焦亚硫酸钠对雄性小鼠睾丸染色体的影响.pdf

江苏农业科学2 0 1 1 年第 3 9卷第 2期 赵 坚华 ， 金铁 岩， 权伍荣焦亚硫酸钠对雄性小 鼠睾丸染色体 的影响l J 江 苏农 业科学 ， 2 0 1 1 ， 3 9 ( 2 ) ： 4 4 3 4 4 5 焦亚硫酸钠对雄性小 鼠睾丸染色体的影响 赵 坚华， 金铁岩 ， 权伍荣 ( 延边大学农学院 ， 吉林 龙井 1 3 3 4 0 0 ) 摘要 ： 研究焦亚硫酸钠( N a S 0 ) 对雄性小鼠睾丸染色体 的影响。取 2 5只雄性昆明种小 鼠随机分成阴性对照 组 、 阳性对照组和3个剂量组， 每组5只。分别按高、 中、 低剂量( 1 5 0 、 7 5、 3 7 5 m g k g ) N a S O 进行灌胃， 阴性对照组 用等体积 的生理盐水进行灌 胃， 阳性对 照组用 4 0 ra g m L环磷酰胺进行灌 胃， 1 次 d ， 连续 7 d 。第 1 4天处死小 鼠， 取 睾丸制染色体片， 然后观察， 进行染色体结构畸变率分析。结果为， 焦亚硫酸钠高、 中、 低剂量组的染色体畸变率分别 是 5 0 、 4 3 3 、 3 3 3 ， 与阴性 对照组 4 0 相 比， 差异不显著 。阳性 对照组 的染色体 畸变率为 2 5 6 7 ， 与阴性对 照组 比较差异极显著( P 0 O 1 ) 。可知 ， 在本试验条件下 ， 表明焦亚硫酸钠不具有生殖毒性 。 关键词：焦亚硫酸钠； 昆明种小鼠；睾丸染色体 ； 畸变 中图分类号 ： Q 9 53 文献标 志码 ： A 文章编号 ： 1 0 0 21 3 0 2 ( 2 0 1 1 ) 0 2 0 4 4 3 0 3 漂 白剂 ( b l e a c h i n g a g e n t s ) 是破坏 、 抑制食品的发色 因素 ， 使其褪色或使食品免于褐变 的物质 ， 分 氧化漂 白及还原 漂 白 2类 。氧化漂 白剂是通过其本身强烈的氧化作用使 着色物质 被氧化破坏 ， 食 品工业中常用的漂 白剂有焦亚硫酸钠 、 亚硫酸 钠 、 二氧化硫等 。 焦亚硫酸钠 ( s o d i u m m e t a b i s u l fi t e ) 的分 子式是 N a S 2 0 ， 相对分子质量 1 9 0 ， 为 白色或微 黄色结 晶粉末 ， 相对密度 1 4 ， 溶 于水 ( 2 0时为 5 4 0 g L ； 1 0 0时 为 8 1 7 g L ) ， 水溶液呈 酸性 。溶于甘 油， 微 溶于乙醇 。受潮易分解 ， 露置空气中易氧 化成硫酸钠。与强酸接触放 出二氧化硫 而生成相应 的盐类 。 加热到 1 5 0分解 。可 作为漂 白剂 、 媒 染剂 、 还原剂 、 橡 胶凝固剂使用， 也用于有机合成、 制药及香料等。焦亚硫酸钠 是食品工业 中常用 的食 品添加 剂 ， 具有 漂 白、 防腐 、 抗氧化 的 作用 ， 小 鼠经 口 L D 为 6 0 0 7 0 0 mg k g ( 以二氧化硫计 ) 。 焦亚硫酸钠应用范围广泛 ， 违 规超量使 用的情况较 为严 重 ， 有报道焦亚硫酸钠作为食品添加剂可诱发支气管哮喘， 还 可引发过敏反应 ， 甚至与肿瘤 发生相关 。亦有人 提 出焦亚 硫 酸钠对海马具有 神经元毒性 ， 但 国内有关该方 面的研究仍较 少 ， 特别是在类似人进 食方式 的对雄性 精原细胞 毒性损害 功 能研究及睾丸超微结构变化形态学研究尚未见报道 J 。焦 亚硫酸钠 可在水 中分解为亚硫酸 氢钠和二 氧化硫 ， 进 一步生 成各种硫中心和氧中心自由基， 与大气污染物( s 0 ) 吸入体 内溶于水生成亚硫酸盐 和亚硫酸氢盐相似 。A l l e n a等报道 了 让健康人 口服焦亚硫酸钠 2 0 m g k g体重 ， 0 5 h后 测到男性人 体血清中的亚硫酸根离子的浓度高达 1 1 2 m o l L 。近年来发 现， 焦亚硫酸钠具有一定的细胞毒性和基 因毒性 ， 它 可导致 人 血淋巴细胞染色体畸变( C A) 和姐妹染色单体互换( S C E ) ， 引 起哮喘病人的支气管缩小 。研究表明， 亚硫酸钠和亚硫酸 氢 收稿 日期 ： 2 0 1 0 0 52 0 作者简介 ： 赵坚华 ( 1 9 6 1 一 ) ， 女 ， 吉林 延吉人 ， 主管 检验师 ， 主要从 事 公共卫生与预防医学研究。E ma i l ： y n w s s y b u e d u C 1 3 一 通信作者 ： 权伍 荣 ， 男 ， 教 授， 主 要从 事 食品 工程 与 食 品安全 研究 。 T e l ： ( 0 4 3 3 ) 3 2 6 4 6 5 3 ；Ema i l ： w r q u a n y h u e d u c n 。 钠是染色体断裂剂和基因毒性因子， 可诱发人血淋巴细胞 C A、 S C E及 M N的产生， 这表明 S M B与 s 0 具有相似的细胞毒性 和基因毒性。我 们近几 年的研究 表明 ， s O 是一种 全身性 毒 物 ， 能引起各种脏器 的氧化损伤和 D N A损伤 ， 且脑 、 心 、 肺细胞 对 S O 衍生物的毒性作用尤其敏感 。另外 ， 在离 子通道方 面， 我们的研究也表 明， s 0 衍生 物可显 著增大大 鼠 D R G神经元 钠电流和大 鼠海马 C A 1区神经元钾 电流 。 1 材料与方法 1 1 试验动物及饲养条件 昆明种健康小 鼠 2 5只， 68周龄 ， 体 重 ( 3 31 )g ， 雄 性 ， 由延边大学农 学院动物试验 中心提供 。试验 动物饲养在 温度 2 2 2 5 、 湿 度为 4 0 7 0 的 环境 内 ， 给 予普通 饲 料 ， 自由饮水。 1 2器 材 和试 剂 1 2 1 器材眼科手术剪刀、 眼科 镊子 、 小 平皿 、 1 0 m L离心 管 、 玻璃 吸管 、 离心机 、 载玻 片 、 电子 显微镜 、 擦 镜纸 。电子天 平 ( A U Y2 2 0 ， 产 地 ： 岛津 ) ； 离心 机 ( A n k e ， T D L一4 0 B， 飞 鸽牌 ) 。 1 2 2试剂 焦亚硫酸钠 ( 分析 纯) ： 国药集 团化 学试剂有 限公司； 枸橼酸三钠： 北京益利精细化学品有限公司； 甲醇： 甲 原化学试剂一厂 ； 冰醋酸 ： 北京化工厂； 秋水仙索液 ： 广东省汕 头市西陇化工厂； 硫酸： 天津市化学试剂一厂； G i e m s a 染料： 上 海新 中化学科技公 司； 磷酸二氢钾 ： 北京化工厂 ； 磷酸氢二 钠 ： 北 京化工厂 。 1 2 3 各种试剂的配制焦 亚硫酸钠 ； 低渗 液 1 枸橼 酸三 钠 ， 取 0 1 g 枸橼 酸三钠 ， 加 蒸馏水至 1 0 0 mL ； 0 4 氯化钾 ， 取氯化钾 0 4 g加蒸馏水 至 1 0 0 m L ； 固定液 ， 甲醇 、 冰醋酸 ( 体 积 比3： 1 ) 混合液 ， 临用 时现配 ； 6 0 冰醋酸 ， 取 6 0 m L冰醋 酸加蒸馏水至 1 0 0 mL ， 临用 时现 配； 0 04 秋水仙素液， 取秋 水 仙素 4 m g 加 蒸馏水 至 1 0 m L ， 临 用时 现配 ； 1 1 5 m o L L磷 酸缓 冲液 ( p H值 6 8 ) ， 取磷酸二氢钾 ( K H 2 P O ) 4 5 0 g 、 磷酸 氢二 钠 ( N a H P O 1 2 H 0) l 1 8 1 g ， 加蒸 馏 水 至 1 0 0 m L ； G i e ms a 染液 ， 称 取 G i e m s a染料 3 8 g ， 加入 3 7 5 m L甲醇研磨 ， 一 4 4 4一 江苏农业科学2 0 1 1 年第 3 9卷第 2期 待完全溶解后加入甘油 1 2 5 m L ， 置恒温箱保温 4 8 h ， 振摇数 次， 过滤， 2周后用； G i e m s a应用液 ， 取 1 份 G i e m s a染液与 1 O 份 1 1 5 m o l L磷酸缓冲液混合， 临用时现配。 1 3试验 方法 1 3 1 剂量分组设阴性 ( 溶剂 ) 对 照组 ， 阳性 对照组及受 试物3个剂量组。阴性对照使用等体积的溶剂。阳性对照物 用环磷酰胺 4 0 m g k g ( 腹腔注射， 1 7欠 d ， 连续 7 d ) 。根据焦 亚硫酸钠的急性 L D 分为 3个剂量组， 5只 组， 高剂量组灌 胃量为 1 5 0 m g k g 、 中剂量组灌胃量为7 5 m rk g 、 低剂量组灌 胃量为 3 7 5 m g k g 。 1 3 2 试 验步骤 1 3 2 1 受试动物接触方法受试物接触途径应与实际接 触途径一致或接近。可采取 1次接触， 或每天 1 次， 连续 5 d 的方法 。 1 3 2 2取样 时间各组均 于第 1次接触 受试物后 1 2 1 4 d将动物处死制片。 1 3 2 3 试验操作动物处死前 6 h腹腔注射秋水仙素 4 m g k g ( O 0 4 秋水仙素按 0 1 mL 1 0 g 体重) 。 以颈椎脱臼法处死小鼠， 取出两侧睾丸， 去净周围组织和 脂肪， 用低渗液洗去毛和血污后， 放人盛有适量低渗液的小平 皿中。用眼科小镊子撕开睾丸被膜， 轻轻分离曲细精管， 加低 渗液至 81 0 m L ， 室温下低渗 2 O一4 0 ra i n ( 低渗时间视室温 条件而定) 。仔细吸尽低渗液， 加固定液 1 0 m L， 固定2 0 m i n 。 必要时可存放在冰箱中过夜 ， 但软化前应将固定液吸掉， 再加 入新鲜配制的固定液 ， 固定 1 0 m i n 。吸尽 固定液 ， 加 6 0 冰 醋酸 1 2 mL ， 待大部分曲细精管软化后， 立即加入 1 倍量的 固定液， 用 吸管 打匀， 移 入离心 管， 以 1 0 0 0 r m i n离心 1 0 m i n 。 弃去大部分上清液， 留下约0 51 0 m L ， 充分打匀制 成细胞混悬液。将细胞混悬液均匀地滴于冰水玻片上。每个 样本制片2 3张。空气干燥或微热烘干。 用 1： 1 0 G i e m s a染液( p H 值 6 8 ) 染色 2 O 4 0 m i n 。立 即用蒸馏水或 p H值 6 8的磷酸缓 冲液 冲洗。晾干后 ， 放入 片盒中保存。阅片： 在低倍镜下选择分散 良好 、 细胞未破裂 的 中期分裂相 ， 观察并记录染色体结构异常和数目异常细胞。 染色体结构畸变包括 ： 染色体型和染色单体型的断裂、 缺失、 断片和重排( 三射体、 四射体或复杂结构) ， 环状染色体( 有着 丝点和无着丝点) ， 粉碎性染色体。染色体数 目畸变： 整倍体 性畸变( 多倍体 3 n 、 4 n ) ， 非整倍体性 畸变 ( 2 n1 2 3 ) 】 。畸变分析： 在低倍镜下按一定顺序寻找背景清晰、 分 散良好、 染色体收缩适中的中期分裂相细胞， 然后在油镜下进 行分析。每只动物分析 1 0 0个中期分裂相细胞。染色体结构 畸变分析中除了可见到裂隙、 断片、 微小体等外( 参照小鼠骨 髓细胞染色体畸变试验方法) ， 还要分析： ( 1 ) 相互易位： 相互 易位涉及非同源染色体间末端断片的交换。它需要第 2次断 裂和修复。有常染色体间的易位和性染色体与常染色体之间 的易位。常染色体易位时能产生环状多价体( c+I) ； 若 2次、 3次或4次易位， 则可观察到六价体、 八价体或十价体。 性染色体与常染色体的易位， 可以有 x染色体或 Y染色体与 常染色体之间的易位。在对照成年动物中性染色体之间的自 发易位率极低， 一般低 于 0 0 1 。但老年动物可稍有增 加 ) 。( 2 ) X Y和常染色体的单价体： 又称性染色体早熟分 离和常染色体早熟分离。正常对照动物 xY单价体的发生 率为 0 1 0 ， 因为 x和 Y染 色体的连接 ， 是 长臂的远端 ， 非 同源的片段相接。x、 Y染色体分离常可引起不育。常染色 体的单价体是由于不联会 ( 同源片段间配对合子的缺失) 或 联会消失 ( 由于交叉失败 而分离 ) 而造成 的 ， 它们在对照组动 物 中较少见 ， 因为交叉在双线期形成， 正常配对 的联会一 直到 中期 I 末， 常发生于 1 对常染色体中 。 1 3 3 统计方法统计 学方法将镜检观 察的畸变类型及结 果， 采用 S P S S 1 1 5统计软件进行方差分析。 2结果 2 1 一 般 症 状 对照组小 鼠未见明显 异常症状 ， 试验组小 鼠也未 明显见 到不 良反应 ， 毛色与对照相 比无明显变化。 2 2 焦亚硫酸钠对小鼠睾丸染色体的影响 焦亚硫酸钠对雄性小鼠睾丸染色体影响见表 1 。 表 1 焦亚硫酸钠对小鼠睾丸染色体畸变率的影响 注： 试验组与阴性对照组 比较 ： ” 表示 P0 O 1 。 从表 1可以看出， 焦亚硫酸钠高、 中、 低剂量组的染色体 畸变率分别为 5 0 、 4 3 3 、 3 3 3 ， 与阴性对照组 4 0 相 比， 差异不显著。阳性对照组的染色体畸变率为 2 5 6 7 ， 与 阴性对 照组 比较差异极显著 ( P 0 0 1 ) 。 3结论 本 试 验结 果显 示 焦 亚 硫 酸 钠 在 剂量 分别 为 1 5 0 、 7 5 、 3 7 5 m g k g时对雄性小鼠睾丸染色体没有显著影响。 4讨论 焦亚硫酸钠具有 良好 的保鲜防腐 和漂 白功能 ， 在 日常生 活中作为防腐剂和漂白剂被广泛添加到各种食品中。与此同 时 ， 也存在大量不法商 贩对焦亚硫酸钠 的超标滥用 问题 。国 家 食品添加剂食用卫生标准 G B 2 7 6 0 -1 9 9 6 规定焦亚硫酸 钠作为食品添加剂最大使用量为0 4 5 g 1 0 0 0 g 。 鉴于食品中化学污染 问题 日显 突出 ， 焦亚硫 酸钠的使用 安全性也越来越受到人们的关注。由于结构与功能是相互依 存的， 功能的行使必以结构为基础， 结构的改变定有功能的变 化相依随， 因此试验选择高于国家标准的剂量， 且摄入途径与 人类相似， 通过对雄性小鼠进行灌胃 1周， 在第 1 2天时取小 鼠睾丸对其染色体进行制片 ， 而后观察， 分析焦亚硫酸钠 对雄性小鼠睾丸染色体有无损害。 一 般认为， 中毒可引起细胞水肿， 其发生机制是离子和水 的细胞内外平衡失调。如中毒可使线粒体受损伤， 使 A T P生 成减少， 细胞膜 N a 一K 泵功能发生障碍， 导致细胞内N a 、 水增多 。通常细胞水肿在去除病因后， 可以恢复， 为可逆 赵坚华等： 焦亚硫酸钠对雄性小鼠睾丸染色体的影响 4 4 5- 性的损伤。但如果诱因强度较大或者持续时问较长时则可造 成不可逆损伤 。 目前 焦亚硫酸钠中毒的分子机制还有待进一步深入研究 和探讨， 以便对超标使用焦亚硫酸钠作为食品添加剂可能对 人体造成的慢性毒 性作 用有 一个 比较全面 的认 识” 。但 本 试验结果说明焦亚硫酸钠在剂量分别为 1 5 0、 7 5 、 3 7 5 m g k g 时对雄性小 鼠进行灌 胃7 d ， 再观察 7 d ， 对睾丸染色体进行制 片， 观察结 果表明焦亚硫酸钠高 、 中 、 低 剂量组 的染色体畸变 率分别 5 0 、 4 3 3 、 3 3 3 ， 与 阴性 对照组 4 0 相 比， 差 异不显著。阳性对 照组 的染 色体畸 变率为 2 5 6 7 ， 与 阴性 对照组比较差异极显著 ( P0 O 1 ) 。所 以 ， 焦亚硫 酸钠在 剂 量为 1 5 0 、 7 5 、 3 7 5 m e k g 时对雄性小鼠睾丸染色体无显著影 响。但是 ， 这并不表明焦亚 硫酸钠对人体无 损害作用 ， 因此 ， 对焦亚硫 酸钠 的毒性及其毒性机理还需进一步研究 。 另外 ， 在染色体制片时应该 注意 以下事项 ， 使试验结果减 少误差。在动物的选择 上 ， 一般用小 鼠， 其繁殖能力 强 ， 易 于 饲养。我们常用的是它 们的骨髓 细胞 和精巢 ， 因其分裂指数 较高 ， 不用体外培养就可 以得到分裂 中期 的细胞。秋水仙 素 用量要注意 ， 太多或处理时间过长 ， 会导致染色体的过分凝缩 或着丝点裂解 ， 最终会引起染色体形态不正常 ， 甚至被破坏或 溶解。低渗处理很关键， 低渗液的量、 处理时间均与细胞的数 量有关。低渗过度， 细胞会破裂； 低渗不足则染色体在一起 ， 分散不开。离心 速度或 离心 时间也会 影 响染色体 标本 的制 备 。离心速度过大或 离心时 间过长 ， 则会引起 细胞破 裂 ； 反之 ， 离心速度过 小或离心时间过短 ， 则细胞沉降不 下来 ， 会 引起大量细胞丢失。固定液要 随用随配 ， 固定彻底后再 打散 细胞团块 ， 否则细胞容易破碎 ， 染色体分散亦 受到影响 。 载玻 片要预冷 。冷 却不够 ， 则 会影 响染 色体的 附着 和铺展 。 用吸管吹散细胞时用 力必须尽量轻柔 ， 用 力过 大则会造成 细 胞破裂 ， 而染色体也会弥散在溶液 中， 在 随后 的离心中将会丢 失。滴片时的高度很重要 ， 高度过低细胞不会破裂 ； 过 高则染 色体过于分散甚 至丢失 ， 无法辨别出染色体 的准确数量。 参 考文献 ： l 1 郝利平 ， 夏延斌 ， 陈永 泉 ， 等食 品添加剂 M 北京 ： 中国农业 大学出版社 ， 2 0 0 2： 8 99 1 2 陈毅鸿 简论食 品漂 白剂亚硫 酸及 其盐 J 山西食 品 工 业 ， 2 0 0 5 ( 2 ) ： 1 8 2 O 3 沈 明浩 ， 任 大勇， 权伍荣漂 白剂焦亚硫 酸钠 对小 鼠生殖毒性 的 影响 J 环境与职业医学 ， 2 0 0 7 ( 4 ) ： 1 1 9 2 0 0 4 盂紫强环境毒理 学 M 北京 ： 中国环 境 出版社 ， 2 0 0 0 ： 3 3 8 3 5 9 5 许牡丹 ， 毛跟年 食品安 全性与分 析检测 M j E 京 ： 化学工 业 出版社 ， 2 0 0 3 ： 2 2 2 6 孟紫强 ， 魏彩铃焦亚硫酸钠对大 鼠背根节神经元钾电流 的影 响 J 应用与环境生物学报 ， 2 0 0 6， 1 2 ( 2 ) ： 2 2 4 2 2 8 7 M e n g Z Q， Z h a n g B， R u a n A D， e t a 1 Mi c r o n u e l e i i n d u c e d b y s u l f u r d i o x i d e i n h a l a t i o n i n mo H s e b o n em g T O W c e l l s i n v i v o J I n h a l To x i c o l ， 2 0 0 2， 1 4： 3 0 33 0 9 8 王友亮 ， 杨晓小 鼠染色体 工程 的研究 进展 J 生物 工程学 报 ， 2 0 o 2 ( 1 8 ) ： 2 7 1 2 7 5 9 王应雄 ， 翁亚光 ， 张湘蜀 ， 等非 整倍体患者 染色体 C d结 构初步 研究 J 中华医学遗传学杂志， 1 9 9 2 ， 9 ( 3 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