Luteolin 对实验性胰腺炎的保护作用【推荐论文】 .doc

精品论文luteolin 对实验性胰腺炎的保护作用熊杰1，胡国勇2，倪建波1，万荣1，王兴鹏2（1. 同济大学附属第十人民医院消化内科，上海 200072；52. 上海交通大学附属第一人民医院消化内科，上海 200080） 摘要：目的：观察 3,4,5,7-四羟黄酮（lut）治疗小鼠重症急性胰腺炎（sap）的效果并探讨 其作用机制。方法：50 只雄性 c57bl/6 小鼠随机分为生理盐水注射、重症急性胰腺炎模型 组、低剂量 lut 给药组（50mg/kg）、中剂量 lut 给药组（100mg/kg）、高剂量 lut 给药组（200mg/kg），每组 10 只，各给药组均与开始造模前 2 小时灌胃给药。造模完成后 6 h 处10死各组小鼠，he 染色法观察胰腺组织病理改变并测定各组小鼠血清淀粉酶水平及胰腺组织mda 和 mpo 含量；elisa 法检测血清 ho-1、tnf-、il-10 含量；realtime-pcr 法检测 胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10 mrna 水平变化；western bolt 法检测胰腺组织 ho-1、tnf- 、il-10、nf-b 蛋白水平变化。结果：较 sap 模型组，三组 lut 给药组均可不同程度 地改善胰腺损伤程度，降低胰腺组织病理评分与胰腺湿重比（p0.05）；升高血清、组织15mrna 水平及组织蛋白水平的 ho-1、il-10 含量（p0.05 或 p0.01），降低 tnf-含量（p0.05 或 p0.01）。同时三组 lut 给药组均可不同程度地降低胰腺组织中 mda、mpo 含量。结论：lut 可发挥对 sap 胰腺的保护作用，其机制可能与增高组织 ho-1 活力，降低 氧化应激水平、减少中性粒细胞浸润、促进抗炎因子 il-10 的表达及抑制 nf-b、tnf-表达有关。20关键词：3,4,5,7-四羟黄酮；血红素加氧酶；肿瘤坏死因子-；白介素- 10；核转录因子-b中图分类号：r576protect effects of luteolin on experimental acute pancreatitis25in micexiong jie1, hu guoyong2, ni jianbo1, wan rong1, wang xingpeng2(1. department of gastroenterology,shanghai tenth peoples hospital, tongji university schoolof medicine, shanghai 200072;2. department of gastroenterology, shanghai first peoples hospital, shanghai jiaotong30university school of medicine, shanghai 200080)abstract: objective：to investigate the protect effects of luteolin on the pancreas in severe acutepancreatitis (sap) mouse model, and explore its possible mechanism. method: a total of 50 malec57bl/6 mice were randomly divided into 5 groups (n=10 in each group): group 1, normal saline-treated group; group 2, sap model group; group 3, 4, 5, sap + luteolin-treated （50, 100,35200 mg/kg, per os ,respectively, luteolin was administrated 2 h before the model establishment. 6 h after the model establishment, all mice were sacrificed,the pancreas weight / body weight ratio was calculated, the histopathological changes in each group were graded, the amylase levels in serum and the contents of malondialdehyde (mda) and myeloperoxidase (mpo) in pancreastissue were detected. the heme oxygenase-1( ho-1)、tumor necrosis factor alpha (tnf-)、40interleukin-10（il-10）and nuclear factor kappa b (nf-b) levels in serum and pancreas tissure were detected by elisa, realtime-pcr and western blot. result：pretreatment with luteolinsignificantly attenuated the severity of pancreatitis as evidenced by effective reductions in pancreas weight / body weight ratio, histopathology scores, mpo activity, mda formation,tnf- level, nf-b activity(p0.05 or p0.01), and conspicuous increases in ho-1 and il-10.45conclusion: the result of the study demonstrated that luteolin has protective effects on the pancreas in sap. upregulation of ho-1 and il-10,down regulation of nf-b and tnf- might be severd as its potential mechanism.基金项目：高等学校博士学科点专项科研基金资助项目（编号 20090072110022）作者简介：熊杰，（1987-），男，硕士研究生，急性胰腺炎的基础研究。通信联系人：王兴鹏，（1965-），男，教授，胰腺疾病的基础与临床。 e-mail: - 9 -keywords: luteolin; heme oxygenase-1; tumor necrosis factor alpha; interleukin-10; nuclear factor kappa b500引言急性胰腺炎(acute pancreatitis，ap)是由于多种原因引起的胰腺自身消化性疾病，急性重 症胰腺炎(severe acute pancreatitis，sap)由于并发多脏器功能衰竭，病情凶险，常常危及患 者的生命1。氧化应激(oxidative stress)是在机体内活性氧生成和抗氧化物质失衡状态下，直55接或间接通过信号转导通路引起细胞的损伤，是许多疾病的病因，同时又是许多疾病发生、 发展的结果。目前研究表明，氧化应激在 ap 的发病中发挥重要作用，还与胰腺炎时胰腺外 器官的损伤有密切的联系2,3。3,4,5,7-四羟黄酮（luteolin，lut）又名木犀草素，属于天然黄酮类化合物，近年研究 表明 lut 具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤、免疫调节等作用4。本研究通过观察 lut 对雨蛙素联60合脂多糖诱导的小鼠重症急性胰腺炎组织病理、生化指标、促炎及抗炎因子表达水平、血红 素加氧酶（heme oxygenase-1，h0-1）表达水平以及核因子 kappa b p65（nuclear factor kappa b,nf-b p65）的影响，初步探讨 lut 对小鼠重症急性胰腺炎的保护作用及其可能机制。1材料与方法1.1材料与试剂65健康雄性 c57bl/6 小鼠 50 只，体重 20-22 g，购自中科院上海实验动物中心。lut 购自 上海同田生物科技有限公司，雨蛙素(cerulein，cn)和脂多糖(lipopolysaccharide，lps)均购自 美国 sigma 公司。血淀粉酶试剂盒、丙二醛(mda)试剂盒、髓过氧化物酶(mpo)试剂盒均购 自南京建生生物制品研究所。ho-1、tnf-、il-10 elisa 试剂盒均购自美国 r&d 公司。 trizol 试剂购自美国 invitrogen 公司，逆转录试剂盒、realtime-pcr 试剂盒均购自日本 tankara70公司。兔抗鼠 ho-1、tnf-、il-10、nf-b p65、均购自美国 santa cruz 公司。内参抗体 -actin、lamin b 及羊抗兔荧光标记二抗均购自巴傲德生物公司。1.2方法1.2.1动物分组及模型制作按照随机分配原则将小鼠分为 5 组，即生理盐水组(normal saline,ns)、模型组、低剂量75lut 给药组、中剂量 lut 给药组和高剂量 lut 给药组，每组 10 只。受试动物于实验前禁食18h，自由饮水。模型组小鼠腹腔内注射雨蛙素 50ug/kg，连续 6 次，每次间隔 1h，在末次 雨蛙素注射后，即向腹腔内注射脂多糖 10mg/kg；低、中、高三组 lut 给药组分别于第一次 注射雨蛙素 2 小时前予以口服灌入 100mg/kg、200mg/kg 和 400mg/kg lut，其造模步骤同模 型组。ns 组用相同体积生理盐水代替雨蛙素及脂多糖予以注射。801.2.2取材各组小鼠均于最后一次雨蛙素注射后第 6 小时眼球取血，脱颈法处死，剖腹，肉眼观察 腺及胰外各器官变化。仔细分离全部胰腺，称胰腺湿重，计算湿重比（胰腺湿重与体重的比）， 一部分胰腺于 4%多聚甲醛溶液中固定，石蜡包埋，供形态学检测；其余部分-80保存，用 于组织 mda、mpo 水平测定以及 western blot。851.2.3血清各项指标的测定采用碘-淀粉比色法测血清淀粉酶含量，采用酶联免疫吸附试验检测血清 ho-1、tnf-、il-10 的含量，各项操作过程严格按照产品说明书指示。1.2.4胰腺组织 mda 及 mpo 含量测定 取部分胰腺组织称重后，加人相应比例的生理盐水，用低温匀浆机制成 l的匀浆，4 903000 g/min 离心 lomin,取上清，双缩脲法测定蛋白含量，硫代巴比妥酸（tba）法检测 mda含量。另取部分胰腺组织称重后，加入相应比例的生理盐水，用低温匀浆机制成 10%匀浆， 取出 0.1 ml 上清，用酶化学法测定 mpo 含量，各项操作过程严格按照产品说明书指示。1.2.5胰腺组织病理检查及评分各组取胰腺常规切片，he 染色，显微镜下观察。用双盲法按 schmidt 标准行胰腺组织95病理评分5，评分标准见表 1。表 1 schmidt s 胰腺组织病理学评分标准tabl e 1 schmi dts scor e standard of pancr eati c hist opathl ogy0123间质水肿无小叶间小叶内腺泡间炎症浸润实质坏死 实质出血无无 无20%5%1-2 处20% -50%5% -20%3-5 处50%20%20%病理改变 分值1001051101151.2.6胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10 mrna 水平测定按说明书用 trizol 试剂盒提取肺组织总 rna，用紫外分光光度计测定 rna 浓度，逆转 录法生成 cdna。采用 realtime-pcr 法检测各组胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10 mrna 水 平变化,以 -actin 为内参照，ct 法计算各组间 mrna 倍数关系。 ho-1 正向引物：5-gatagagcgcaacaagcagaa-3 ， 反 向 引 物 ： 5-cagtgaggcccatacc agaag-3；tnf- 正向引物：5-tctcttcaagggacaaggctg-3，反向引物：5- ata gcaaatcggctgacggt -3；il-10 正向引物：5- cttactgactggcatgaggatca-3， 反 向引物： 5- gcagctctaggagcatgtgg-3 ；-actin 正 向 引物： 5- gtcc ctcaccctcccaaaag-3，反向引物：5- gctccctcaac-acctcaaccc -3。1.2.7western blotting 检测取-80 保存的胰腺组织，液氮研磨后分别提取总蛋白与核蛋白，测定蛋白浓度，经 sds-pade 电泳分离，将目的蛋白转移至硝酸纤维膜上，脱脂奶粉封闭，加兔抗鼠 ho-1（稀 释倍数 1:100）、tnf-（稀释倍数 1:100）、il-10（稀释倍数 1:100）、一抗，4 孵育过 夜，加荧光标记二抗，洗膜后机器曝光，采用 image- pro plus 像分析系统对各条带平均灰度 值（a）进行分析，以目的条带的 a 值与内参照 -actin 的 a 值比值为相对表达量。1.2.8统计处理分组所得计量数据采用均数标准差表示，组间均数比较用 snk-q 检验。病理组织评分 等级差异用 ridit 分析，数据用样本例数表示。p0.05 认为差异有统计学意义。2结果1201252.1各组胰腺组织病理变化及评分如图 1 所示，生理盐水组，胰腺组织正常（图 1a）；模型组即 cn+lps 组，胰腺高度 水肿，广泛腺泡细胞坏死，细胞结构模糊不清，腺泡内空泡形成，坏死区有大量中心粒细胞 和单核细胞浸润。胰腺间质内动脉痉挛，静脉明显扩张淤血，炎性细胞附边，局部血管出血、 坏死（图 1b）；低、中、高 lut 给药组相比模型组有不同程度的水肿、浸润及坏死程度的 减轻（图 1c、1d、1e）。各组评分结果见表 2。表 2 schmidts 胰腺组织病理评分结果tabl e 2 the results of pancr eati c hist opathol ogy score病理变化ns 组分值 总数0 1 2 3间质水肿 9 1 0 0 10 炎症浸润10 0 0 0 10 实质坏死10 0 0 0 10实质出血 10 0 0 0 10sap 模型组间质水肿 0 0 4 6 10a炎症浸润 0 0 4 6 10a实质坏死 0 0 3 7 10a实质出血 0 6 4 0 10a低 lut 给药组间质水肿 0 2 4 4 10ab炎症浸润 0 2 5 3 10ab 实质坏死 0 2 5 3 10ac 实质出血 2 6 2 10ab中 lut 给药组间质水肿 0 5 3 2 10ac 炎症浸润 0 6 2 2 10ac 实质坏死 0 4 5 1 10ac 实质出血 7 3 0 0 10ac高 lut 给药组间质水肿 0 7 2 1 10ac 炎症浸润 0 8 2 0 10ac 实质坏死 0 7 3 0 10ac实质出血 9 1 0 0 10c注：a：与生理盐水组相比 p0.05；b：与模型组相比 p0. 05；c：与模型组相比 p0.01130135图 1 各组胰腺组织病理比较。a：正常胰腺；b：急性胰腺炎模型组；c：低剂量 lut 给药组；d：中剂量lut 给药组；e：高剂量 lut 给药组figure 1. comparision of pancreas among each group (he,400). a：normal pancreas; b：ap model group; c：low dose luteolin group; d：middle dose luteolin group; e：high dose luteolin group2.2各组胰腺组织湿重比及 mda、mpo 含量测定结果如表 3 所示，与生理盐水组相比，模型组胰腺湿重比、mda 含量以及 mpo 含量均显 著增高（p0.05),低、中、高 lut 给药组相比模型组三项指标均有不同程度的下降（p0.05 或 p0.01）。140表 3 各组胰腺组织湿重比、mda 含量及 mpo 含量tabl e 3 the pancreas wei ght/ body wei ght、mda and mpo level i n pancr eas ti ssure组别 例数 胰 腺 湿 重 比（mg/ g）mda 含量（nmol/ mg.pr ot）mpo 含量（u/mg）ns 组64. 870.251. 721.240. 100.04sap 模型组69. 240.48a7. 342.16a0. 670.10a低lut 给药组68. 320.35ab6. 181.20ab0. 530.05ab中lut 给药组67. 780.29ab5. 721.32ac0. 450.07ac高lut 给药组66. 920.25ac4. 771.53ac0. 380.10ac注：a：与生理盐水组相比 p0.05；b：与模型组相比 p0. 05；c：与模型组相比 p0.011452.3各组血清淀粉酶、ho-1、tnf-、il-10 值测定结果如表 4 所示，与生理盐水组相比，模型组血清淀粉酶、tnf- 水平显著增高（p0.05）， 低、中、高 lut 给药组可不同程度降低血清淀粉酶水平、tnf- 水平（p0.05 或 p0.01）。 模型组血清 ho-1、il-10 水平相对生理盐水组已有比较明显升高（p0.05），然而低、中、 高 lut 各给药组血清 ho-1、il-10 水平相比模型组而言又均有不同程度的增高（p0.05 或 p0.01）。150表 4 各组血清淀粉酶、ho-1、tnf-、il-10 含量tabl e 4 the level of amylase、ho-1、tnf- and il-10 in ser um组别 例数 淀粉酶（u/ml）ho-1（ng/ ml）tnf-(pg/ ml)il-10(pg/ ml)ns 组 6 27801328 0. 280.05 28.88.9 12.52.3sap 模型组 6 177852370a 0. 560.06a 98.722. 9a 56.35.9a低lut 给药组6136763354ab0.730.05 ab82.314. 5ab79.48.4ac 中lut 给药组6115432128ac0.820.07ac71.210. 6ac89.86.9ac 高lut 给药组6103801896ac0.960.04ac63.08.9ac 104. 710.2ac 注：a：与生理盐水组相比 p0.05；b：与模型组相比 p0. 05；c：与模型组相比 p0.011551601651701752.4各组胰腺组织 ho-1、il-10 mrna 水平测定结果如图 2 所示，与生理盐水组相比，模型组 tnf- mrna 水平增高倍数明显（p0.05）， 低、中、高 lut 给药组可不同程度降低胰腺组织 tnf-mrna 水平增高倍数（p0.05 或 p0.01）。模型组 ho-1 mrna、il-10 mrna 水平较生理盐水组已有小幅度增高，低、中、 高 lut 各给药组可使 ho-1 mrna、il-10 mrna 水平增高幅度更为明显（p0.05 或 p0.01）。图 2 各组胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10 mrna 水平表达情况。a 代表与生理盐水组相比，p0.05；b 代 表与模型组相比，p0.05；c 代表与模型组相比，p0.01figure 2 the mrna level of ho-1, tnf-, il-10 in pancreas tissure among each group. ap0.01 vs. ns group；bp0.05 vs. ap group；cp0.01 vs. ap group2.5各组胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10、nf-b p65 蛋白水平表达结果如图 3 所示，与生理盐水组相比，模型组 tnf-、nf-b p65 蛋白表达水平显著升高（p0.05），低、中、高给药组可不同程度降低 tnf-、nf-b p65 蛋白表达水平（p0.05 或 p0.01）。模型组 ho-1、il-10 蛋白表达水平较生理盐水组已有小幅度升高（p0.05）， 低、中、高 lut 给药组可使 ho-1、il-10 蛋白表达水平增高幅度更为明显（p0.05 或 p0.01）。图 3 各组胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10 及 nf-b 蛋白表达情况。a：各组胰腺组织 ho-1、tnf-、 il-10 及 nf-b 蛋白表达变化；b-e：各组胰腺组织 ho-1、tnf-、il-10 及 nf-b 蛋白相对表达 量的变化。a 代表与生理盐水组相比，p0.05；b 代表与模型组相比，p0.05；c 代表与模型组相比，p0.01fi gure 3. the pr otei n levels of ho-1,tnf-, il-10, nf-b in pancreas tissure among each gr oup. a： changes of ho-1、tnf-、il-10 and nf-b expr essi on at pr otei n level among each gr oup；b-e： relat i ve expressi on l evel of ho-1、tnf-、il-10 and nf-b among each gr oup. ap0.01 vs. ns group； bp0.05 vs. ap group；cp0.01 vs. ap group精品论文1801851901952002052102153讨论在 sap 的发病过程中，早期胰蛋白酶原被激活转化为胰蛋白酶，诱发局部炎症反应， 炎性介质产生，多核中性粒细胞、巨噬细胞、淋巴细胞释放溶酶体酶、氧自由基(oxygen free radicals，ofr)、血管活性物质和促炎反应介质6。ofr 及其衍生物作为分子起源在胰腺损 害的过程中起重要作用，这些高度的活化物质可通过脂肪酸过氧化作用造成的类脂膜破坏及 溶酶体膜破坏。此外 ofr 可激活补体，促进白细胞黏附、活化和迁移，能够损伤内皮细胞 的完整性，增加毛细血管的通透性，造成循环血量的丢失，引起微循环障碍，加重胰腺损伤 7-9。ho-1 也被称为热休克蛋白-32(hsp-32)，为一种应激诱导蛋白，是降解血红素为胆绿素、 一氧化碳(co)和亚铁的限速酶。近来研究显示，应激状态下，ho-1 通过抗氧化、维持微循 环正常功能和抗炎性介质反应等机制保护细胞10-12。急性胰腺炎一旦发生即可引起氧化应激 反应基因的强烈上调，尤其是 ho-1 基因显著上调最为显著。这表明机体具有对抗应激的代 偿机制，然而胰腺的局部病变并未因此停止，原因在于对抗炎性介质反应的应激基因表达难 以拮抗和抑制大量释放的促炎细胞因子基因表达13。lut 作为一种天然抗氧化剂，已被多种 体内外实验证实具有上调 ho-1 表达水平的功能14。本实验通过口服不剂量的 lut 进而不同 程度地提高了机体 ho-1 表达水平，lut 给药组可呈剂量依赖性地显示出对小鼠 sap 的保护 作用，主要表现为血清淀粉酶水平的降低，胰腺组织病理评分的降低以及胰腺湿重比的下降。 mda 是氧自由基引起细胞脂质过氧化的产物，而过氧化脂质是自由基与脂质作用的产物， 可间接映机体细胞受氧自由基攻击的严重程度。mpo 作为衡量中性粒细胞浸润程度的指标， sap 时胰腺组织含量显著增高，提示中性粒细胞浸润增多。本实验结果显示，lut 给药组可 呈剂量依赖性地降低胰腺组织 mda 和 mpo 含量，提示 lut 能够在有效改善胰腺组织的抗 氧化能力并减轻机体脂质过氧化程度的同时减少胰腺组织中性粒细胞的浸润，发挥对胰腺炎 的保护作用。在 sap 的炎症应答过程中，致炎因子和氧化应激产物发挥协同作用，触发共同的信号 传导通路，主要通过 nf-b 的激活，导致了炎症因子的级联扩增。nf-b 是以同或异二聚 体形式存在的核转录因子。通常，非激活状态下，nf-b 二聚体与其抑制蛋白 ib 非共价结 合于胞浆内以无活性形式存在。许多因素通过激活一个或数个信号转导途径，导致 ikb 磷 酸化、ib 迅速泛素化，从 nf-b /ib 复合体中释出。nf-b 活化并向核内转移，其活化 形式是 p65 和 p50 组成的异二聚体15。nf-b 的激活可促进 tnf- 的释放，而 tnf- 的大 量释放又促进 ib 的磷酸化使 nf-b 进一步激活，导致最初的炎症信号不断放大，这是一 类正反馈。tnf- 是 sap 早期转录水平增加较早的炎症因子，其升高可诱导 il-6、il-8 及 其自身表达的增高，从而引起级联反应，造成炎性介质的失控性释放16。此外 tnf- 还能 促进炎症部位白细胞聚集和活化，活化的白细胞又可产生大量 ofr。因此，致炎因子特别 是 tnf- 和氧化应激的相互作用形成了一个恶性循环，是导致 sap 的重要根源6,17,18。目前 研究表明，抑制氧化应激可抑制 nf-b 活性，显著减少 tnf- 等炎症因子的合成和释放， 延缓缓急慢性炎症的发展19。il-10 作为体内一种重要的抗炎因子，其可抑制 tnf-、il-2、 il-3 等细胞因子的合成并可负反馈抑制 nf-b 的激活 ，对 sap 所致多器官损伤有保护作 用，在 sap 早期机体开始释放 tnf- 等促炎因子导致疾病恶化的同时，机体也开始释放 il-10 等抗炎细胞因子，但仍难以阻止全身过度炎性介质反应和胰腺坏死。提高 sap 状态下抗炎 细胞因子 il-10 表达和抑制促炎细胞因子 tnf- 表达可缓解或阻断胰腺的局部病变和 sap220225所致的多器官功能衰竭20,21。本研究显示，口服给予不同剂量 lut 致机体 ho-1 水平剂量依 赖性高表达时，血清和胰腺组织中的 il-10 含量也呈剂量依赖性增高，而 nf-b、tnf- 表 达水平却相应地降低。由此推论，可能是 ho-1 提高 il-10 表达抑制 tnf- 的释放或者通过 抑制 nf-b 的活化进而抑制 tnf- 的释放。总之，本研究证实 lut 对 sap 小鼠模型的保护作用，其部分机制可能与 lut 增高组织ho-1 活力，降低氧化应激水平、减少中心粒细胞浸润、促进抗炎因子 il-10 的表达及抑制nf-b、tnf- 表达有关。尽管如此，lut 对 sap 的保护作用仍需进一步的理论与临床论证。参考文献 (references)2302352402452502552602652702751 lopez martin a, carrillo alcaraz a. oxidative stress and acute pancreatitisj. rev esp enferm dig2011;103:559-62.2 apodaca-torrez fr, lobo ej, monteiro lm, de melo gr, goldenberg a, herani filho b, trivino t, lopesfilho gde j. severe acute pancreatitis: results of treatmentj. rev col bras cir 2012;39:385-8.3 col c, dinler k, hasdemir o, buyukasik o, bugdayci g. oxidative stress and lipid peroxidation products: effect of pinealectomy or exogenous melatonin injections on biomarkers of tissue damage during acute pancreatitisj. hepatobiliary pancreat dis int 2010;9:78-82.4 kuo my, liao mf, chen fl, li yc, yang ml, lin rh, 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