嗜酸乳杆菌S-层蛋白表面展示系统的构建及酶切位点分析.pdf

安徽农业科学 。 J o u rna l o fA n h u i Ag r i S c i 2 0 1 1 。 3 9( 3 0 】 ： 1 8 4 2 11 8 4 2 3 。 1 8 4 3 4 责任编辑郑丹丹责任校对况玲玲 嗜酸乳杆菌 S 一 层蛋 白表面展示 系统的构建及酶切位点分析 刘琼 ， 王 春凤 ， 杨 桂连 ， 秦守 涛 ， 刘 曼 ( 1 吉林工 程技术 师范学 院食 品工程学 院， 吉林长春 1 3 0 0 5 2 ； 2 吉林农业大学动物科学技术学院 ， 吉林长春 1 3 0 1 1 8 ) 摘要 目的 克隆和表达嗜酸乳杆菌 s 一 层蛋白基 因， 用其构建能承载外源抗原表位 的乳酸茵细胞表面展示系统。 方法 以染色体 D N A为模板克隆 s - 层蛋 白基因s ， 通过酶切、 连接将其插入大肠杆菌 一 乳酸茵穿梭表达载体 p W4 2 5 e t ， 构建表面展示系统 p W 4 2 5 e t - S ， 并对酶切位点进行分析。I 结果 将 p W4 2 5 e t S转化入 t h S a基 因缺 陷型 E c o l i X 1 3感受 态细胞 ， S D S P A G E 、 We s t e r n b l o t t i n g 、 全细胞 E L I S A检测表明， 在重组菌表面表达出S 层蛋白， 构建出表面展示系统， 确定B s t E I I 作为融合外源保护性抗原基因的酶切位点。 结论 克隆出嗜酸乳杆菌s 一 层蛋白基因， 成功构建表面展示系统 p W 4 2 5 e t S ， 为开发乳酸茵活载体口服活茵疫苗提供了可行性操作平台。 关键词嗜酸乳杆菌； S - 层蛋白； 表面展示系统 中图分类号S 1 8 8 文献标识码A 文章编号o 5 l 7 6 6 1 1 ( 2 0 1 1 ) 3 0 1 8 4 2 1 0 3 Th e Co n s t r u c t i o n o f S - La ye r Pr o t e i n Su r f a c e Di s p l a y S y s t e m o f L a c i do p hi l us a n d t he An a l y s i s o n Re s t r i c t e d En z y me S i t e s L I U Qi o n g e t a l ( C o l l e g e o f F o o d E n g i n e e ri n g ， J i l i n T e a c h e r s I n s t i t u t e o f En g i n e e r i n g T e c h n o l o g y ， C h a n g c h u n ， J i l i n 1 3 0 0 5 2 ) A b s t r a c t f O b j e c t i v e T h e a i m w a s t o c l o n e a n d e x p r e s s S - l a y e r p r o t e i n g e n e o f L a c i d o p h i l u s t o c o n s t r u c t a n o v e l e x p r e s s i o n s y s t e m c a p a b l e o f l o c a t i n g ant i g e n m o l e c u l e s o n t h e c e l l s u rf a c e o f L a c t o b a c i l l u s M e t h o d e A g e n e i n c l u d i n g N t e r m i n a l s i g n a l s e q u e n c e ， v a r i a b l e d o m a i n and C t e r mi n a l d o ma i n a n c h o r s s e q u e n c e wa s a mp l ifie d v i a P CR f r o m g e n o me e x t r a c t o f t h e L a c i d o p h i l u s Th i s s e q u e n c e wa s d i g e s t e d a n d l i g a t e d i n t o a l l最 c o l i L a c t o b a c i l l u s s h u t t l e s e c r e t i o n v e c t o r pW4 2 5e t a n d a e e l l s u rfa c e d i s p l a y s y s t e m c all e d p W4 2 5 e t S was o b t a i n e d wi t h a r e s t ric t i o n e n d o n u c l e a s e r e c o gni t i o n s i t e qual i f y i n g f o r i n t e g r a t i o n o f e x o g e n o u s g e n e s R e s u l t R e c o m b i n a n t p W 4 2 5 e t S w a s t r a n s f o r me d i n t o c o m p e t e n t c e l l E c o l X1 3 w h i c h t h y mi d y l a t e s y n t h e t ase( T h y A)w a s d e f i c i e n c y S D S P AG E a n d We s t e rn b l o t t i n g a n a l y s i s we r e u s e d t o d e t e c t t h e e x p r e s s i o n c o nd i t i o n o f S l a y e r p r o t e i n S 1 a y e r p r o t e i n o f L a c i d o p h i l u s wa s e x p r e s s e d b y r e c o mb i n a n t a n d t h i s p r o t e i n c a n b e d e t e c t e d b y wh o l e c e l l ELI S A C o n c l u s i o n S 1 a y e r p r o t e i n g e n e o f L a c i d o p h i l u s w a s c l o n e d and s u r f a c e d i s p l a y s y s t e m p W4 2 5 e t - S w a s c o n s t r u c t e d a n d t h a t v e c t o r c a n b e u s e d a s an a p p l i c a b l e o p e r a t e p l a tf o r m for e x p l o i t a t i o n o f L a c t o b a c i l l u s v i v i v e c t o r o r a l v a c c i n e Ke y wo r d s L a c i d o p h i l u s： S l a y e r p r o t e i n： S u r f a c e d i s p l a y 许多古细菌和真细菌细胞外部都存在一层表面结构， 称 为表面层 ( S u rf a c e l a y e r s ) 或 S 一 层蛋 白( S - l a y e r p r o t e i n ) ， 其 由 单一蛋 白质或糖蛋白亚单位组成并有规则地排列在细胞膜 或细胞壁外， 是生物进化过程 中最简单 的一种生物膜 。 目前发现乳酸菌的许多种属都含有 s 层蛋白( 4 3 4 6 k D) 。 氨基酸序列分 析表 明， 嗜酸乳杆菌 S 一 层蛋 白含有 2个保守 区， 一个为 N 一 末端信号序列， 大约 由3 O 个氨基酸组成， 另一 个为 c 末端区域 ， 大约 由 1 2 3个氨基酸组成 ， 能使蛋白锚定 在细胞表面 ， 在 2 个保守区之间是可变 区， 此可变区介 导 S 层蛋 白与活体外 组织结 合， 参 与 S 一 层 蛋 白折 叠 和结 晶 。S 层蛋白表达量高， 其启动子的转 录效率高， 信号肽 引导的分泌效率高 ， 被广泛应用于构建高效表达载体或分泌 表达载体。因此， 利用乳杆菌的 S 一 层蛋白作为携带外源抗原 的运载工具， 构建出一个 良好的乳酸菌表面展示系统， 将抗 原定位表达于细胞表面， 不仅可以使抗原直接暴露于黏膜， 便于免疫辅助成分的参与 ， 也能够减弱抗原的蛋白酶或 胃酸 降解 J ， 因而无需外加免疫佐剂就 可诱发宿主产生免疫保 护 ， 这种近年来新兴的疫苗策略， 受到 国内外学者的广泛关 注和积极投入。 笔者 旨在克隆嗜酸乳杆菌 S 一 层蛋 白基因( S l p A ) ， 并构建 出表面展示系统 p W4 2 5 e t S ， 在胸苷酸合成酶缺陷型 E c o l i X 1 3 表达此蛋 白， 为利用乳酸菌构建细胞表面展示系统、 开 基金项 目 作者简介 收稿 E t 期 国家“ 8 6 3 ” 计 划项 目( 2 0 0 7 A A1 0 Z 3 2 2； 2 0 0 6 A A l O A 2 0 5 ) ；国 家 自然科 学基金项 目( 3 0 6 7 1 5 7 3； 3 0 7 0 0 6 0 2 ； 3 0 8 7 0 1 1 6 ) ； 吉林 省科技发展计划项 目( 2 0 0 8 0 1 0 4) 。 刘琼 ( 1 9 8 0一 ) ， 女 ， 吉林松原人 ， 助教 ， 硕 士， 从事 动物微 生 物免 疫学与 分子 生物 学研 究 ， E m a i l ： q i o n g l i u - 8 1 6 3 c o m。 通讯作者， 教授， 博士， 从事动物微生物免疫学与分子生 物 学研究 ， E - ma i l ： w a n g c h u n f e n g j l a u e d u ， c n 。 2 O1 1 - 0 7 1 8 发乳酸菌活载体 口服活菌疫苗 的研究及工业化生产奠定理 论基础。 1 材料与方法 1 1 材料 1 1 1 质粒与菌株。质粒 ： T h y A基因和红霉素基 因为选择 压力的 p W 4 2 5 e t 载体， 由王春风教授构建， p M D 1 8 - T V e c t o r 购自T a K a R a 公司； 菌株 ： 嗜酸乳杆菌 ( L a c t o b a c i l l u s a c i d o p h i l u s A T C C 4 3 5 6 ) 购 自中国普通微生物菌种保藏管理中心， E c o l i J M 1 0 9 、 E c o l i X 1 3由吉林农业大学动物科学技术学院动 物微生态学研究室保存 。 1 1 2 试剂。E x r a q D N A聚合酶 、 d N T P s 、 L i g a t i o n M i x 、 核酸 分子量 M a r k e r 为 T a K a R a 公司产品； 限制性内切酶( S a c I 、 n I ) 、 T d D N A l i g a s e 为 P r o m e g a 公司产品； 琼脂糖为 S p a n i s h 公 司产品； 低分子量蛋白质标准为天根生化产品； P V D F转移膜 为 G l e ma n公司产品。 1 1 3 仪器。L i f e E x p r e s s P C R仪 ， S I G M A 3 K 3 0低温超速离 心机 B i o R A D凝胶成像 系统 ， D Y Y - 6 B型稳 压电泳仪， B i o R A D M o d e l 6 8 0酶标仪， U - 3 4 0 0分光光度计( H i t a c h i 公司) 。 1 2 方法 1 2 1 嗜酸乳杆菌基因组 D N A的提取。乳酸杆菌培养物 D D 6 0 0 达到 0 6 - 0 8 ， 4、 8 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n ， 收集菌 体 ， 加入 0 7 m l T E 、 0 1 m l 1 0 m rm l 溶菌酶， 4 o作用 1 h ， 再加入 1 0 S D S 0 1 m l ， 混匀 ， 4 0作用 1 h 后 ， 4 o C、 6 0 0 0 r m i n 离心 1 0 m i n ， 吸取上清 0 5 r I l l ， 然后加入 R N A酶使其 终浓度为 2 0 g r n l 。3 7水浴 3 0 ra i n 后加入 1 6 体积的醋 酸钾 ， 冰浴 1 5 m i n ， 1 2 0 0 0 r ra i n 离心 1 0 m i n ， 吸取上清用等 体积的氯仿： 异戊醇( 2 4 ： 1 ) 抽提 1 次， 取上清加入 1 1 0 体积 3 m o l L 醋酸钠和 2倍体积无水乙醇 ， 一2 0沉淀 3 0 ra i n ， 4 1 8 4 2 2 安徽农业科 学 2 0 1 1盆 、 1 5 0 0 0 r rai n离心 1 5 rai n ， 弃上清， 用 7 0 乙醇洗涤沉淀 ， 室温干燥 ， 溶于5 0 l T E ， 一 2 0保存备用。 1 2 2 大肠杆菌感受态细胞 的制备。E c o l i J M1 0 9 、 E c o l i X 1 3感受态细胞按照常规方法制备 。 1 2 3 S - 层蛋白 S l p A基因的克隆。根据 G e n B a n k已发表的 s 序 列，设 计1对 引 物 (P 1 ： 5 一 G G C G A G C T C A T GAAGAAAAArI T I T一 3 ，P 2： 5 一 GT GGGT ACC Tr AT C T AAAGT T F G 3 ) ， 由T a K a R a 公司合成， 限制性酶切位点分别为 S a c I 和 蜘n I 。P C R扩增 目的基 ， 电泳检测为阳性后， 回收纯 S 2 一 ，设计连接反应体系， 连接 ， 转化 ， 质粒小量提取 ， P C R及酶 切鉴定后送 至 T a K a R a公司测 序 ， 将 阳性 转化 子命 名 为 p MD1 8 T S 。 1 2 3 M O O O b p 注 ： M D I 2 0 0 0 Ma r k e r ， 1 3 S l p A P C R。 No t e： M DI20 0 0 Ma r k e r ， 13 A P CR 图1 s tp a基 因 P CR电泳结果 F i g 1 P CR e l e c t r o p h o r e s i s r e s ul t s o f S lpA g e n e 1 2 4 重组质粒 p W4 2 5 e t S的构建。用 S a c I 和 n 1 分别酶 切 p MD 1 8 一 S和 p W4 2 5 e t ， 以 获 取 粘 末 端 的 s 基 因及 p W 4 2 5 e t 载体片段 ， 同收纯化后连接 ， 转化人 E c o l i X 1 3 感受 态细胞中， 涂布在 L B固体培养基( 不添加胸腺嘧啶核昔 ) 上 培养 ， 筛选阳性重组体。鉴定后的阳性重组质粒和重组菌分 别命名为 p W4 2 5 e t S和 E c o l i X1 3 S 8 。 1 2 5 重组载体 p W4 2 5 e t S的稳定性及酶切位点分析。分 析载体 p W 4 2 5 e t 及S A基因上的酶切位点 ， 并根据 S 一 层蛋白 特点选用 限 制性 内切 酶 B s t E 、 A g E I 、 I 对重 组 载体 p W4 2 5 e t S分别进行酶切分析。 1 2 6 S D S P A G E及 We s t e r n b l o t t i n g分析 。挑取单菌落 接种于 1 0 r n l L B E M培养液， 3 7振摇过夜 ， 取 5 m l 接种于 1 0 0 m l L B培养液 ， 诱导表达， 将各个时间诱导收获的菌液统 一 调 D D 值为0 6 5 ， 取菌液 1 8 r n l ， 4 、 8 0 0 0 r ra i n离心 1 0 ra i n ， 收集菌体， 在沉淀菌体中加入 1 0 0 t x l 0 1 m o l L T r i s H C 1 ( p H 8 0 ) ， 重悬细菌沉淀。加入 1 0 0 l 2 S D S 上样缓冲 液 ， 1 0 0煮沸 1 0 m i n ， 4 冷却。取上清 1 5 l 进行 1 5 S D S P A G E 。表达产物经 S D S P A G E后 ， 以 B i o - R A D系统 电 转移至 P VD F转移膜上 ， 经牛血清 白蛋 白封闭后， 依次加入 乳杆菌 s 一 层蛋白多克隆抗体 、 辣根过氧化物酶标记的羊抗 鼠 I g G， 最后在联苯胺( D AB ) 溶液中显色并观察结果。 1 2 7 用全细胞 E L I S A检测 s 一 层蛋白在大肠杆菌表面的展 示情况。 将 E c o l i X 1 3 空载体和 E c o l i X 1 3 S 8 诱导 8 h的细 胞， 8 0 0 0 r ra i n 离心 1 0 m i n 后， 收集菌体 ， 用 P B S洗 2 次 ， 再 用 P B S按梯度稀释到 D D 6 0 0 分别为 0 2 5 、 0 5 0 、 0 7 5 、 1 0 0、 1 2 5 ， 每孔加 1 0 0 t x l 稀释好的细菌悬液抗原包被 ， 1 B S A封 闭 ， 4过夜 ， 加 鼠抗 S 一 层蛋 白一抗 ， 3 7保持 1 5 h 后 ， 加 H R P羊抗鼠二抗 ， 洗涤后底物显色， 酶标测定仪测定光吸收 值( 0 D 4 9 2 ) 。 2 结果与分析 2 1 S t p A基因的P C R扩增以嗜酸乳杆菌基因组 D N A为 模板 ， P C R扩增 S lp A基因， 在 1 3 5 0 b p附近有一条亮带与预 期的大小相符( 图 1 ) 。 2 2 s p a基因 P C R产物的克隆及阳性质粒的筛选P C R 产物直接进行 T A连接 ， 转化和质粒小量提取的电泳结果见 图2 A， 选取其 中滞后的质粒进行 S a c I 、 K p n I 酶切及 P C R鉴 定 ， 电泳结果见图 2 B、 C 。序列测定结果表 明， 该试验株与 G e n B a n k 发 布 的 ， J a c i d o p h i l u s N C F M 株 同 源 性 最 高 ， 达 9 9 0 ， 氨基酸同源性为 9 9 O 。 1 2 3 1 M 1 M 2 1 2 3 4 5 MI b p b p 注 ： ( A) p MD 1 8 T - S， 其 中 1 3为 p M DI 8 T S ， M 2为 A H i n d I Ma r k e r ； ( B) 酶切鉴定 ， 其中 1为 S a c I K p n I ， M1为 D 2 0 0 0 Mark e r ， M 2为 A Hi n d s Mark e r ；( C) P C R鉴定， 其中 1 为阴性对照 ， 2为阳性对照 ， 3 5为 P C R， MI为 D I 2 0 0 0 Ma r k e r 。 N o t e ： ( A) p MD I 8 T - s ， 1 3 p MD I 8 T S ； ； M 2 一 H i n d Ma r k e r ； ( B )p MD1 8 T S d i g e s t e d， 1 r e p r e s e n t S a c l n l ； M1 D I 2 0 0 0 Mar k e r ， M2 - Hi n d Ma r k e r ；( C )P C R i d e n t i f i c a t i o n ， 1 N e g a t i v e c o n t r o l ， 2 P o s i t i v e c o n t r o l ， 3 5 P C R， M1 ， D L 2 0 0 0 Ma r k e r 图 2 S Ip A基因的克隆及鉴定 Fi g 2 Cl o n e a n d i d e nt i fic a tio n s p a g e ne 2 3 重组质粒 p W4 2 5 e t - S的构建p W 4 2 5 e t 和 p M D 1 8 T S 连接产物转化至 E c o l i X 1 3 感受态细胞中筛选后 ， 小量制备 分别经 S a c I 、 K p n I g 2 酶切后 回收纯化获得载体和 目的基因， 质粒， 将重组阳性质粒双酶切后 ， 电泳得到了约 4 8 0 0 b p的 印 1 ， i 1 ， 7 驼 10hv q12 1 8 4 3 4 安徽农业科学 结果的关键。引物设计的原则是最大限度地提高扩增效率 ， 同时尽可能减少非特异性扩增产物。酶和 M g 2 。酶浓度 过高可引起非特异性扩增 ， 浓度 过低则 合成产物量减少。 M g 是 D N A聚合酶的辅酶 ， 对 P C R扩增的特异性和产量有 显著的影响。同理 ， M g 2 浓度过高， 降低反应的特异性， 易出 现非特异扩增； 浓度过低会降低 V a q酶的活性 ， 使 P C R产量 下降 。反应条件的优化。要严格优化反应条件 ， 使 目的 基因和看家基因同时处于良好的环境下完成定量检测过程。 参 考文 献 1 黄留玉 P C R最新技术原理、 方法及应用 M 2 版 北京： 化学工业出 版社 ， 2 0 1 1 ： 5 2 7 3 2 王镜岩， 朱圣庚， 徐长法 生物化学 M 3 版 北京： 高等教育出版社， 一 2 0 0 2： 7 3 王敏 蛋白质和钙对氟中毒大鼠切牙中C O L 环口 D P P 表达的影响 D 太谷 ： 山西农业大学 ， 2 O 0 8 4 韩天龙 氟中毒对动物牙齿中C O L I 和D P P表达的影响 D 太谷： 山 西农业大学， 2 0 0 8 5 李文涛 工业氟污染对内蒙古绒山羊 C O L 1 A 2和 C O L 2 A1 基因表达的 影响 D 太谷： 山西农业大学， 2 O O 6 6 H A N TL ， WA N GM， Y A NXY， e t a1 D e c r e a s e d e x p r e s s i o n o f ty p eI c o l l a - g e n a n d d e n t i n p h o s p h o p r o t e i n i n t e e t h o f fl u o ms e d s h eep J F lu o ri d e ， 201 0 ， 4 3 ( 1 ) ： 1 9- 2 4 7 WA N GM， H A NT L ， C A O C F ， e t a 1 E ff e c t s o f a l u m i n i u man dfl u o ri d e o n t h e e x p r e s s i o n o f t y p e I c o l l a g e n i n t h e t e e t h o f g u i n e a p i g J F l u o r i d e ， 201 0 ， 4 3 ( 1 ) ： 4 5- 5 1 8 Y A N X Y， Y A N X T， M O R R I S O N A， e t a 1 F l u o ri d e i n d u c e s a p o p t o s is a n d a l t e r s c o l l age n I e x p r e s s i o n in r a t o s t e o b l a s t s J T o x i c o l o g y L e t t e r s ， 201 1 ， 2 0 0 ( 3 ) ： 1 3 31 3 8 ( 上接第 1 8 4 2 3页) 基因的可操作性、 独特的自装配特性及其单分子晶体层的结 构都很有应用前景 ， 目前已经应用在异源蛋白质的分泌性表 达 、 表面展示和纳米科技等方面 。在利用其研制活载体 疫苗方面与其他表面蛋白相比， 用 s 一 层蛋白作为微生物细胞 表面展示的载体蛋白具有无可比拟的优势。首先 ， s 层蛋 白 可有效地与细胞壁结合 ， 已有报道乳酸菌 ( L a c t o b a c i l l u s ) 、 芽 孢杆菌 属 ( B a c i l l u s ) 、 棒 状杆菌 ( C o r y n e b a c t e r i u m) 和嗜热菌 ( T h e r m o b a c t e r i u m ) 的 s 一 层蛋 白存在着许多与细胞壁相结合 的区域 ， 起着在细胞表面锚定的作用； 其次， s 层蛋 白表达量 高 ， 可达细胞蛋白的2 0 ， 并能在细胞生长和分裂的所有阶 段覆盖在细胞表面， 说明 s 层蛋白基因有较强的表达和分泌 系统， 有利于其所携带的外源基因的表达 ， 这使其在各种生 物工程方面应用占有很高的优势 ； 最后， S 一 层蛋 白能容许 外源序列的插入， 尤其是革兰氏阳性菌的蛋白表面展示系统 有着相同或类似的表面锚定机制 ， 允许多达几百个氨基酸的 外源蛋白序列插入 ， 插入的外源序列不明显影响重组 s 层蛋 白的生物合成和表面定位， 而且不明显影响宿主细胞的正常 生长 。 研 究构建 的重组质粒载体 p W 4 2 5 e t S是以红霉 素和 r h y A为选择压力的双标记大肠杆菌 一 乳酸菌穿梭表达载体 p w4 2 5 e t 为基础， 所构建的载体可以用于转化入 S 层蛋白基 因缺陷的乳酸菌内来研究乳酸菌 s 层蛋白形成的机制， 从而 为揭示乳酸菌 s 一 层蛋白的形成及乳酸菌黏附特性机理的分 子机制打下基础； 同时研究该载体上的限制性酶切位点 ， 以 致病性病原微生物的保护性抗原为报告基因， 利用 D N A重 组技术， 将病原体的保护性抗原与乳酸菌 S 一 层蛋 白相融合 ， 把保护性抗原展示在乳酸菌细胞表面， 进而开发新型安全、 绿色的口服疫苗是今后的研究重点。 参考文献 1 I S u Yr R U B M E S S N E R P P U M D， e t a 1 C r y s t al l i n e b a c t e ri a c e l l s u r f a c e l a y e r s( S - l a y e m) ： F r o m s u p r a mo l e e u l a r e e l l s t r u c tu r e t o b i o m i m e t i c s a n d n ano t e c h n o l o g y I J 1 A n g e w C h e mI m E d ， 1 9 9 9 ， 3 8 ： 1 0 3 4 1 0 5 4 2 S A R AM， S E L Y T R U B S - l a y e r p r o te i n s J B a c t e ri o ! ， 2 O 0 0 ， 1 8 2( 4 ) ： 8 5 9 8 6 8 3 I B 0 0 T H J ， P O U WE L S P H E x p r e s s i o n ， s e c r e t i o n a n d ant i g e n i c v a r i a t i o n o f b a c t e ri al S - l a y e r p r o t e i n s 【 J 1 Mo l M i c mb i o l ， 1 9 9 6 ， 2 1 ： 1 1 1 71 1 2 3 1 4【 S L E R u B， B E V E R I D G E T J B a c t e r i al S - l a y e r I J 1 T r e n d s M i c m b i o l ， 1 9 9 9 ， 7： 2 5 32 6 0 I 5 S MI TE O L I N G F ， D E ME LR B e t a1 T h e S l a Nr p r o t e i n o f L a e t o b a e i l l u s a c i d o p h i l u s AT C C 4 3 5 6： I d e n t i f i c a t i o n a n d c h a r a c t e r i s a t i o n of d o ma i n s r e s p o n s i b l e f o r S - l a y e r p r o t e i n a s s e m b l y a n d c e l l w all b i n d i n g J