咖啡酸对紫玉米花色苷的辅色作用研究.pdf

2010, Vol. 31, No. 05食品科学基础研究58 咖啡酸对紫玉米花色苷的辅色作用研究 慕 妮，吴海浩，顾颖娟，范龚健，杨振东，顾振新 * (南京农业大学食品科技学院，江苏 南京 210095) 摘 要：研究咖啡酸对紫玉米花色苷溶液的吸收光谱、颜色和花色苷组分的影响。结果表明，添加咖啡酸后， 花色苷溶液的颜色加深，最大吸收峰发生蓝移，这表明咖啡酸对紫玉米花色苷具有辅色效应。热稳定性实验结果 表明，添加咖啡酸能抑制花色苷因热褪色的速率，而增加花色苷褪色反应的半衰期和活化能。经高效液相色谱 / 电 喷雾质谱联用技术检测结果表明，咖啡酸对紫玉米花色苷的辅色作用是通过咖啡酸与不同的花色苷发生加成形成矢 车菊素-3-葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚、天竺葵素-3-葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚和芍药素-3-葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚等花 色苷衍生物而实现的。 关键词：紫玉米；花色苷；咖啡酸；辅色作用 Color Enhancing Effect Caffeic Acid on Purple Corn Anthocyanins MU Ni，WU Hai-hao，GU Ying-juan，FAN Gong-jian，YANG Zhen-dong，GU Zhen-xin* (College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China) Abstract ：The effect of caffeic acid on absorption spectrum, color and composition of anthocyanins extracted from purple corn cobs were investigated. Results showed that caffeic acid resulted in the increase of color intensity and the blue-shift of maximum absorption peak of anthocyanin solution. This suggests the color enhancing effect of caffeic acid on anthocyanins. Thermal stability experiments also exhibited that caffeic acid could inhibit the fading rate of anthocyanins, and increase their half- life and activation energy. High performance liquid chromatography- electrospray ionization mass spectrometry (HPLC/ESI-MS) analysis results demonstrate that the color enhancing effect of anthocyanins is achieved via the production of cyanidin-3-glucosede- vinylcatechol, pelargonidin-3-glucosede-vinylcatechol and peonidin-3-glucosede-vinylcatechol as a result of addition reaction between cafeic acid and anthocyanins. Key words：purple corn；anthocyanin；caffeic acid；color enhancing effect 中图分类号：TS201.2 文献标识码：A 文章编号：1002-6630(2010)05-0058-05 收稿日期：2009-06-04 基金项目：国家大学生创新性实验计划项目(GJ0822)；江苏省教育厅普通高校研究生创新计划项目(CX07B-180z) 作者简介：慕妮(1986 )，女，本科生，研究方向为食品质量与安全。E-mail：mini_009 * 通信作者：顾振新(1956 )，男，教授，博士，研究方向为农产品贮藏加工。E-mail：Guzx 花色苷的颜色和稳定性除受花色苷本身的结构、浓 度影响外，还可受辅色剂、酶、抗坏血酸、糖及其降 解产物、二氧化硫，以及光、热、氧、p H 值、金 属离子等因素的影响1。Darias-martin 等2首次发现，在 葡萄酒生产时，酵母发酵前添加120mg/L 的咖啡酸和儿 茶酚均能使葡萄酒颜色增强，而添加咖啡酸的葡萄酒颜 色强度是添加儿茶酚的 6 倍，说明葡萄酒的颜色不仅仅 受花色苷含量影响，更重要的是受辅色素的种类和含量 的影响。近年来，研究最多的是小分子酚酸对花色苷 稳定性的影响。研究报道3表明，咖啡酸是理想的辅色 剂，这些研究主要是针对葡萄酒中的辅色现象，而对 模拟体系下的辅色研究较少，紫玉米花色苷的辅色作用 研究国内外尚未见报道。 辅色素是一类可与花色苷之间通过分子堆积、氢 键、络合、共价结合等作用而使花色苷稳定的物质， 如黄酮类、类黄酮、有机酸、金属离子等，这些物 质广泛存在于植物中4-5。近年来在花色苷溶液中添加辅 色素以提高其对 pH 值增加、热和光等稳定性受到重 视。实验研究了水体系中咖啡酸对紫玉米花色苷颜色稳 定性的影响，通过质谱分析辅色剂是否与花色苷发生化 学结合反应，形成新的花色苷衍生物，为紫玉米花色 苷在食品工业中的应用提供参考。 1材料与方法 59基础研究食品科学2010, Vol. 31, No. 05 1.1材料与试剂 紫玉米购于山西省忻州丰园食品有限公司。 大孔树脂 HP-10 西安蓝晓有限公司；咖啡酸(纯度 为 99%) 国药集团化学试剂有限公司；乙腈 (色谱纯)、 冰醋酸(优级纯)，其余试剂均为分析纯，均购自南京化 学试剂有限公司。 1.2仪器与设备 UV-2802紫外-可见分光光度计 美国尤尼科公司； CR-400 色差计 日本柯尼卡美能达公司；Waters 2690 高效液相色谱-质谱联用仪 美国Waters 公司。 1.3方法 1.3.1紫玉米花色苷制备 紫玉米芯干样(100g)粉碎后，用 5L 酸化乙醇溶液 (95%乙醇与 1mol/L盐酸体积比85:15)于4下浸提24h， 过滤。滤液经真空旋转蒸发器除去乙醇，得到100mL 紫 玉米花色苷浓缩液。浓缩液经200g HP-10 大孔树脂吸附 后，用 1L 蒸馏水不断冲洗大孔树脂，除去糖、无机 盐等杂质，再经 500mL 乙醇，洗脱液浓缩除去乙醇后， 得到浓缩液 100mL，再经200mL乙酸乙酯萃取除去的脂 溶性物质后，花色苷溶液经真空旋转蒸发除去残留的乙 酸乙酯后得到紫玉米花色苷浓缩液(45mL)，于 4下贮 藏备用。 1.3.2咖啡酸对紫玉米花色苷辅色效应观察 取紫玉米花色苷浓缩液1mL，分别加入不同体积的 0.08mol/L咖啡酸溶液，使得辅色剂与花色苷浓缩液的体 积比为1:1、2:1、3:1，再用pH4.0 的柠檬酸-磷酸氢二 钠缓冲液定容至 10mL，振荡15min后置于室温下暗处静 置2h。用 UV-2802 紫外-可见分光光度计扫描紫玉米花 色苷浓缩液和加入咖啡酸的溶液在波长450650nm范围 内可见吸收光谱并确定其最大吸收波长。计算辅色后的 花色苷溶液最大吸收峰与对照间的差值 max和辅色后 的最大吸光度与对照间的差值Amax。 1.3.3花色苷色泽热稳定性测定 取紫玉米花色苷浓缩液1mL， 加入3mL 0.08mol/L的 咖啡酸溶液，用 pH4.0 的柠檬酸 -磷酸氢二钠缓冲液定 容至10mL，振荡15min 后置于室温下暗处静置 2h 进行 辅色反应。各取 3 份紫玉米花色苷浓缩液和辅色反应液 置于不同温度(70、80、90)的水浴中加热，每隔30min 取样。样品置于冰浴中迅速冷却，测定其吸光度变化， 按照阿伦尼乌斯公式计算花色苷热降解动力学参数(半衰 期、活化能和反应速率常数)。以不添加辅色剂的紫玉 米花色苷溶液为对照。 1.3.4花色苷色泽贮藏稳定性测定 取紫玉米花色苷浓缩液1mL， 加入3mL 0.08mol/L的 咖啡酸溶液，用 pH4.0 的柠檬酸 -磷酸氢二钠缓冲液定 容至10mL，振荡15min后用色差计CR400测定辅色溶液的 饱和度和色调角。在室温下暗处放置60d 后再测定一次。 1.3.5咖啡酸与紫玉米花色苷加成产物分析 参照樊金玲等6方法并加以改进。具体的辅色条件 参见1.3.3 节。辅色后的紫玉米花色苷溶液经 0.45m 膜 过滤后上样，采用RP-C18柱(4.6mm 250mm)进行高效 液相色谱/ 电喷雾质谱(WATERS Platform ZMD 4000)联 用技术检测。洗脱液 A 为乙腈，B 为 10% 冰乙酸，流 速为 1mL/min，进液量为 20L，检测波长为 520nm。 线性梯度洗脱顺序为：015min，A 液由10% 20%； 1540min，A 液由20% 30%。电喷雾质谱毛细管温 度 195电压 4kV，分别以正负离子两种模式检测，雾 化压力为2.33 105Pa，氮气流速为1.2mL/min。 1.4数据处理 实验设 3 次重复，结果以平均值标准偏差表示。 数据用软件 SAS6.0 分析。 2结果与分析 2.1咖啡酸对紫玉米花色苷可见光吸收特征的影响 紫玉米花色苷浓缩液1mL，分别加入 1、2、3 倍体积的 0.08mol/L 咖啡 酸溶液，对应的光谱曲线分别为 2、3、4，图中光谱曲线 1 为对照， max分别为4、7、10nm，对应Amax分别为0.098、0.135、0.136。 图1 紫玉米花色苷经咖啡酸辅色后的可见光光谱 Fig.1 Visible absorption spectra of purple corn anthocyanins with different amounts of caffeic acid 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 1 A 波长/nm 450500550600650 2 3 4 由图 1 可知，紫玉米花色苷溶液添加 1、2、3 倍 体积的咖啡酸溶液后最大吸收峰均发生蓝移效应(4 10nm)，其最大吸光度比对照增加了10.73%35.88%。 这说明咖啡酸和花色苷发生了辅色效应，可能有新的花 色苷衍生物生成。添加 2 倍与 3 倍体积咖啡酸溶液后， 紫玉米花色苷溶液的吸光度之间差异不显著，但咖啡酸 溶液比例越大，紫玉米花色苷溶液的蓝移效应越明显。 本实验中制备的紫玉米花色苷溶液浓度是一定的，当添 加 2 倍体积的咖啡酸溶液后紫玉米花色苷可能完全辅 色，因此再增加咖啡酸浓度对紫玉米花色苷溶液的增色 无显著作用。 2.2咖啡酸对花色苷色泽热稳定性的影响 对紫玉米花色苷色泽热稳定性的研究结果(表 1)表 2010, Vol. 31, No. 05食品科学基础研究60 明，花色苷在热作用下腿色的速率常数随着加热温度的 增加而增加，而色泽(以吸光度表示)减退的半衰期快速 缩短。由此可见，加热温度越高，花色苷色泽腿色越 显著。同温度下添加咖啡酸后的花色苷腿色速率常数显 著低于对照，色泽减退的半衰期则高于对照。添加咖啡 酸后紫玉米花色苷腿色反应的活化能(Ea)达到81.7kJ/mol， 显著高于未添加咖啡酸时的活化能76.9kJ/mol，即紫玉 米花色苷经咖啡酸辅色后其色泽的热稳定性得到很好的 改 善 。 处理温度/速率常数/h-1半衰期t1/2/hEa/(kJ/mol) 700.03023.1 辅色前800.0808.776.9 900.1325.2 700.02133.2 辅色后800.06810.381.7 900.1016.6 表1 咖啡酸对紫玉米花色苷色泽热稳定性的影响 Table 1 Effect of caffeic acid on the thermal stability of purple corn anthocyanins 处理 饱和度C* 色调角h /( ) 0d60d0d60d 辅色前16.77 0.18b12.83 0.11c23.98 0.18a46.87 0.16a 辅色后30.33 0.50a24.30 0.38a20.00 0.15b43.05 0.18b 表2 咖啡酸对紫玉米花色苷色泽贮藏稳定性的影响 Table 2 Effect of caffeic acid on the color stability of purple corn anthocyanins during storage 注： 同一列不同字母表示差异显著，P0.05。 2.3咖啡酸对紫玉米花色苷色泽贮藏稳定性的影响 紫玉米花色苷溶液添加咖啡酸后饱和度显著增加， 而色调角则低于对照(表2)，这表明咖啡酸能增加紫玉米 花色苷溶液中的呈色物质含量，并且使花色苷溶液变的 更红。经过 60d 贮藏后，对照和处理的饱和度均发生下 降，溶液中的呈色物质降解，但添加咖啡酸处理后的 饱和度仍显著高于对照处理。紫玉米花色苷溶液在贮藏 过程中的色调角呈增加趋势，添加咖啡酸后的紫玉米花 色苷溶液色调角显著小于对照处理。 2.4咖啡酸对紫玉米花色苷的辅色机理初探 由图 2 可知，添加咖啡酸的紫玉米花色苷中主要 存在5 种花色苷，辅色后模拟体系中检测得到 3 种新的 花色苷衍生物存在，其出峰时间分别为 28.53、30.62、 31.41min。 70 60 50 40 30 20 10 0 mAU 时间/min 102030 A1 2 3 4 5 A.未加咖啡酸辅色；B.咖啡酸辅色。 图2 咖啡酸辅色前后紫玉米花色苷溶液液相色谱图 Fig.2 HPLC chromatogram of purple corn anthocyanins with and without caffeic acid 4 3 2 1 0 mAU 时间/min 102030 B 1 2 3 a.b.c 分别为图 2A 中峰 1、2、3 组分的离子图谱。 图3 紫玉米花色苷组分鉴定离子图谱 Fig.3 MS spectrum of purple corn anthocyanins 100 相对丰度/% m/z 20040060080010001200 a 0 287 276 245 317 363376 449 450 532612642743 913937 1003107911721285 100 相对丰度/% m/z 20040060080010001200 b 0 271 317 433 432 434 493 494 500 541 688 7667848449901038 1120 1159 12791299 100 相对丰度/% m/z 20040060080010001200 c 0 463 235 276 301 316 459 347 464 542 613 732745 84888110931121 12271289 采用高效液相色谱 -电喷雾质谱联用技术对紫玉米 花色苷进行结构解析。从质谱中获得紫玉米花色苷组分 总的正离子谱，然后对此进行正离子的结构解析。如 61基础研究食品科学2010, Vol. 31, No. 05 图 3 所示，紫玉米花色苷中 1、2、3 号花色苷的正离 子质谱图中均存在两个离子片段，分子质量分别为 287 和 449(图 3a)，271 和433(图3b)，301 和463(图3c)。同 一质谱图中的离子片段分子质量相差 162，为一分子去 水后的六碳糖分子量。参照Phenolic 等7对紫玉米花色 苷的报道，可判断该紫玉米醋中检测到的花色苷分别为 矢车菊 -3-葡萄糖、天竺葵-3-葡萄糖和芍药 -3-葡萄糖。 经咖啡酸辅色后，紫玉米花色苷衍生物主要有 3 种，其正离子如图 4 所示。图 2B 中峰 1 的正离子片断 分子质量为 419(图4a)，正好为矢车菊素在C4和C5位和 咖啡酸加成后的吡喃花色素母核，正离子分子质量为 581，两者相差 162，为 1 个脱水葡萄糖分子，推断为 矢车菊素-3-葡萄糖苷和咖啡酸在C4和C5位发生加成反 应后形成的花色苷衍生物；图2B 中峰 2 的正离子片断 分子质量为403(图4b)，正好为天竺葵素在C4 和 C5 位 和咖啡酸加成后的吡喃花色素母核，正离子分子质量为 565，两者相差 162，为 1 个脱水葡萄糖分子，推断为 天竺葵素-3-葡萄糖苷和咖啡酸在C4和C5位发生加成反 应后形成的花色苷衍生物；图2B 中峰3的正离子片断 分子质量为433(图4c)，正好为芍药素在C4和C5位和咖 啡酸加成后的吡喃花色素母核，正离子分子质量为 595，两者相差 162，为 1 个脱水葡萄糖分子，推断为 芍药素-3-葡萄糖苷和咖啡酸在C4和C5位发生加成反应 后形成的花色苷衍生物(图 5)。 3讨 论 花色苷与某些物质的分子存在辅色作用，可提高花 色苷稳定性，这些辅色物质有很多种类，如黄酮类物 质、氨基酸、有机酸和生物碱4 。它们通常含有的丰 富电子，可与 2-苯基苯并吡喃阳离子作用，保护花色 苷母核免遭水分子的亲核攻击8。紫玉米花色苷溶液中 添加咖啡酸后，花色苷溶液发生了增色效应和蓝移效 应，即花色苷溶液的色强增加，而最大吸收峰发生了 蓝移。这表明了咖啡酸对紫玉米花色苷的辅色效应。在 贮藏过程中加咖酸对紫玉米花色苷也有辅色作用。 辅色现象在葡萄酒中研究的较为广泛。Morata 等9 认为在葡萄酒中酵母分泌的肉桂酸脱羧酶只能对香豆酸 和阿魏酸完成脱羧基作用，而对咖啡酸和芥子酸的羧基 无法脱除。Schwarz 等10研究了乙烯基儿茶酚和锦葵素 - 3-葡萄糖苷的反应，咖啡酸和锦葵素 -3-葡萄糖苷能直 接反应生成羟苯基吡喃花色苷。他们认为这种直接的反 应需要对羟基肉桂酸芳香环上的电子发生转移，才能形 成稳定的碳正离子形式，即咖啡酸、香豆酸、阿魏酸 和芥子酸也能直接和花色苷反应。这在本研究中也得到 了证实。本研究结果证明了紫玉米花色苷也能和咖啡酸 发生辅色作用，提高了花色苷在贮藏过程中的稳定性。 通过液相色谱图发现经咖啡酸辅色后的紫玉米花色苷生 成了3 种花色苷衍生物，分别为矢车菊素-3-葡萄糖苷 - 乙烯基儿茶酚、天竺葵素-3-葡萄糖苷-乙烯基儿茶酚和 芍药素 -3-葡萄糖苷 -乙烯基儿茶酚。 图5 咖啡酸辅色后的紫玉米花色苷衍生物结构 Fig.5 Structure of derivatized purple corn anthocyanins deriva- tives with caffeic acid OH OCH3 O O O O OH OH OH OH OH OH 峰3 OH O O O OH OH O OH OH OH 峰2 OH OH 峰1 O O O O OH OH OHOH OH OH OH a、b、c 分别为图 2B 中峰 1 、2 、3 组分的离子图谱。 图4 紫玉米花色苷衍生物( 辅色后) 组分鉴定离子图谱 Fig.4 MS spectrum of derivatized purple corn anthocyanins with caffeic acid 100 相对丰度/% m/z 20040060080010001200 a 0 276 284419 531 580 581 581 615684698773937959106911911217 1297 100 相对丰度/% m/z 20040060080010001200 b 0 223 264 297 317 327 403 541 506 565 627648 707773895 9691114 1214 1226 1294 100 相对丰度/% m/z 20040060080010001200 c 0 233277 408474542 594 595 596 607681812 901 9671035 11381186 1248 908 2010, Vol. 31, No. 05食品科学基础研究62 参考文献： 1FRANCIS F. Food colourants: AnthocyaninsJ. Critical Reviews in Food Science and Nutrition, 1989, 28(4): 273-314. 2DARIAS-MARTI N J, CARRILLO M. Enhancement of red wine colour by pre-fermentation addition of copigments J. Food Chemistry, 2001, 73(2): 217-220. 3DARIAS-MARTI N J, MARTI N-LUIS B, CARRILLO-LOPEZ M, et al. Effect of caffeic acid on the color of red wineJ. Journal of Agri