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文档简介

两阶段法培养红法夫酵母生产虾青素 鲁明波 , 朱疑 , 周蓬蓬 , 余龙江 (华中科技大学生命科学与技术学院 , 资源生物学与生物技术研究所 , 湖北武汉 , 430074 ) 摘 要 在法夫酵母生长过程中 , 培养基组成是影响细胞 生长 和虾青紊产t 的重 要因紊 。 文中通过正交设计 和响应面优化方法分别对红法夫酵母生长阶段培养墓和虾青素合成 阶段的培养墓进行了优化研究 。 结果表明 , 碳源和氮源浓度对红法夫细胞的生长及虾青素的合成有明显影响 , 浓度为 2 0 9/L 的有萄糖有利于细胞的生长 ; 而50 9/L 左右 的菊萄糖和高C/N有利于虾青素的合成 . 在此 墓础上提出了 两阶段发酵方案 。 经过两阶段发 醉 , 红 法夫酵母 生物t和虾青素产I 达到1 6 . 89/L和1 5 . 0 1 5mg/L , 分 别比分批培养提高了5 6 . 3% 和2 8 . 7% . 关健词红法夫酵母 , 虾青素 , 培养墓优 化 , 两阶段发哮 虾青素(3 , 3 - -二经基币 , 5 -胡萝卜素 一4, 4 -二酮) 是一种重要的类胡萝卜素 , 因其具有优良的色素沉积 作用并能促进动物发育 , 在蛙鱼 、 虾 、 蟹等水产养殖中 作为一种重要的饲料添加剂 , 含有类虾青素的红 法夫 酵母可以改善家畜家禽的体色和禽蛋着色效果 , 提高 水产动物的市场价值 。 近年来 , 由于虾青素超强的抗 氧化活性及较强的抗肿瘤活性而日益受到研究者的 关注 1。 红法夫酵母( P h a ff 泛 a r h o do zym a )可以利用多 种碳源如葡萄糖 、 蔗糖等生物合成以虾青素为主的类 胡萝卜素 。 然而 , 自然条件下分离的红法夫酵母的虾 青素产量很低 。 目前已有报道 , 通过诱变选育得到高 产虾青素的红法夫酵母突变株 , 但这是以降低生物量 和生长速率为代价的闭 。 优化发 酵培养基和发酵过 程是提高生物量和增加产物产量的常用方法 , 研究表 明 , 发酵培养基的优劣对红法夫酵母生产虾青素有着 重要的影响 。 文中在红法夫酵母快速生长期的3 6 h 内以生长得率为考核指标进行正交实验 , 优化生 长培 养基 。 在菌体浓度最 大时 , 将其转移到新鲜培养基 中 , 采用响应面方法优化产物合成培养基 , 以虾青素 产量为考核指标 , 获得了优化的虾青素合成培养基 , 达到了快速生长和高产虾青素的目的 , 获得了满意的 效果 。 1 材料 与方法 1 . 1 菌 种 红 法夫 酵母(P h a f fi ar h o d oz 少ma)A S 2 . 155 7 购于中国普通微生物保藏管理中 心(C GMC C) , 研究 第一作者 : 博士 , 副教授(余龙江教授 为通讯作者) 。 收稿日期 : 20 0 7一01一16 , 改回日期 : 200 7一0 5一28 组经过长期的诱变筛选 , 实验中使用的是筛选获得的 高产菌株 G1 05 1 , 于4保藏于YM斜面 。 1 . 2 培养基与培养方法 斜面培养基( YM培养基 , %) : 葡萄糖 1 . 0 、 酵母 浸粉 0 . 3 、 蛋白陈 0 . 5 、 麦芽汁 0 . 3 、 琼脂 2 . 0 , pH5 . 0 。 种子培 养基(%) : 葡 萄 糖 3 , 0 、 酵母 浸粉 0 . 5 、 K H : Po . 0 . 2 、 N a H ZP O 4 0 . 1 、 MgS O ; 0 . 2 , 自来 水配 制 , pH 5 . 0 。 待优化培养基使用自来水配制 , pH 值 自然 。 斜面 上挑取 1环菌种于液体YM 培养基中 , 20 、 2 0 0 r / m i n 下摇床振荡培养3 6 h后作为种子 液 , 以1 0%接种量接种到装有5 0 mL 待优化培养基 的5。 。mL三角瓶 中 , 培养3 6 h , 离心收获得到菌体 。 在两 阶段发酵实验中 , 在生长培养基中培养3 6 h 的菌体 , 经1oo o r /m in 、 4离心1min 收获菌体 , 用无菌水洗涤 3 次 , 再接种到装 有5 0 mL 产物合成 培养基的50 0 mL三角瓶中 , 培养4 8 h 。 1 . 3 实验设计与数 据 处理 采用 正交设计法优化生长培养基 , 正交表为L 2 5 (5 ) 阁 , 因素和水平见表1 。 后用响应面法进行产物 合成培养基的优化 。 优化实验设计与结果分别 由正 交实验设计助手1 1和统计软件Mi n i Ta b 处理 , 响应 面图由Ma t la b 处理 。 所有实验至 少重复 2 次 。 1 . 4 分析方 法 1 . 4 . 1生物黄测定 取 5mL 发酵液 9o0 0 r /min离心8min , 蒸馏水 洗涤 、 离心 3次 , 10 5烘至恒重后称重 。 1 . 4 . 2 生长得率的计算 见参考文献 4 。 1 . 4 . 3 还原糖的测定 D N S法 5。 2 00 7年第3 3卷第8期(总第23 6期)6 5 1 . 4 . 4 总类胡萝卜素测定 参见文献6 。 见参考文献 6j 。 虾青素标准品(购于S I GMA) 作为外标 。 1 . 4 . 5 虾青素测定 裹1生长培养甚优化的实胜因索与水平 水平、 因素葡萄糖/%酵母浸粉/ % K H :P 认/% NaH ZP伪/ % Mgs o ; /% C aC12/ % 1 . 0 1 . 5 2 . 0 0 . 0 5 0 . 10 0 . 15 0 . 20 0 . 25 0 . 010 0 . 015 0 . 020 0 . 025 0 . 030 二JC甘亡J O0 11119目 . 0 八 UC 门 哎口 0 1卜口 00 1.11 9目 . o n 0 日 , ;: 八曰 0 几U o n 2 结果与分析 2 . 1 生长阶段培养墓优化 微生物生长需要碳源 、氮源和磷源等营养物质。 另 外 , Q Z十 可以改变细胞膜通透性 , 促进细胞与环境的物 质交换 , 有利于细胞生长 。 因此正交实验设计以葡萄 糖 、 酵母浸粉 、K 氏Pq 、 N a 践R人 、 吨以人 和公C1 2 进行 6 因素5水平的培养基组分优化实验 , 培养 36 h , 以生长 得率( Y x / s )作为实验结果进行分析 。 结果表明(表2和 表3 ) , 最优培养基成分为戊几q 玖 玛凡 , 即葡 萄糖 20 . 09/L , 酵 母 浸粉 3 . 0 以L 、 K H Z R人2 . 09/L 、 N a2H P ( 入1 . 0岁L 伽龟3巩 2 . 0 岁L和公C l : 0 . 3 创L 。 验 证优化培养基在培养3 6 h后 , 生长得率为0 . 3 5 9/g , 生 物量9 . 0 8 9/L , 虾青素产量 5 . 3 8 m g /L , 比未优化种子培 养基培养36h时分别提高了巧 . 7% , 2 4 . 12%和2 2 . 5% 。 衰2 正交实脸数据 A BCDEF K 一 0 . 1620 . 1460 . 1 940 . 1840 . 2020 . 184 K Z 0 . 19 6 0 . 1 8 60 . 1 9 20 . 2 1 6 0 . 19 20 . 158 K J 0 . 286 0 . 2 6 60 . 1 960 . 19 40 , 2 2 20 . 228 K 一 0 . 17 20 . 2 120 . 2 140 . 1 980 . 2040 . 2 1 2 K 5 0 . 18 60 . 1 920 . 2060 . 2100 . 18 20 . 220 R0 . 1240 . 1200 . 022 0 . 0 320 . 0 4 00 . 0 7 0 注 : AF分别表示芍萄糖 、 醉母浸粉 、 K H ZPO; 、 N aHZPO 、 Mg - S( ; 和C aC I: 。 表3正交实脸方差分析 因素 偏差平方和自由度 F比F 显著 A B C D E F 误差 0 . 04 9 0 . 0 3凡 0 . 0 02 0 . 0 0 3 0 . 00 4 0 . 017 0 . 00 24 . 500 19 . 0 00 1 . 0 0 0 1 . 5 00 2 . 00 0 8 . 5 00 : . : 639 6 . 39 6 . 3 9 6 . 39 注 :, 为显著性的水平标记 。 2 . 2 响应面 法优化产物合 成 阶段培养基 在红发 夫酵母分批培养中后期 , 代谢副产物 的生 成影响红法夫酵母生长和产物合成 。 作者 曾用连续 补料法培养法夫酵母 , 但与分批培养比较 , 生物量和 虾青素产量变化均不明显 。 因此 , 尝试在生长阶段培 养基中培养3 6 h后 , 将菌体全部转移到产物合成阶段 培养基中培养 。 2 . 2 . 1 分 式析因设计(F F D) 确定主效因子 Y a m ane 等人川在红发夫酵母细胞生长的稳定 期添加 0 . 3%的乙醇 , G u 等人 s j在各时期添加 0 . 2纬 乙醇 , 均提高了色素产量 , 因此在优化产物合成阶段 培养基时 , 添加 0 . 2%乙醇 。 采用分式 析因设计 (F FD)中部分重复因子2卜 设 计对葡萄糖 、酵 母浸 粉 、 K H ZP O4 、 N a: HPO ; 、 MgSO 、 乙醇等成分对虾青 素产量的影响效果进行评价 , 选出主效因子 。 以种子 培养基各成分浓度和 0 . 2%乙醇定为中心点值 , 进行 适当的扩充作为自变量 的取值范围 。 实验设计及结 果见表 4和表5 。 由回归结果可知 , 葡萄糖和醉母浸 粉的浓度对虾青素的产量 的影响显著 , 其余因素在 90%概率水平上并不 显著 。 方差分析( ANOVA )表 明 , F=19 , 大于 F 6 , 3 ,。 . 。: (4 . 62) , 相关系数 R , = 0 . 9 05 , 表明9 0 . 5%实验数据与回归方程拟合 。 2 . 2 . 2 最陡爬坡 试验 根据分式析因设计得出对于虾青素的产生最显 著的 2个因子(葡萄糖 、 酵母浸粉) , 用最陡爬坡法以 最快速 、 经济地逼 近最大产量区域 。 把其他组分固定 在 中心点水平上 , 改变葡萄糖和醉母浸粉的浓度 。 葡 萄糖以3 0 9/L 为起点 , 步长为59/ L ; 酵母浸粉以 59/ L 为起点 , 步长为 0 . 59/L 。 从表 6 中可以看出 , 处理 5 使虾青素产量达到最大 , 达到1 5 . 0 5 mg/L , 随后虾 青素产量开始下降 。 因此随后优化实验在处 理5附 近进行 。 根据最 陡爬坡试验 , 葡萄糖和酵母浸粉浓度 (g/L)以( 50 , 7 )为中心 , 采用 2 2中心 组合试验进行 , 实验设计及结果列 于表 7 。 由多项式回归 对此实验数据拟合所得二次多项 式方程为 : 6 6 2印7 VO . 33 NO . 8(TOta! 236) Y=15 . 0660+0 . 0 06 SX 一+ 0 . 3902X 2 一0 . 464 gX ,2 一0 . 579gXI一0 . 207SX ; X Z 衰4分式析因设计及其实脸结果 实验 序号 X 1 X Z X 3 X ; X o X 。 虾青素产盆 /m g . L 一 1 八 吕 通 竹J尸勺丹了 八曰OJ 内bU O O口 11Q甘八 U内 ,五 , 二 口. 盖 QdC,口 D O,臼O曰互J 二JA 扁O八 月了 , .nJ g翻 11口gr二,工 ,.二弓 .二.1 1 .1 ,.二11 11,1电.工 八 U 一一一 胜,l,1, .二11 U 一一一一 ,丈,上1111,10 一一一一 1111., .1卫立,人 n 一一 1二11 , .1111 1 1 一一一 111111.,.人1n 一一一 1上,臼咋 月btl 一l 1 一1 0 一1 0 一1 0 一1 一1 l 一l l 一1 一1 0 一1 1 l 10 . 3 6 13 . 07 1 2 . 1 5 10 . 72 1 1 . 66 13 . 26 10 . 37 10 。 67 表7中心扭合设计及实验结 果 实验 因素水平 虾青素产t 序号 X : X : /mg L 一 1一l一 11 3 . 25 21一11 3 . 89 3一111 4 . 66 41114 . 47 5001 5 . 14 6001 4 . 9 6 7001 5 . 07 80015 , 20 90014 . 98 101 . 4 1401 3 . 9 5 1 1一1 . 41401 423 1201 . 41414 . 26 130一1 . 4 141 3 . 4 6 注 : X : = (x l 一50)/5 , X : =(x : 一7)/0 . 5 , X l 、X : 分别表示翻萄 箱 、醉母浸粉. 裹8回归方程方整分析衰 方差来源平方和自由度均方 F尸 回 归 4 . 8018350 . 9 603728 . 22 。叨 ,! 一次项1 . 2 182320 . 609 1217 . 900 . 002 一 二次项 3 . 4 113721 . 705 6850 . 110 . 咖 ,. , 交互项 0 .1722210 . 1 72225 . 060 . 059 残 差 0 . 23 8 25 7 670 . 0 3 40 4 2 5 失拟项 0 . 198 7330 . 066 26 . 70 0 . 04 9 误差 0 . 039 5240 . 009 880 总离差 5 . 040 0812 八 目11,1 ,卫 二111 1 一一 n ,111,. 人,1 U 一一一一 nU , . 1电 .1, .盖11C 一一 一1 一1 . 且.1,1 一 目. 工,1.1 一一 1111d .1 八己 O 口 n,i内 乙内 j通 压 dC月O了 QU OJ ,且 孟 , . 盆.月 孟 ,.人,且. 上,且、 二 . 几 20一1一1111一 110 . 47 注 : X l = (x 一 3 0)/10 , X : 二(x : 一5)/0 . 5 , X 3 二(二:一2)/0 . 5 , X 4 =(x ; 一l)/0 . 5 , X S = (二5一l)/0 . 5 , X 。= x。一 2 , X l X 。分别表示 荀萄糖 、醉母浸粉、K H ZPO; 、 Na : H PO; 、Mg s o 。和 乙醉在实脸 中的规 范变l . x, x。为各规范变t 相应的 自然变t , 单位 : g/L 。 衰5分式析因设计对虾,索产t 回归分析的结果 参数 回归系数 t一值 显著性水 平 截距 11 . 526 999 . 460 . 0 0 0 .“ X 1 1 . 166 910 . 0 70 . 0 0 0 二 苦 . X Z 0 . 311 92 . 6 90 . 0 20 二 X 3 0 . 0 769 0 . 6 90 . 520 X 一 0 . 21 191 . 830 . 092 X o 0 . 1 1 4 40 . 9 90 . 3 4 3 X 一0 . 10 06一0 . 8 70 . 402 R Z =0 . 905 ,F =1 9)F 一3 . 0 . 0 1= 4 . 62 注 : , 为显著性的水平标记 , , 代表 p。 . 0 1, 一 代表 尸 0 . 05 ;, 代表 P0 . 10 。 衰 最 陡爬 坡试 脸及其实脸结果 实验序号 X , X : 虾青素产t/mg L一 13 05 . 011 . 6 2 23 55 . 512 . 76 34 06 . 0 13 . 6 6 4 45 6 . 5 14 . 22 5507 . 0 15 . 0 5 65 57 . 514 . 06 76 08 . 0 12 . 49 3 . 2 . 3 中心组合实验 回归方程方差分析(表8 )表明 , 回归 、一 次项 和 二次项显著 , 说明各个因子 的变化对相应值的影响不 是简单的线性关系 。 失拟项不 显著 , 相关系数R - 0 . 9 52 , 表明方程对实验拟合较好 。 通过回归方程用 Ma t l ab软件绘制Y(虾青素产量)关于X , (葡萄糖浓 度)和 X : (酵母浸粉浓度)的三维响应面 图(图1 )和 二维等高图(图 2) 。 从响应面 图直观地看 出 , 虾青素 产量存在最大值 , 即X : 、X: 存在极值点 , 且极值落在 试验区域之内 。 等高图中 , 等高曲线呈椭圆形 , 说明 葡萄糖浓度与酵母浸粉浓度在影响虾青素的产量时 存在明显的交互作用 。 用Ma t la b 软件对回归方程求 偏导 , 得到各因子 的最佳水平 , 葡萄糖 为 4 9 . 79/L , 酵母浸粉为 7 . 29/L 。 虾青素产量预测最大响应值 为1 5 . 1 35mg/L 。 重复验证实验得到生物量和虾青 素产t 分别 为 16 . 8 9/L 和( 1 5 . 015士0 . 12)mg/L , 分别比优 化前1 0 . 7 5 9/L 和n . 6 7 mg/L 提高了 5 6 . 3%和2 8 . 7% 。 比汪文俊闭等报道的采用分批培 养方 式获 得的 生物量1 0 . 1 5 9/L 和虾青素产 t 12 . 55mg/L 提高了 66%和2 1% 。 培养基中碳源 、 氮源对红 法夫酵母细胞生长和虾 20 07年绝3 3 卷第8期(总第23 6期) 6 7 青素合成影响显著 , 高C/N抑制蛋白质的合成 , 降低 合成代谢所需 NADPH 的量从而促进虾青 素的合 成 l 0 。 从研究结果看 , 生长 阶段培养基C/N稍低 , 符合红法夫 酵母生产虾青 素对 C/N 需求 , 与 Y a - m an e ll 0 1的结果一致 。 同时 , 结果也显示适当提高碳 源和氮源的浓度有利于虾青素的合成 。 本文中采用 两阶段法研究培养基配方 , 解除了分批培养后期生成 的代谢副产物对产物合成的抑制作用 , 结果揭示了红 法夫酵母生长及虾青素合成的不同阶段对培养基成 分和浓度的不同需求 。 此外 , 实验中还在两阶段培养 基中分别添加 C aC I : 和乙醇等促进细胞生长和虾青 素合成的成分 , 显著地提高了虾青素的产量 。 参考 文 献 1 王菊芳 , 吴振强 , 梁世中 . 虾青素的生理功能及其应用【J . 食品与发醉工业 , 2000 , 2 6(z) : 6669 2A n G H , Seh u m a n DB , Joh n so n EA . 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