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现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.8 770 金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响 金属离子浓度对枯草芽孢杆菌芽孢率的影响 姚露燕，张水华，曹昱，王永华 （华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640） 摘要通过摇瓶单因素试验，研究了金属离子浓度对枯草杆菌 BS-MM03 菌株发酵生产的芽孢率的影响，发现 Mg2离子对其影 响最为显著，其次为 Mn2离子。利用正交试验确定其最适产芽孢的金属离子浓度组合为Mg2 0.030、Mn2 0.015、Ca2 0.02、 Fe2 0.004。 关键词枯草芽孢杆菌；金属离子；芽胞率 中图分类号Ts201.3；文献标识码A；文章篇号1673-9078200808-0770-03 Effect of Metal Ion Concentration on Sporulation Efficiency of Bacillus subtilis YAO Lu-yan, ZHANG Shui-hua, CAO Yu, WANG Yong-hua （College of Light Industry and Food Sciences，South China University of Technology, Guangzhou 510640, China） Abstract By single factor experiments, the effect of metal ion concentration on sporulation efficiency of Bacillus subtilis BS-MM03 was examined. Among the examined ions, Mg2 ion showed the highest effect on sporulation efficiency, followed by Mn2 ion. Orthogonal experiment showed that the optimal ion concentrations was as follows Mg2 0.030,Mn20.015,Ca2 0.02 and Fe2 0.004。 Key words Bacillus subtilis; metal ion; sporulation efficiency 枯草芽孢杆菌 （Bacillus subtilis） 作为有益的根际 微生物，近年来越来越受到人们的广泛关注，目前在 净化水产养殖环境、农作物病害防治、家禽饲料添加 剂等方面取得较好的效果。然而，国内外对枯草芽孢 杆菌的研究大都把视线放在了营养体细胞和代谢物质 上，而对芽孢杆菌的抗逆性休眠体芽孢，却研究 得不多。 枯草芽孢杆菌的芽孢较其营养体细胞易保存，复 活率高，是制备枯草芽孢杆菌制剂的理想存在形式， 而制剂中的芽孢含量是影响制剂应用效果的关键因 素。芽孢的形成受环境因素的影响，不同菌种形成芽 孢的条件不同，因此，一些学者对枯草芽孢杆菌的发 酵培养进行了研究， 以期获得较高的含菌量或芽孢量。 张丽霞等[1]采用 Plackett-bruman 设计法和响应面分析 法，在摇瓶发酵条件下，使含菌量明显提高；张根伟 [2]通过单因素试验和正交试验，对枯草芽孢杆菌 BS-6 的液体发酵条件进行了研究。本文就金属离子对枯草 芽胞杆菌菌株 BS-MM03 的芽胞产率的影响进行了研 究，以期获得较高的芽胞产率，为枯草芽孢杆菌制剂 的产业化生产提供基础资料。 收稿日期2008-03-24 1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 菌种 本实验室提供，编号为 BS-MM03。 1.1.2 仪器与试剂 仪器YXQ-LS-30SⅡ灭菌锅、ZHWY-200D 恒温 摇床、YSEI 生化培养箱、ACCULLAB，ALC-210.4 电子天平、eppendorf 移液枪、sartorius，PD-10 酸度 计。 试剂牛肉膏、蛋白胨、玉米浆为市售，NaCl、 KCl、MgCl2、MnCl2·H2O、FeCl2、CaCl2均为分析纯。 1.1.3 培养基 种子培养基LB 培养基 基本培养基DSM 培养基[3]，蛋白胨 1、牛肉 膏 0.3、NaCl 0.5、KCl 0.2、 MgCl2 0.03、CaCl2 0.01、MnCl2 0.01、FeCl2 0.003，pH 为 7.1；121 ℃灭菌 20 min。 检测培养基LB 琼脂培养基 1.2 方法 1.2.1 种子培养 以无菌操作从斜面挑取一环至装有20 mL种子培 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.8 771 养基的 100 mL 锥形瓶中，将锥形瓶置于 200 r/min、 37℃恒温摇床中培养 78 h。 1.2.2 摇瓶培养 以 2接种量将种子接入装有 50 mL 培养基的 250 mL 锥形瓶中，并于 200 r/min、37 ℃恒温摇床培 养 18 h。 1.2.3 活菌和芽孢计数 活菌计数以平板涂布法进行计数，培养基为 LB 培养基。 芽孢计数将样品在 80 ℃水浴中处理 15 min 后 进行平板涂布计数。 2 结果与讨论 2.1 Mg2离子的影响 本实验选择了初始 MgCl2含量为 0.010、 0.030、0.050、0.070、0.090的摇瓶培养基，其 它试剂含量与基本培养基相同， 培养 18 h 后结果见图 1。由测定结果可以看出，随着 MgCl2含量的升高， 活菌数、芽孢数和芽孢率呈先升后降的趋势，其含量 为 0.03时活菌数、芽孢数和芽孢率均达到最大。有 文献报道 Mg2离子有利于活菌的生长但不利于芽孢 的生成[6]， 在本实验中只在 MgCl2含量大于 0.030后 活菌数和芽孢率均下降。 图 1 Mg 2离子含量对芽孢率的影响 Fig.1 Effect of Mg 2 ion concentration on sporulation efficiency 2.2 Mn2离子的影响 本实验选择了初始 MnCl2含量为 0.001、 0.005、0.010、0.015、0.020的摇瓶培养基，其 它试剂含量与基本培养基相同， 培养 18 h 后结果如图 2。由测定结果可以看出，随着 MnCl2含量的升高活 菌数、芽孢数和芽孢率也逐渐升高，但当含量超过 0.015后三者均开始下降。 有文献报道 Mn2离子对活菌的生长和芽孢的生 成都有促进作用，但当含量达到某一域值时，将呈现 抑制趋势[4,5]，本实验结果也符合这样的趋势。 图 2 Mn 2离子含量对芽孢率的影响 Fig.2 Effect of Mn 2 ion concentration on sporulation efficiency 2.3 Ca2离子的影响 本实验选择了CaCl2初始含量为0.010、 0.020、 0.030、0.040、0.050的摇瓶培养基，其他试剂含 量与基本培养基相同，培养 18 h 后结果如图 3。由测 定结果可以看出，CaCl2含量对活菌数的影响不显著， 但对芽孢率有一定的影响， 在含量为0.020时芽孢率 最高。 图 3 Ca 2离子含量对芽孢率的影响 Fig.3 Effect of Ca 2 ion concentration on sporulation efficiency 2.4 Fe2离子的影响 图 4 Fe 2离子含量对芽孢率的影响 Fig.4 Effect of Fe 2 ion concentration on sporulation efficiency 本实验选择了FeCl2初始含量为0.002、 0.004、 0.006、0.008、0.010的摇瓶培养基，其它试剂含 量与基本培养基相同，培养 18 h 后结果如图 4。由测 定结果可以看出， FeCl2含量对活菌数、 芽孢数和芽孢 率有一定影响， 当其含量为 0.004时三者均达到最大 值。 2.5 正交试验 现代食品科技 Modern Food Science and Technology 2008, Vol.24, No.8 772 使用 L9正交实验对 MgCl2、 MnCl2、 CaCl2、 FeCl2 四个因素进行 4 因素 3 水平正交实验，设计见表 1， 结果见表 2。 表 1 正交设计 Table 1 Orthogonal Design 因素水平 MgCl2/ MnCl2/ CaCl2/ FeCl2/ 1 0.010 0.005 0.005 0.001 2 0.030 0.015 0.020 0.004 3 0.050 0.025 0.035 0.007 表 2 正交实验 Table 2 Results of the orthogonal experiments 实验号 MgCl2/ MnCl2/ CaCl2/ FeCl2/ 芽孢率/ 1 1 1 1 1 69 2 1 2 2 2 76 3 1 3 3 3 74 4 2 1 2 3 81 5 2 2 3 1 89 6 2 3 1 2 79 7 3 1 3 2 73 8 3 2 1 3 77 9 3 3 2 1 76 K1 219 223 225 234 K2 249 242 233 228 K3 226 229 236 232 k1 73.0 74.3 75.0 78.0 k2 83.0 80.7 77.7 76.0 k3 75.3 76.3 78.7 77.3 R 10 6.4 3.7 2 从表 2 知，各种因素当中，MgCl2含量对芽孢率 的影响最大，其次是 MnCl2含量和 CaCl2含量，FeCl2 含量的影响最小，最优因素组合为 0.030的 MgCl2、 0.015的 MnCl2、 0.035的 CaCl2和 0.001的 FeCl2。 3 结论 芽孢是产芽孢细菌在生长过程中形成的一种抗逆 性休眠体，并非细菌生活史不可缺少的部分，它的形 成受营养物质和环境因素的影响。 通过本实验发现金属离子对 BS-MM03 枯草芽孢 杆菌发酵生产的芽孢产率有影响， 其中 Mg2离子的影 响最为显著， 其次为 Mn2离子，其最适产芽孢的金属 离子含量组合为Mg2 0.030、Mn2 0.015、Ca2 0.02、Fe2 0.004。 参考文献 [1] 张丽霞,李荣禧,王琦,等.枯草芽孢杆菌发酵培养基的优化 [J].中国生物防治,2006,22增刊82-88 [2] 张根伟.枯草芽孢杆菌 BS-6 液体发酵条件的研究[J].河北 省科学院学报,2005,22154-57 [3] Sandra M. 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