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文章编号:100028551(2007)032268205 琥珀酰化和蛋白酶改性对小麦面筋蛋白功能性质的影响 邵 平 1 孙培龙 1 孟祥河 1 姜绍通 2 (1 1 浙江工业大学生物与环境工程学院,浙江 杭州 310032; 21 合肥工业大学生物与食品工程学院,安徽 合肥 230009) 摘 要:对小麦面筋蛋白进行琥珀酰化和蛋白酶复合改性以提高其溶解性及其他特性。对复合改性面筋 蛋白与原面筋蛋白、 琥珀酰化面筋蛋白、 碱性蛋白酶改性面筋蛋白进行了比较。结果表明:在pH 3 11、 水解度4 %12 %的范围内,复合改性面筋蛋白的溶解度亦随着水解度的增大而增大,比原面筋蛋 白、 酰化面筋蛋白、 中性蛋白酶和碱性蛋白酶的改性产物都高。起泡性和起泡稳定性则先增加后降低, 在水解度4 %时具有较佳值,但在各水解度下较单一改性的面筋蛋白产物都要低。添加复合改性面筋 蛋白面团黏弹性和面包口感较好,内部结构均匀、 细腻。 关键词:面筋蛋白;琥珀酰化;蛋白酶;复合改性 THE INFLUENCES OF SUCCINYLATION AND PROTEASE MULTIPLE MODIFICATION ON WHEAT G LUTEN PROTEIN FUNCTIONALITIES SHAO Ping SUN Pei2long MENG Xiang2he JIANG Shao2tong (1 1College of Biological and Environmental Engineering,Zhejiang University of Technology,Hangzhou,Zhejiang 310032 21School of Biotechnology and Food Engineering,Hefei University of Technology,Hefei,Anhui 230009) Abstract :The water2insolubility of wheat gluten protein (WGP) is one of the major limitations for its more extensive use in food processing. Succinylation and protease multiple modification were applied to increase the degree of hydrolysis (DH) . Modified WGP were analyzed compared with original WGP , succinyled WGP , neutral protease wheat gluten hydrolysates (WGH) and alcalase WGH. The results showed that when pH was in the range of 311 and DH 4 %12 % , the solubility of multiple modified WGP increased with the increase of DH, higher than original WGP , succinyled WGP and protease WGH. The foaming properties increased at first and then decreased lower than single condition modified WGP. The better foaming properties were obtained with DH 4 %. In addition , multiple modified WGP could improve the properties of bread. Key words:wheat gluten protein; succinylation; protease ; multiple modification 收稿日期:2006207203 基金项目:浙江省自然科学基金(Y305058)和安徽省十五二期重点攻关项目(No.04013021) 作者简介:邵平(19802 ) , 男,浙江龙游人,博士,讲师,主要从事农产品生物化工方面研究。Tel :0571288320604;E2mail :pingshao325 面筋蛋白(活性小麦面筋粉WGP)是小麦淀粉生 产过程中的副产物,其氨基酸组成比较齐全,是营养丰 富、 物美价廉的植物性蛋白源 1 。我国是农业大国,小 麦产量位居世界第一,预计2010年面筋蛋白年产量将 达到30万吨。随着产量的日益增大,研究开发其新用 途势在必行。但水不溶性限制了其在食品中的应用。 目前,面筋蛋白改性方法的研究主要集中在物理方法、 化学方法和酶法改性三个方面。通过添加亲水性基 团,如通过琥珀酰化改性面筋蛋白溶解性直接影响着 其起泡和乳化特性 2 ,3 ,以提高面筋蛋白的溶解度,进 而影响起泡性和起泡稳定性,已取得了比较令人满意 的结果 4 ;通过蛋白酶水解,使蛋白质分子发生结构重 排,从而使得一些原先包埋在蛋白质分子内部的疏水 性区域暴露到水相溶剂中 57 ,如孔祥珍、 周惠明等 8 采用蛋白酶对小麦面筋蛋白进行酶解,并对其蛋白质 回收率和水解进程进行比较研究。Drago等 6 通过酶 对经热处理的面筋蛋白进行水解,在一定的水解度范 围有效改善了面筋蛋白的起泡性和起泡稳定性。利用 862 核 农 学 报 2007 ,21(3) :268272 Journal of Nuclear Agricultural Sciences 化学法和酶法对面筋蛋白单一改性的技术已经比较成 熟,但需进一步提高其功能特性。为此,我们根据琥珀 酰化改性可提高面筋蛋白的溶解度和蛋白酶水解,可 提高酶起泡特性,首先对面筋蛋白进行琥珀酰化预处 理,再用蛋白酶水解琥珀酰化面筋蛋白,并将复合改性 后的面筋蛋白与原面筋蛋白、 酰化面筋蛋白和单一蛋 白酶酶解物进行比较分析,以期为面筋蛋白的进一步 开发提供理论依据。比较中性蛋白酶和碱性蛋白酶对 酰化面筋蛋白的水解作用,筛选出一种水解效率高的 蛋白酶,并探讨琥珀酰化和蛋白酶改性对小麦面筋蛋 白功能性质影响的变化规律。 1 材料与方法 111 材料 小麦面筋蛋白(蛋白质含量为70 %)由河南省温 县永大实业有限公司提供。琥珀酸酐,分析纯,由上 海化学试剂研究所提供。中性蛋白酶 (16 万U g) 、 碱 性蛋白酶 (17 万U g) 为广西南宁庞博生物工程有限公 司制品。TA. XTplus物性测试仪购自英国Stable Micro System公司。其他试剂均为分析纯。 112 方法 11211 琥珀酰化面筋蛋白的制备 9 称取50g面筋 蛋白,加入500ml水中,置于40 水浴锅中不断搅拌, 用1molL NaOH溶液调pH为810815后,将715g琥 珀酸酐分批加入,用2molL NaOH调节,使其pH维持 在810815 ,充分反应(约 1h) 后进行冷冻干燥,制得 的酰化面筋蛋白用80目筛过筛后备用。 11212 复合改性面筋蛋白的制备 按5 %固液比准确 称取酰化面筋蛋白,在磁力搅拌下使其均匀溶解于蒸 馏水中,并加热到酶的最适温度,同时用1molL NaOH 调节酸碱度至酶的最适pH。中性蛋白酶的最适温度 是50,pH为710 ;碱性蛋白酶的最适温度是60,pH 为815。在磁力搅拌下加入适量蛋白酶,蛋白酶与底 物酰化面筋蛋白的比例取1 %(w w) 。置于恒温水浴 锅中进行水解,以011molL NaOH溶液滴定,使pH稳 定不变。根据制得的蛋白酶水解进程曲线,待反应 300min ,迅速在沸水浴中加热3min钝化蛋白酶,即制 得所需水解度的面筋蛋白酶解物,经冷冻干燥后过筛 备用。 113 测定 11311 溶解度的测定 用双缩脲法 10 测定面筋蛋白 的溶解度。配制1 %蛋白溶液,平衡30min ,3000rpm离 心10min。取上清液1ml于试管中,加入4ml双缩脲试 剂,剧烈振荡10min ,放置30min。再取一个试管先加 入1ml蒸馏水,再加入4ml双缩脲作为空白液,于 540nm处进行比色测定,以牛血清蛋白的溶解度作标 准曲线。 11312 起泡性和起泡稳定性的测定 11 配制1 %(W W) 的改性面筋蛋白溶液,取200ml在高速组织捣碎机 中搅打2min ,迅速倒入500ml量筒中,记录泡沫体积 V1(ml) ,静置10min后再次测量泡沫体积V2(ml) ,起 泡性(FC)和起泡稳定性(FS)计算如下: 起泡性( %) =泡沫体积V1200100 %(1) 泡沫稳定性( %) =泡沫体积V2200100 % (2) 11313 水解度的测定 采用pH2Stat 12 法。水解开始 时,调节反应体系到蛋白酶最适pH,反应过程中用 011molL NaOH调节pH使其保持恒定,并记录所使用 的碱液量,按公式(3)计算水解度: 水解度( %) =hhtot100 % =B(Mb ) (1 ) (1 MP ) (1 htot)100 (3) 式中,B为NaOH的体积(ml) ;Mb为NaOH的浓度 (mol L) ;为水解系数,表示氨基的平均解离度,其 计算见公式(4) ;MP为蛋白质的质量 (g) ; htot为每克原 料蛋白质中肽键的毫摩尔数(肽键mnolg蛋白 ) , 对于 面筋蛋白,应取值8138。本实验中,Mb= 010990molL ; pKa=7 ;MP= 5g。 = 10 pH-pKa 1 + 10 pH-pKa (4) 11314 面团黏弹性测定 称取40g面粉,加入2 %(W W) 的改性面筋蛋白,搅匀后加入18ml水,揉10min成 面团。将添加不同面筋蛋白的面团及空白面团分别放 入TA. XTplus物性测试仪ADSC黏弹性探头的面团制 备槽中,用配套材料板压制成约2mm60mm的面团 条。快速取出面团条,放入探头固定的拉伸位置进行 测定直至断裂,得到面团的拉伸力2时间曲线。ADSC 黏弹性探头工作参数参照物性仪标准模式。 11315 面包感官性质评价 将原面筋蛋白、 酰化面筋 蛋白和水解度为4 %(W W) 的复合改性面筋蛋白按 2 %的比例添加到面粉中,加适量的水和面,将和好的 面团采用二次发酵法制作面包,将烤好的面包进行评 分和感官评价。 2 结果与分析 211 蛋白酶的酶水解进程曲线 图1为用碱性蛋白酶和中性蛋白酶对原面筋蛋白 962 3期琥珀酰化和蛋白酶改性对小麦面筋蛋白功能性质的影响 和酰化面筋蛋白进行水解的进程曲线。随着酶解时间 的延长,水解度不断增大,尤其是在最初30min水解速 率很大,之后变得比较平缓。这是因为随着反应的进 行,酶渐渐失活,且面筋蛋白浓度下降,减少了酶分子 与底物分子碰撞的几率。在300min内,碱性蛋白酶水 解原面筋蛋白的水解度可达到2112 % ,水解酰化面筋 蛋白的水解度可达到1919 % ,中性蛋白酶水解原面筋 蛋白的水解度可达到1313 % ,水解酰化面筋蛋白的水 解度则可达到1211 %。说明碱性蛋白酶的水解效率 要比中性蛋白酶高;蛋白酶对原面筋蛋白的水解效率 要比对酰化面筋蛋白的水解效率高。鉴于碱性蛋白酶 的高蛋白回收率以及来源广泛 8 ,我们采用了碱性蛋 白酶制备复合改性面筋蛋白,并对其功能性质进行了 比较研究。 图1 不同方法改性的面筋蛋白水解进程 Fig. 1 Enzymatic hydrolysis of WGP modified by different method NHO:中性蛋白酶水解原面筋蛋白;NHS:中性蛋白酶 水解酰化面筋蛋白;AHO:碱性蛋白酶水解原面筋蛋白; AHS:碱性蛋白酶水解酰化面筋蛋白 NHO:neutral protease original WGH; NHS:neutral protease succinyled WGP; AHO:alcalase WGH; AHS:alcalase succinyled WGP 212 复合改性面筋蛋白的功能性质研究 21211 复合改性面筋蛋白与原面筋蛋白对比分析 (1)溶解度 从图2中可以看出,在pH 311范 围内,复合改性后的面筋蛋白溶解度远比原面筋蛋白 高,且随着水解度的增大而增大。复合改性面筋蛋白 的溶解度均在815mgml左右,而原面筋蛋白的溶解度 在pH为7时最低,不到2mgml ,在pH为11时最大,也 只有7mgml。这是由于复合改性在原面筋蛋白蛋白 上 接 入 了 亲 水 性 基 团 琥 珀 酰 基 (HOOCCH2CH2CO ) , 使得其分子表面形成了水化层, 从而增强了溶解性。再加入碱性蛋白酶酶解后,蛋白 质二级结构遭到破坏,疏水区域暴露,肽链长度减小, 使得其溶解性进一步增强,并且经水解成短肽后,其等 电点也逐渐消失。 图2 不同水解度的复合改性面筋蛋白和原面筋蛋白的溶解度 Fig. 2 Solubility of multiple modified WGP and original WGP with different degree of hydrolysis (2)起泡性和起泡稳定性 蛋白质分散液会引起 水2空气界面表面张力的降低,从而产生起泡性。图3 表明,碱性蛋白酶复合改性面筋蛋白在低水解度(4 %) 下的起泡性与起泡稳定性要比原面筋蛋白高,分别增 加了75 %和50 %。但随着水解度的增加,其起泡性和 起泡稳定性迅速下降,甚至低于原面筋蛋白。这是由 于溶解度的增加使得参与起泡作用的蛋白质分子数目 也在逐渐增多,小麦面筋蛋白经过酶解,增加了许多肽 段,同时暴露出疏水基团,相对增加了蛋白质的疏水部 分,有利于胶束形成,并且使大量肽分子进入油水界 面,进一步降低了界面张力。但随着水解度的进一步 增大,复合改性产生的带有酰基的肽链使得酶解物表 面活性减小,从而降低了起泡性。另外,起泡稳定性的 降低表明了泡沫的稳定性主要归因于一些较大的蛋白 质成分及部分水解的蛋白质。过度水解形成的小肽链 不足以稳定液膜,从而导致起泡稳定性的下降。 21212 复合改性面筋蛋白与酰化面筋蛋白对比分析 (1)溶解度:从图4可以看出,在pH 311的范围 内,与酰化面筋蛋白相比,复合改性面筋蛋白的溶解度 更高,且随水解度的增大而增大,这是由于复合改性面 筋蛋白经过酰化后,又经中性蛋白酶酶解成带酰基的 短肽,从而增加了其溶解性。另外,与原面筋蛋白相比 (图 2) 酰化面筋蛋白的溶解度更大,这是由于接入了 亲水性基团,酰化面筋蛋白的等电点由pH7提至pH5 , 但水解后,等电点逐渐消失则是由蛋白质本身的性质 决定的。 072核 农 学 报21卷 图3 不同水解度的复合改性面筋蛋白和原面筋蛋白起泡特性 Fig. 3 Foaming characteristics of multiple modified WGP and original WGP with different DH 图4 不同水解度的复合改性面筋蛋白 和酰化面筋蛋白的溶解度 Fig. 4 Solubility of multiple modified WGP and succinyled WGP with different degree of hydrolysis 图5 不同水解度的复合改性面筋蛋白 与酰化面筋蛋白的起泡特性 Fig. 5 Foaming characteristics of multiple modified WGP and succinyled WGP with different degree of hydrolysis (2)起泡性和起泡稳定性:从图5可以看出,与酰 化面筋蛋白相比,中性蛋白酶复合改性面筋蛋白的起 泡性与起泡稳定性都低,且随水解度的增加迅速下降。 这是由于溶解度增加虽有利于面筋蛋白性质的提高, 但复合改性水解产生带有酰基的肽链使得酶解物表面 活性减小,降低了起泡性。另外,过度水解形成的小肽 链不足以稳定液膜,从而导致起泡稳定性下降。与原 面筋蛋白相比,酰化面筋蛋白的起泡性与起泡稳定性 都要高,其中FC增加了100 % ,FS增加了50 %。这是 由于亲水基团的引入增加了蛋白质的表面活性,降低 了溶液气2液界面的表面张力。 21213 复合改性面筋蛋白与面筋蛋白酶解物对比分 析 (1)溶解度:从图6可以看出,碱性蛋白酶复合改 性面筋蛋白与面筋蛋白中性蛋白酶酶解物的溶解度都 随水解度的增大而增大,相同水解度下碱性蛋白酶复 合改性面筋蛋白的溶解度要更高。在相同水解度下, 由于复合改性面筋蛋白比碱性蛋白酶酶解物中多接入 了1个亲水性基团 琥珀酰基(HOOCCH2CH2CO ) , 使得其分子表面形成了水化层,从而大大增强了溶解 性,即使是水解度为4 %的复合改性面筋蛋白,其溶解 度也比水解度为12 %的蛋白酶酶解物高。 图6 不同水解度的复合改性面筋蛋白 与酶解物的的溶解度 Fig. 6 Solubility of multiple modified WGP and alcalase WGH with different degree of hydrolysis. MDH4:水解度为4 %的中性蛋白酶复合改性面筋蛋白; ADH4:水解度为4 %的碱性蛋白酶酶解面筋蛋白,其余类似 (2)起泡性和起泡稳定性:图7显示,相同水解度 下,复合改性面筋蛋白的起泡性和起泡稳定性远比碱 性蛋白酶酶解物低,尤其在水解度为4 %时,酶解物的 172 3期琥珀酰化和蛋白酶改性对小麦面筋蛋白功能性质的影响 FC要比复合改性面筋蛋白的高100 % ,这是由于复合 改性产生的带有酰基的肽链使得酶解物表面活性减 小,降低了起泡性。随水解度的增加,两者的起泡性和 起泡稳定性迅速下降,这是由于水解度越大,形成的肽 链越小,越不足以稳定液膜,导致起泡稳定性的迅速下 降。 图7 不同水解度的复合改性面筋蛋白 与酶解物的起泡特性 Fig. 7 Foaming characteristics of multiple modified WGP and alcalase WGH with different DH. MFC,MFS:碱性蛋白酶复合改性面筋蛋白起泡性和起泡稳 定性;AFC和AFS:碱性蛋白酶酶解物起泡性和起泡稳定性 213 改性面筋蛋白对面团黏弹性的影响 从图8可以看出,将面团条拉断时,需要最大拉伸 力。通过测定最大拉伸力可以分析改性面筋蛋白的面 团黏弹性。 图8 添加4 %复合改性面筋蛋白的面团黏弹性测定 Fig. 8 The stickness of dough with 4 % multiple modified WGP 一般最大拉伸力在30g力以上的小麦粉是强筋小 麦粉 13 。从表1可以看出,原料小麦粉最大拉伸力为 3614g ,为强筋小麦粉。添加各种面筋蛋白的面团条的 最大拉伸力比不添加面筋蛋白的大。添加酰化面筋蛋 白的面团的最大拉伸力最大;添加蛋白酶和复合改性 面筋蛋白的面团次之,这是由于蛋白酶将面筋蛋白水 解为多肽,增加了溶解度,而原面筋蛋白由于溶解度 低,起泡性能较差,故最大拉伸力小。 表1 面团最大拉伸力 Table 1 Maximum draw force of dough 序号No.12345 最大拉伸力 maximumforce(g) 361438171111970118710 注:1:未添加添加剂;2:添加原始面筋蛋白;3:添加酰化面筋蛋白;4:添 加水解度4 %面筋蛋白中性蛋白酶酶解物;5:添加水解度4 %复合改性 面筋蛋白。下表同。 Note : 1:no additive ; 2:original WGP; 3:succinyled WGP; 4:neutral protease WGH with DH 4 %; 5: multiple modified WGP with DH 4 %. The same as following table. 在制作面包试验中(表2) ,发现不添加任何添加 剂,面包体积小,口感差、 内部结构不均匀。添加原始 面筋蛋白,提高了小麦粉的筋力,但缺少良好的亲水、 亲油性能。添加酰化、 酶解和复合改性面筋蛋白后,面 团筋力增强,面团黏弹性和延伸性提高,面包蜂窝均 匀、 细腻,香软可口。 表2 不同面包的品质感观评价 Table 2 Sensory evaluation of different bread 样品编号 No.of sample 口感触感内部结构综合评分 1粗糙弹性差有较大孔洞65 2香软弹性一般杂乱,网孔较大76 3香软弹性好均匀、 细腻85 4香软弹性好均匀、 细腻85 5香软弹性较好均匀、 细腻80 3 结论 本研究制备了不同水解度的琥珀酰化和碱性蛋白 酶复合改性面筋蛋白,并对其功能性质进行了比较。 结果表明:碱性蛋白酶相对中性蛋白酶水解速率更高。 在pH311、 水解度4 %12 %范围内,复合改性面筋 蛋白的溶解度随水解度的增大而增大,且数值都大于 80 % ,比原面筋蛋白、 酰化面筋蛋白和碱性蛋白酶酶解 物都要高,而其起泡性和起泡稳定性则是先增加后降 低,且在各水解度下较单一改性的面筋蛋白产物都要 低。添加复合改性面筋蛋白的发酵面包口感较好,内 部结构均匀、 细腻。 参考文献: (下转第280页) 272 Journal of Nuclear Agricultural Sciences 2007 ,21(3) :268272 品的细菌初始污染,并将细菌初始污染检测的数据描 点在控制图上。根据点的位置和休哈控制图的判异准 则判断细菌初始污染是否处于正常的变化范围内。产 品使用设定剂量辐照且终检合格后,描点可以续接前 25组数据的点作为新的上下控制线的统计数据,辐照 不合格的数据不能作为上下控制线的统计数据。 产品细菌初始污染水平的判异准则为点出界就判 异;界内点排列不随机判异。具体有8项判异标准: (1)一点落在上下控制线以外,即点出界就判异(由于 初始污染过低并不影响辐照质量,所以低于下控制线 的点不判异) ;(2)连续9点落在中心线同一侧 ; (3) 连 续6点递增或递减 ;(4) 连续14点中相邻点上下交替; (5)连续3点中有2点落在中心线同一侧的2以外; (6)连续5点中有4点落在中心线同一侧的1以外; (7)连续15点在1中心线上下 ; (8) 连续8点在中心 线两侧,但无一在1中。 当符合判异原则(1)时,不能继续使用原剂量,因 为初始污染已经超出了剂量有效的范围。当符合其余 7项中的任何一项时,可以继续使用原剂量,但应采取 预防措施,因为这7种情况显示描点在控制图中的位 置不随机,也就是说细菌初始污染的变化有规律,说明 产生了新的影响初始污染变化的因素,因此,应采取措 施查明新的影响因素,并加以控制。 3 讨论 311 由于需要25批产品的数据,所以,本文介绍的方 法仅适用于生产稳定产品的辐照消毒。对于实施了 G MP的生产线,保持生产过程的稳定是基本要求。 312 本方法不能监测表观D10值的变化,微生物种类 和种类的比例变化都可能造成表观D10值的变化。识 别表观D10值的变化要靠对生产过程中可能引起以上 变化的因素的监控才能达到。 参考文献: 1 赵永富,汪昌保,王 超.辐照灭菌技术在制药业上的最新应用 进展.核农学报,2006 ,20(2) :143147 2 郭平稳,李松兰,等.中药辐照剂量分布的测量与计算.核农学 报,2006 ,20(4) :327330 3 王宝琴,药凤荷主编. 60Co射线辐照中药质量评价研究.中国药 品生物制品检定所等编.1995 ,12 4 张公绪,孙 静主编.质量工程师手册.北京:企业管理出版社 5 ISO11137:2006. 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