酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究.pdf_第1页
酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究.pdf_第2页
酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究.pdf_第3页
酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究.pdf_第4页
全文预览已结束

下载本文档

版权说明:本文档由用户提供并上传,收益归属内容提供方,若内容存在侵权,请进行举报或认领

文档简介

发 酵 科 技 通 讯 第3 7卷 谷胱甘肽( L - -谷氨酰- L -半胱氨酰-甘氨酸) 是三肽化合物,作为机体内重要的生物活性巯基 物质,谷胱甘肽对于维持生物体内合适的氧化还 原环境起着至关重要的作用 1 , 广泛存在于动植 物以及微生物体内, 其中以酵母、 谷物种子、 胚芽、 人体和动物的心脏、 肝脏、 肾脏、 红细胞和眼睛晶 状体中含量较高 2 。 G S H的制备方法包括化学法、 酶法、 发酵, 其 中发酵法是最具潜力的方法 3 ,4,5 , 由于G S H存在 于细胞内, 所以要得到G S H, 首先必须采用一定 的破壁手段, 使G S H溶出。目前关于酵母破壁的 研究较多, 大体可归纳为: 化学破壁 酸解、 碱解、 物理破壁 液体剪切、 固体剪切等、 生物破壁酶 解、自溶。但是目前的方法尚存在一些问题。如 G S H不稳定, 无法满足食品、 医药等领域所要求 的产品纯度高, 采用溶剂无毒等 6 。 本文以啤酒酵母为研究对象,采用高效液相 色谱法检测样品G S H纯度, 对热水提取法和酒精 提取法提取效果进行比较,从而找出适合的提取 条件。 1材料和方法 1 . 1材料 啤酒酵母菌种:由上海复旦大学微生物研究 室提供。 1 . 2主要试剂 亚硝基铁氰化钠(天津科密欧化学试剂有限 公司); 庚烷磺酸钠(天津傲然精细化工研究所) ; 牛 血清白蛋白(上海蓝季科技有限公司); 考马斯亮 蓝G - 2 5 0 (上海蓝季科技有限公司); 还原型谷胱 甘肽标准品(上海伯奥生物科技有限公司进口分 装); 其余试剂均为分析纯。 1 . 3仪器 L C - 1 0 0高效液相色谱仪(上海伍丰科技仪器 有限公司);7 5 2可见分光光度计(上海光谱仪器有 限公司);L G J - 1 2冷冻干燥机(北京松源华兴科技 发展有限公司);A L 1 0 4电子分析天平(上海梅特 勒-托利多仪器有限公司) 1 . 4分析方法 1 . 4 . 1啤酒酵母的预处理 用0 . 9 %生理盐水洗菌体3次,去除杂质, 以 得到纯净的啤酒酵母。 1 . 4 . 2G S H抽提方法 热水提取G S H称取一定量的酵母, 加入水, 混匀, 使混合液保持在9 5 1 0 0 一段时间后放置 冰水中速冷, 离心, 取上清液。通过测定提取液中 G S H的含量, 计算湿菌体, 于菌体中G S H的含量。 乙醇提取G S H称取一定量的酵母按比例与 乙醇混合均匀, 室温下搅拌一段时间, 离心, 取上 清液。通过测定提取液中G S H的含量, 计算湿菌 体, 干菌体中G S H的含量。 1 . 4 . 3G S H含量检测方法 亚硝基铁氰化钠法 7 检测G S H含量。 高效液相检测样品中G S H纯度 8 酵母中还原型谷胱甘肽的提取方法研究 舒嫒 王家骐 朱立江 黄娟 许铁成 (河北梅花味精集团有限公司 河北 廊坊0 6 5 7 0 2 ) 摘要:采用热水和乙醇提取啤酒酵母中的还原型谷胱甘肽( G S H )。 研究表明, 在室温条件下, 按菌 体与乙醇比例1:2 ( W/ V )加入5 0 %的乙醇,2 0 0 rm i n - 1 , 搅拌2 h, 能有效地提取G S H, 干酵母谷胱甘肽含 量2 . 0 1 %。与热水提取法比较, 乙醇提取液量少, 过滤, 浓缩时间短, 所得样品纯度较高, 从而大大减少了 后续纯化的工作量, 并且乙醇可回收重复使用, 因此乙醇提取法是一种有效的提取方法。 关键词: 谷胱甘肽; 啤酒酵母; 提取 1 6 发 酵 科 技 通 讯 第3 7卷第3期 2 0 0 8年7月 表2正交实验结果 表1乙醇提取G S H的因素水平表 A 提取时间( h ) B 搅拌速率( r p m ) C 料液比 ( g / m l ) D 乙醇浓度 ( %) 112 0 01 : 13 0 223 0 01 : 24 0 334 0 01 : 35 0 水平 因素 D i s c o v e r C 1 8柱( 2 5 0 m m 4 . 6 m m,5 m );流动 相: 磷酸盐溶液(取磷酸二氢钠6 . 8 0 g, 庚烷磺酸钠 2 . 2 0 g, 加水溶解使成1 0 0 0 m l, 用磷酸调节p H值 至3 . 0 ) -甲醇( 9 7:3 );流速:1 m l / m i n,检测波长 2 1 0 n m, 柱温3 0 , 进样2 0 l。 标品: 称3 0 m g , 置 1 0 0 m l容量瓶。 样品:分别将热水和乙醇提取法提取得到的 提取液, 浓缩, 无水乙醇沉淀, 沉淀经真空冷冻干 燥,为待测样品。称取适量样品(约相当于 G S H 0 . 3 g ) , 置 1 0 0 m l容量瓶中, 加水稀释, 摇匀, 精 吸取5 m l , 置 5 0 m l量瓶中, 加水至刻度。 1 . 4 . 4蛋白质含量的测定 考马斯亮蓝G - 2 5 0法。 结晶牛血清白蛋白, 用0 . 1 5 m o l / LN a C 1制成 l m g / m L蛋 白 溶 液 , 分 别 吸 取0 . 0 1、0 . 0 2、0 . 0 3、 0 . 0 4、0 . 0 5、0 . 0 6 m L, 各 以0 . 1 5 m o l / LN a C 1补 至 0 . 1 m L, 然后加入0 . 1 m g / m L考马斯亮蓝G - 2 5 0溶 液5 m l, 摇匀,1 h内以不加试剂为空白, 在5 9 5 n m 波长下测吸光度, 制作标准曲线。配1 m g / m l多糖 样品溶液, 按上述方法操作测吸光度, 以标准曲线 计算样品中蛋白质含量。 2结果与讨论 2 . 1热水提取 2 . 1 . 1提取时间对热水提取G S H效果的影响 采用热水提取法抽提G S H, 酵母与4倍体积 的沸水混合均匀, 每隔2 m i n取样检测, 以确定最 佳的提取时间。 由图1可以看出, 热水提取1 2 m i n以后, 干酵 母中G S H含量为1 . 9 0 5 %, 随着浸提时间的延长, G S H含量随之下降, 这可能是由于在加热的条件 下G S H不稳定, 向G S S H转化, 造成了部分损失。 所以提取时间确定为2 h。 2 . 1 . 2料液比对热水提取G S H效果的影响 称取等量酵母分别加入1,2,3,4,5,6倍体积 的沸水混合均匀, 提取1 2 m i n取样检测, 以确定最 佳的提取料液比2。 由图2可看出,随着加水量的增加,浸出的 G S H含量提高, 加水4倍体积时, 提取G S H含量 达1 . 8 6 5 %,随加水量的增加,G S H含量无明显提 高, 考虑到加水量过高会延长上清液浓缩时间, 加 大不必要的工作量, 故加水量选取为1 : 4。 2 . 2乙醇提取 通过单因素试验发现提取时间, 搅拌速率, 料 液比, 乙醇浓度等因素对提取效果有影响。 因此在 单因素试验的基础上, 以干酵母中G S H含量为主 要指标, 选定提取时间, 搅拌速率, 料液比, 乙醇浓 度四因素, 进行L 9( 3 4 )正交实验。 图2料液比对热水提取G S H的影响 图1提取时间对热水提取G S H的影响 实验号ABCD含量( %) 111110 . 4 3 212221 . 6 4 313331 . 4 5 421232 . 0 1 1 7 发 酵 科 技 通 讯 第3 7卷 522311 . 3 8 623121 . 0 4 731321 . 2 5 832231 . 8 3 933110 . 9 8 K13 . 5 23 . 6 92 . 4 52 . 7 8 K24 . 4 34 . 8 55 . 4 84 . 5 1 K34 . 0 63 . 4 74 . 0 84 . 8 9 k 11 . 1 71 . 2 30 . 8 20 . 9 3 k 21 . 4 81 . 6 21 . 8 31 . 5 0 k 31 . 3 51 . 1 51 . 3 61 . 6 3 R0 . 3 10 . 4 71 . 0 10 . 7 由表2分析得出,各因素对产物的影响顺序 为:C D B A , 即料液比乙醇浓度搅拌速率浸 提时间。乙醇提取G S H的最佳工艺条件为: A2B 1C2D3, 即搅拌速率2 0 0 r m i n - 1 , 提取乙醇浓度 5 0 %, 料液比1 : 2, 浸提时间2 h。 2 . 3两种提取方法对样品纯度的影响 2 . 3 . 1两种提取方法样品含量比较 由于G S H分子量很小,在水中的溶解度很 大, 扩散要比大分子快得多, 受到的阻力较小, 在 细胞不完全破碎的条件下,只要细胞表面产生一 些裂缝, 就可以顺利地扩散到溶剂中, 所以利用一 些条件相对温和的方法在提取G S H等小分子物 质方面是可行的 9 。通过比较可以看到, 热水提取 法提取时间短, 方法简便, 由于温度较高,G S H的 提取率比乙醇提取法稍低, 但是热水提取G S H的 同时有大量的蛋白质, 核酸等杂质溶出。 试验结果 表明, 乙醇提取法是一种较温和的提取方法, 提取 时间较热水提取时间长, 但料液比例小, 可大大缩 短离心,浓缩提取液的时间,并且乙醇可回收利 用,G S H损失少, 杂质含量较低。 2 . 3 . 2H P L C测定两种提取方法样品纯度 由 图3可 见G S H对 照 品 的 出 峰 时 间 为 1 2 . 9 8 m i n。将图4与图5进行比较可以看出, 热水 提取所得样品谱图中含有许多其他组分,表明杂 质含量较多, 样品G S H纯度为1 3 . 5 6 %, 而乙醇提 取所得样品谱图中部分组分峰面积减小,甚至已 经不存在, 表明杂质含量减少, 样品G S H纯度为 1 9 . 8 6 %。测定结果表明, 乙醇提取法所得样品蛋 白质、 核酸、 色素等杂质溶出量少, 纯度较高, 从而 减少了后续分离纯化的工作量。 表3两种提取方法比较 方法 干酵母 G S H含 量% 蛋白质提 取率% 料液比 W/ V 时间m i n 热水提取1 . 9 0 53 9 . 5 61 : 41 2 乙醇提取2 . 0 12 9 . 1 81 : 21 2 0 图3 G S H标准色谱图 图4热水提取样品色谱图 图5乙醇提取样品色谱图 1 8 发 酵 科 技 通 讯 第3 7卷第3期 2 0 0 8年7月 3结论 实验结果表明, 酵母, 加入4倍体积的水, 使 混合液保持在9 5 - 1 0 0 ,1 2 m i n,所得G S H含量 最高。通过正交实验测定乙醇提取法的最佳工艺 条件为: 搅拌速率2 0 0 r p m, 提取乙醇浓度5 0 % , 料 液比1 : 2, 浸提时间2 h。用H P L C检测两种提取方 法所得的样品G S H纯度, 从谱图可以看出, 乙醇 提取所得样品杂峰相对较少,纯度达1 9 . 8 6 % , 优 于热水提取法。 虽然乙醇提取法较热水提取法提取时间长, 但料液比较小, 可有效地减小下一步过滤, 浓缩的 工作量, 无需加热, 提取G S H损失少, 蛋白质、 色 素、 核酸等杂质溶出少, 所得样品纯度较高, 有益 于后续的分离纯化, 并且乙醇可回收利用, 降低了 成本。实验表明乙醇提取法是一种有效的提取谷 胱甘肽的方法。 参考文献: 1 P e n n i n c k xM . As h o r t r e v i e wo nt h er o l eo f g l u t a t h i o n ei n t h er e s p o n s eo fy e a s tt on u t r i t i o n a l , e n v i r o n m e n t a l , a n d o x i d a t i v e s t r e s s e s J . E n z y m e M i c r o bT e c h n o l , 2 0 0 1 , 2 6 ( 9 - 1 0 ) : 7 3 7 - 7 4 2 . 2 郑建仙, 功能性食品 M .北京: 中国轻工业出版社. 1 9 9 5 . 3 林金萍, 李华钟, 李寅等.中国医药工业杂志 J . 2 0 0 0,3 1 ( 5 ): 2 3 6 - 2 3 9 . 4 周楠迪, 李寅, 陈坚.从酵母细胞中回收谷胱甘肽 J . 1 9 9 7,7 ( 4 ):3 0 - 3 3 . 5 K i m u r a H i k a r i , I n o u e Y o s h i h a r uK o b y a s h i S u s u n u : P r o d u c t i o n o f G l u t a t h i o n e P , P a t e n t o f J a p a nP n : 0 8 - 7 0 7 8 8 4 , 1 9 9 6 . 0 3 . 1 9 . 6 潘飞, 邱雁临, 黄欣.啤酒废酵母中还原型谷胱甘

温馨提示

  • 1. 本站所有资源如无特殊说明,都需要本地电脑安装OFFICE2007和PDF阅读器。图纸软件为CAD,CAXA,PROE,UG,SolidWorks等.压缩文件请下载最新的WinRAR软件解压。
  • 2. 本站的文档不包含任何第三方提供的附件图纸等,如果需要附件,请联系上传者。文件的所有权益归上传用户所有。
  • 3. 本站RAR压缩包中若带图纸,网页内容里面会有图纸预览,若没有图纸预览就没有图纸。
  • 4. 未经权益所有人同意不得将文件中的内容挪作商业或盈利用途。
  • 5. 人人文库网仅提供信息存储空间,仅对用户上传内容的表现方式做保护处理,对用户上传分享的文档内容本身不做任何修改或编辑,并不能对任何下载内容负责。
  • 6. 下载文件中如有侵权或不适当内容,请与我们联系,我们立即纠正。
  • 7. 本站不保证下载资源的准确性、安全性和完整性, 同时也不承担用户因使用这些下载资源对自己和他人造成任何形式的伤害或损失。

评论

0/150

提交评论