药量分别达到87.5%和36%。在体外37 24 h和4 14 d的 实验中可以看出，CA纳米脂质体具有较好的稳定性，其 释放率都不超过10%，同时也具备了缓释功能。 在抑菌实验中，CA和CA纳米脂质体都有较好的抑 菌效果，CA纳米脂质体的抑菌能力略低于CA，分析其 原因可能是CA纳米脂质体游离出CA的速率会比CA慢， 导致其开始时抑菌能力较CA低，但是随着CA纳米脂质 体中CA缓慢释放，其抑菌时间会比CA长，这是因为脂 质体具有缓释的功能。 CA是一种难溶于水的活性物质，在使用过程中通常 被这一性质所阻碍，通过脂质体包被，为CA的应用提供 新的途径。 参考文献： 1 SHI Haitao, DONG Lei, JIANG Jiong, et al. 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