蚕豆中黄曲霉毒素B1提取方法的研究.pdf

第 3 O卷第 1 期 Vo 1 3 0， No 1 西 华 大 学 学 报( 自 然 科学 版 ) J o u rna l o f Xi h u a Un i v e r s i t y Na t u r a l S c i e n c e 2 0 1 1年 1月 J a n 2 01 1 文章编号 ： 1 6 7 3 1 5 9 X( 2 0 1 1 ) O l - 0 0 2 3 - 0 5 蚕豆 中黄 曲霉毒 素 B 提取方法的研究 靳学敏 ， 车振 明 ( 西华大学生物工程学院 ， 四川 成都 6 1 0 0 3 9 ) 摘要 ： 主要探讨 了高效液相色谱法快速检测蚕豆 中黄 曲霉素 B ， 的提取条件 ； 分别 考察 了在不 同超声波提取 时间、 不同超声波提取功率下、 不同浓度的甲醇对黄曲霉素 B 分离检测效果的影响； 并用响应面设计探讨了不同 条件的交互作用 ； 找出 了最佳工艺参数的范 围 ： 甲醇浓度 为 4 9 9 0 5 0 3 5 ， 提取 时间为 6 0 9 6 2 2 mi n ， 超声 波提取功率为 9 5 2 9 7 1 。可为 黄曲霉素 B 的检测提供简便 、 准确 、 可靠 、 重复性好 的分析方法 。 关键词： 黄曲霉毒素； 高效液相色谱法 ； 蚕豆 中图分类号： X 5 6 文献标志码 ： A The S t u dy o f Afla t o x i n B 1 Ex t r a c t i o n f r o m Be a n J I N Xu e rai n，C HE Z h e n mi n g ( S c h o o l o f B i o e n g i n e e r i n g， X i h u a U n i v e r s i t y ， C h e n g d u 6 1 0 0 3 9 C h i n a ) Ab s t r ac t ： Thi s s t ud y f o c us e d o n t he h i g h p e rfo r ma n c e l i q ui d c h r o ma t og r a p hy me t h o d f o r r a pi d d e t e c t i o n o f AFBl i n br o a d b e a n Th e a ut h o r s i n v e s t i g a t e d t he s e p a r a t i o n a nd d e t e c t i o n e f f e c t o f AFBl a t d i f f e r e n t t i me s，d i f f e r e n t ul t r a s o n i c po we r an d t he d i f f e r e n t c o n c e n t r a t i o n s o f me t h a n o l ， us e d r e s p o ns e s u rfa c e d e s i g n t o d i s c u s s t h e i nt e r a c t i o n o f di f f e r e nt c o n d i t i o n s Th e o p t i n mm pa r a me t e r s a r e： 4 9 9 0 一 5 0 35 e t h a n o l c o nc e nt r a t i o ne x t r a c t i o n t i me 6 0 9 6 22 mi n95 2 一 9 7 1 u l t r a s o ni c p o we r Th e pa pe r pr e s e n t s a s i m p i e，a c c u r a t e，r e l i a b l e a n d r e pr o d u c i b l e me t h o d t o de t e r mi n e AFB1 Ke y wor ds： a fta t o x i n；HPLC；br o a d be a n 食品安全问题 已经是一个全 民关注的大 问题 ， 豆瓣作为大多数菜品的必备调料 ， 其安全问题也需 得到重视。郫县豆瓣是 四川省的地方名产 ， 是人们 喜食的调料之一。蚕豆作为郫县豆瓣的主要原料之 一 ，其质量安全直接影 响到成 品豆瓣 的产 品质量 。 蚕豆在潮湿的条件下储存 、 运输易于霉变。存在于 蚕豆中的真菌毒素主要是黄 曲霉毒素 ( A F T ) 、 镰刀 菌毒素 ， 其 次是 杂色曲霉毒素和棕曲霉毒素 Al 1 。 其中以黄曲霉毒素 B ， 毒性最大 、 致癌性最强 ， 其毒 性远远高于氢化物 、 砷化物和有机农药的毒性 。在 一 般的烹调加工温度下 ， 黄曲霉素很少被破坏 ， 即使 在 2 0 0 高 温加热 下 ， 也 不能 完全破 坏 。 在我国， 曾数次发生 因豆瓣中由黄 曲霉毒素所 引发 的 中毒事 件 ， 出 口的 豆瓣 中黄 曲霉 毒 素 B ( A F B ) 已经成为限制出口的技术壁垒。在全世界 ， 基于这些真菌毒素的毒性 ， 食品和动物原料 中真菌 毒素的含量都有所控制 ， 在 G B T 2 0 5 6 0 -2 0 0 6 地 理标志产品 郫县豆瓣 卫生指标中规定豆瓣 中黄 曲 霉毒素( B ) 的含量不得大于 5 i x g k g ； 欧盟 国家 对于黄曲霉毒素的限量为 ： A F B 的限量为2 g k g ； A F总 量 的限量 为 4 t x g k g 。 作为传统发酵 制 品生产 的主要 原料 ， 加强 对 蚕豆中黄 曲霉 毒素 的检测是 十分必要 的， 也是 生 产 中必须把住 的原料关 。现有 的国家标 准已经 规定 了某些产 品的黄 曲霉毒素检测方法 ， 但是 ， 方 法繁琐 ， 企业检验人 员难 以掌握 ， 与 国外 的检测 结 收稿 日期 ： 2 0 1 0 439 1 2 基金项 目： 四川省教育厅 2 0 0 8年重点项 目( 0 8 E A 0 3 0 1 ) ； 西华 大学食 品科学重点学科建没项 目( S Z D 0 8 3 1 4 3 9 - 1 ) 作者简介： 靳学敏 f 1 9 8 6 一 ) ， 女 ， 硕 士研究生 ， 主要研究方向为食品安全与检测。 通信作者 ： 车振明( 1 9 6 0 一 )， 男 ， 教授 ， 主要研究方向为食品安 全与检测技术 。E ma i l ： c h e z h e n mi n g 1 6 3 C O Il 3 2 4 西华大学学报 自然科学版 2 0 1 1 矩 果差距较大， 而且 ， 在黄 曲霉毒 素检测方 法 中， 样 品前处 理 非 常 重 要 ， 所 以 产 品 的 检 测 方 法 还 不 能 直接应用 于原材料 和半成 品。因此 ， 建 立蚕豆 中 黄曲霉素 B 稳定、 可靠 、 快速 的检测方 法对于提 高豆瓣质量十分重要 。本研究系统探讨 了高效液 相色谱法对蚕豆中黄 曲霉素 B 的提取方法 ， 用响 应面设计优化提取 条件 ， 最终 得到蚕豆 中黄 曲霉 素 B 的最佳提取条件。 1 材料与试剂 、 仪器 1 1实验材料 蚕豆( 四川成都某豆瓣厂提供 ) ， 粉碎后过 2 0 目筛备用。 1 2试 剂和仪器 1 2 1 试 剂 甲醇 ( 分析纯) ， 成都市科龙化工试剂厂 ； 甲醇 ( 色谱纯) ， f i s h e r 公 司； 乙腈 ( 色谱纯) ， f i s h e r 公 司； 黄曲霉毒素 B 标准 品( 纯度 9 9 ) ， 成都奥克公 司。 1 2 2仪 器 岛津 L c 2 0液相色谱仪 ， 日本岛津公司； 荧光检 测器 R F 1 0 A X L ， 日本岛津公司； 色谱柱( 依利特 H y p e r s i l O D S ： ) ， 大连依利特公司； K Q 一 1 0 0 D E型数控超 声器 ， 昆山市超声仪器有限公司。 2 实验方法 2 1 标准 品溶液 的制备 精确称取一定量 A F B 标准品， 用 H P L C级乙腈 配成 l 0 o 0 g m L标准储备液， 并标定其质量浓度 为 9 8 1 t x g mL ， 保存于 一 7 0 c c冰箱中。 2 2样品提取 准确称取粉碎混匀样品2 O 0 0 g 通过 2 0目筛 ， 置 于 2 5 0 m L带塞椎形瓶中， 先进行单因素试验， 分别加 入 8 0 m L不同浓度的甲醇溶液， 在不同的功率下， 超 声波提取不同时间， 用快速定性滤纸过滤于 1 0 0 m L 的具塞锥形瓶中， 提取液于5 0 c 【 = 下旋转蒸发。 2 3 样 品净化 将经旋转蒸 发后的残 留溶 液过 C 。 。 固相萃取 小 柱 ( S P E) 柱 进行 净 化 。用 3 m L蒸馏 水 淋洗 S P E 柱 ， 再用 3 m L P B S溶液淋洗柱子 ( 保持 2 d s ) ； 经 旋转蒸发后的残 留溶液过 S P E柱进 行净化 ( 2 d S ) ； 3 mL蒸馏水淋洗柱子 ， 5 mL P B S淋洗柱子 ， 弃 去流出液 ， 用流动空 气将 柱 内吹干； 1 5 m L色谱 乙腈洗脱 ， 收集洗脱液于进样瓶 中， 用 0 4 5 m滤 头过滤待测 。 2 4实验 设计 2 4 1 单 因素试验 将样品粉碎后 ， 过 2 0目筛， 选取甲醇浓度、 超声 波提取功率 、 提取时间、 提取温度四个因素进行单因 素试验。单 因素试验设计见表 1 。 表 1 单因素试验设计 2 4 2 B o x B e h n k e n试验 设计 在单因素试验结果基础上， 选择 甲醇浓度 、 超声 提取功率和提取时间进行考察， 并 以黄曲霉毒素含 量作为响应值设计 B o x B e h n k e n试验。试验因素水 平及编码见表 2 。 表 2 B o x B e h n k e n试验设计 注 ： 4=( l 一 5 0 ) 5； B=( 2 6 ) 1 ；C=( 3 9 0 ) 1 0 2 5 色谱条件 色谱柱 ： 依利特 H y p e r s i l O D S ； 流动相： 乙腈体 积： 水体积( 1 4 ： 8 6 ) ； 流速 ： 1 0 m L m i n ； 柱温： 3 5 c 【 = ； 检测波长 ： 激发波长 3 6 5 n m， 发射波长 4 2 5 n m； 进样 量 ： 2 5 L 。 2 6 黄曲霉毒素 B 含量的计算方法 以黄曲霉毒素 B 标准品保留时间定性， 确认样 品中黄曲霉毒素 B 色谱峰 ； 计算 出样品中黄曲霉毒 素 B 峰面积 ， 标准曲线法定量。黄曲霉毒素 B 含 量按下式计算 A V 。 m f 式中： C 为试样 中每种黄曲霉毒素 B 的浓度 ( ) ； 为试样按外标法在标准 曲线中对应的浓度 ( jx g L ) ； V为试样提取过程中提取液的体 , mL ； m 为试样 的取样量 g 为试样溶液衍生后较衍生前的 浓缩倍数； 计算结果保留三位有效数字。 3 结果 与讨论 3 1 标 准 曲线 取“ 2 1 ”下 的 9 8 1 mL标准 储备 配制 成 0 0 2 t L g mL标准溶液， 用 0 0 2 g mL标准溶液分 第 1期 靳学敏 ， 等 ： 蚕豆 中黄曲霉毒 素 B 提取 方法的研究 别进样 1 0 0、 7 5 、 5 0 、 2 5 、 1 0 、 7 、 5 、 4 L ， 相 当于 0 0 8 、 0 0 6、 0 0 4、 0 0 2、 0 0 08、 0 0 0 5 6、 0 0 0 4、 0 0 0 3 2 m L分别进样 2 5 的结果。根据浓度 与峰面积的 关系制成标准曲线 ， 建立线性回归方程 为： _y=3 E十 0 7 x一3 1 1 0 4， R =0 9 9 9 2 。所测得标准工作 液如图 1 所示 ， 黄曲霉毒素 B 的保 留时间为 3 6 ra i n 。 m V 商 ： 上 J x ： j 03 3nm I t 图 1 黄 曲霉毒素 B ， 标准品色谱图 3 2回收率试 验 用加标量为 2 k g的蚕豆样品按照 2 2 2 3 之方法进行提取 ， 平 等提取 5份 ， 每份样 品测定 5 次， 测得回收率和精密度如表 3所示 。 表 3 回收率和精密度试 验结果 3 3单因素试验结果 3 3 1 甲醇浓度对蚕豆中黄 曲霉毒素提取的影响 在提取时间为 8 m i n ， 超声功率为 1 0 0 ， 温度 为 3 5， 选取不同浓度的甲醇溶液进行试验 ， 结果 如图 2所示 ， 甲醇浓度为 5 0 时黄曲霉毒素含量值 最大 。 葡 i 栅 抽 楷 黼 魍 粗 甲醇浓度 图2 甲醇浓度对提取结果的影响 3 3 2 提取时间对蚕豆 中黄曲霉毒素提取的影响 甲醇浓度为 8 0 ， 超声功率 为 1 0 0 ， 温度为 3 5 ， 改变提 取 时问 ， 实验 结果 如 图 3所 示 ， 提取 时 间为 6 m i n效果最好 。 i 咖 抽 坩 脚 魍 I砥 图 3提 取 时 I 司对 提 取 结 果 的影 响 3 3 3 温度对蚕豆 中黄曲霉毒素提取的影响 甲醇浓度为 8 0 ， 超声功率为 1 0 0 ， 提取时间 8 m i n ， 改变温度 ， 实验结果如图 4所示 ， 提取温度对 测得 的结果影 响不大 ， 综合经济 因素考虑 ， 选取 2 O 进行提取。 耄 1 揣 嚣 。 钽 粗 图 4温 度 对 提 取 结 果 的 影 响 3 3 4 超声功率对蚕豆中黄曲霉毒素提取的影响 甲醇浓度为 8 0 ， 提取时间为 8 ra i n ， 温度为 3 5 ， 改变功率 ， 实验结果如图 5所示。当超声波提取 功率为 9 0 时提取量和 1 0 0 时提取量差别不大 ， 考虑经济 因素， 选取 9 0 进行提取 。 i 删 抽 桷 楷 楷 钽 姐 图 5 超声功率对提取结果的影 响 西华大学学报 自然科学版 3 4 响应 面分析结果 3 4 1 模 型 方程 的建 立及 显著性 检验 在单 因素试 验结果 基础上 ， 选 取 甲醇 浓度 、 超声 波提取功率 、 提取时间三个因素做 3因素 3水平共 1 5个试验点( 3个 中心点 ) 的响应面分析试验。这 1 5 个试验点可分为两类： 其一是析因点， 自变量取 值在各因素所构成的三维顶点 ， 共有 1 2个析因点 ； 其二是零点， 为区域的中心点 ， 零点试验重复 3次 ， 用以估计试验误差 。以测得黄曲霉毒素含量为响应 值 ( 指标值) ， 结果见表 4 。 表 4 B o x - B e h n k e n设计试验结果 利用 D e s i g n E x p e r t 软件对上述结果进行分析 ， 得黄曲霉毒素含量( Y ) 对 甲醇浓度 ( ) 、 提取时间 ( B ) 、 超声波提取功率( c ) 的二次多项回归方程为 Y= +2 03 +2 0 0 0E 一0 0 3 A +0 0 2 7 ： l： B + 0 0 3 3 C +5 0 0 0E 一0 0 4 ： l： A B 一0 01 6 斗 ： A ：l： C +4 5 0 0E 一0 0 3： I= B C 一0 0 5 8 ：= A20 1 1 B2 0 0 3 0 C2 由方差分析结果可知， 实验所选用模型 P值为 0 0 3 2 1 ， 显著( P 0 0 5 ) 。决定系数 R = 0 9 1 4 4， R 越接近 1 ， 说明此模型越能预测其响应值； 变异系数 C V =一 0 3 6 6 2较低， 变异系数的大小是说明精 确度的问题 ， 其越高实验 的可靠性越低； 信噪比 S N 大于4是合意的， 黄曲霉毒素量信噪比为 6 6 1 9 ， 有很 强的信号。综上 ， 该模型能很好解释响应面的变化。 3 4 2 测得黄曲霉毒素含量的响应面分析 响应面图形是响应值对各试验 因子 X 1 、 X 2、 X 3 所构成的三维空间的曲面图， 从 响应面分析图上形 象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用。当特 征值均为正值时， 响应面分析图为山谷形曲面 ， 有极 小值存在； 当特征值为负值时 ， 为山丘 曲面， 有极大 值存在 ； 当特征值有正有负时 ， 为马鞍形曲面 ， 无极 值存在 ， 根据回归方程作不同因子的响应 面分析 图， 结果见图 6至图 8 。 黄曲霉毒素含量 1 0 O O 5 O 0 0 O 0 5 0 1 0 0 甲醇浓度 A 图 6 甲醇浓度与提取时间对黄曲霉毒素提取影响 的响应面图及等高线图 1 0 0 0 5 0 褂 0 0 0 一0 5 O 一 1 0 0 里 1 缸 籍 磐 掘 黄曲霉毒索含量 甲醇浓度 A 图7 甲醇浓度与超声波提取功率对黄曲霉毒素 提取影响的响应面图及等高线图 1 0 O 0 1 L 日厦曾 第 1期 靳学敏 ， 等 ： 蚕豆 中黄曲霉 毒素 B 提取方法 的研究 1 - 2 0 0 5 0 篓0 O 0 盛 葡 i 碰 皤 钿 楷 蝴 钽 姐 0 5 0 1 20 黄曲霉毒素含量 1 O 0 0 5 0 0 2 O 0 5 0 1 O 0 提取时间 B mi n 图 8 提取时间与超声波提取功率对黄 曲霉毒素 提取影响的响应面图及等 高线 图 超声波提取功率为 9 0 时 ， 甲醇浓度和提取时 间对黄曲霉毒素含量测定的交互作用见 图 6 。在低 浓度和高浓度 甲醇条件下 ， 必须要 比较长的提取时 间才能测得一个较高的黄 曲霉毒素含量 ； 而在 中问 浓度 甲醇条件下 ， 提取时间在 5 5 6 5 ra i n之间能 够测得较高的黄曲霉毒素含量。从而进一步证明对 于黄曲霉毒素的提取 ， 宜用中间浓度的甲醇。 提取时间为 6 m i n时， 甲醇浓度 与超声波提取 功率对测得 的黄 曲霉毒 素含量的交互作用见图 7 。 甲醇浓度和超声提取功率交互作用显著， 因为等高 线的形状反应交互作用的强弱 ， 圆形表示两因素交 互作用不显著， 而椭圆形或马鞍形则表示两个 因素 交互作用显著。在等高线的圆心处有极值存在 。超 声波提取功率对黄曲霉毒素测得含量的影响最为显 著 ， 表现为曲线较陡， 在 9 0 处左右有极值点 ； 甲醇 浓度对黄曲霉毒素测得 的含量影响不是很大 ， 表现 为曲线较为平滑 ， 在 5 0 左右有极值点。 甲醇浓度为 5 0 时 ， 提取时间与超声提取功率 的交互作用显著。超声提取功率低时 ， 可 以通过增 加提取时间来提取 出较多的黄曲霉毒素， 超声提取 功率较大时， 提取时间在 5 5 6 5 ra i n范 围内能测 得 较大 的黄 曲霉毒 素含量 。 3 4 3 黄曲霉毒素最佳提取条件参数的优化 由响应面分析知 ， 甲醇浓度 和提取时问对黄曲 霉毒素提取量的影响不是很大 ， 超声提取功率的影 响较为显著 ， 超声提取 功率在 9 0 左右有极 大值。 选取最大的黄 曲霉毒素提取量 ， 用 d e s i g n e x p e r t 软 件进行分析 ， 选取黄曲霉毒素提取量大于 2 0 4 g k g的项 ， 见 表 5 。 表 5 回归模型优化的提取工艺参数 从表 5可以看出 ， 黄曲霉毒素含量在 2 0 4 g k g以上的条件 ： 甲醇浓度 4 9 9 0 5 0 3 5 ； 提取 时间： 6 0 96 2 2 rai n ； 超声波提取功率 ： 9 5 。 2 9 7 1 ， 优化出3组黄曲霉毒素提取工艺参数。 4 结论 以郫县豆瓣主要加工原料蚕豆为研究对象 ， 针对 蚕豆的特性特点 ， 分别考察了不同超声波提取时间， 不同超声波提取功率下 ， 不同浓度的甲醇对黄曲霉毒 素 B 分离检测效果 的影 响， 并用响应面设计探讨了 不同条件的交互作用 ， 优化出了最佳工艺参数的范 围。充分考虑了实验 的可操作性 、 时效性及经济性 ， 样品经过 c 。 固相萃取小柱净化 ， 能够有效地去除杂 质对实验结果的影响， 使检测结果更为可靠 ； 超声波 辅助提取方法有效地解决 了蚕豆与提取液溶解性的 问题 ， 大大缩短了提取时间， 提高了检测效率 ， 整个检 测时间可缩短至 4 0 m i n 。整个研究对于采用高效液 相法分析检测郫县豆瓣原料蚕豆中黄曲霉毒素 B 提 供了一个简便 、 准确、 可靠 、 重复性好的分析方法。 参考文献 1 肖良 ， 邢卫锋 黄曲霉毒 紊的危害与控制 J 世界农 业 ， 2 0 0