酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究.pdf

第 24 卷 第 4 期农 业 工 程 学 报Vol.24No.4 2402008 年4 月Transactions of the CSAEApr. 2008 酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究 苏东林 1,2,3，单 杨1,2,3，李高阳1,2,3，张菊华1,2,3，张 群1,2,3 （1湖南省农产品加工研究所，长沙 410125；2国家柑橘加工技术专业研发分中心，长沙 410125； 3国家柑橘质量安全监督检验中心，长沙 410125） 摘要：为了充分利用农业废弃物柑桔皮，进一步提高柑桔皮中总黄酮的提取效率，在单因素试验的基础上，采用中心 组合设计对柑桔皮总黄酮纤维素酶法辅助提取工艺中的提取时间、提取温度、pH 值和酶用量 4 因子的最优化组合进行 了定量研究，建立并分析了各因子与黄酮得率关系的数学模型。结果表明：最佳的工艺条件为酶用量 0.55%、提取时间 123 min、pH 值 4.4、温度 48。经试验验证，在此条件下，黄酮得率为(3.51 0.13)%，与理论计算值 3.62%基本一致。 说明回归模型能较好地预测柑桔皮中总黄酮的提取得率。 关键词：柑桔皮；总黄酮；纤维素酶；数学模型；响应面法 中图分类号：TS209；R284.2文献标识码：A文章编号：1002-6819(2008)-4-0240-06 苏东林，单杨，李高阳，等酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究J.农业工程学报，2008，24(4):240245. Su Donglin, Shan Yang, Li Gaoyang, et al. Technology optimization for extracting total flavonoids from citrus peel by enzyme assisted technique J. Transactions of the CSAE, 2008,24(4):240245. (in Chinese with English abstract) 0引言 柑桔是世界上产量最大的水果之一，无论是鲜食还 是加工，皮是其主要副产物，约占果实重的 20%。榨汁 或制罐后的皮渣相当于柑桔投入量的 40%50%， 造成柑 桔加工业产生大量的皮渣1。2004 年世界柑桔产量达到 1.08 亿 t；中国柑桔产量超过 1400 万 t，居世界第二位2。 目前，国内大量的皮渣仅极少部分被再利用，绝大部分 被直接丢弃或填埋，不仅严重浪费了资源，更对环境造 成巨大危害。而国外已将其开发应用于化学、染料、清 漆和化妆品等领域，开发出果胶、香精油、膳食纤维、 类黄酮等产品3。柑桔皮所含营养成分除氨基酸外，其余 均高于果肉，特别是其中富含的黄酮类等活性物质，使 柑桔皮及其提取物具有抗氧化、防止心血管疾病、消炎 镇痛和抗病毒等多重生理功效4 7。 近年来，不少学者对柑桔皮中黄酮类物质的提取技 术进行了多方面积极和有益的探索，但主要还是集中在 对传统提取方法的优化改良上；酶法（主要是纤维素酶、 果胶酶、蛋白酶等及其复合酶类）已逐渐作为提取生物 活性成分的新兴技术得到了广泛的应用8 10， 然而有关于 酶法技术在柑桔皮黄酮类物质提取中的应用鲜见报道。 收稿日期：2007- 05- 24修订日期：2008- 02- 19 基金项目：国家高技术研究发展计划(2007AA10Z307)；湖南省“十一五” 重大科技专项(2006NK1002)；湖南省农业科学院“青年学术带头人培养计 划”(20051510) 作者简介：苏东林(1979)，男，湖南邵东人，主要从事食品生物技术及农 产品精深加工研究。长沙湖南省农产品加工研究所，410125。 Email: sdl791228 通讯作者：单杨(1963)，男，湖南攸县人，研究员，博士生导师，主 要从事农产品开发加工及食品生物技术研究。 长沙湖南省农产品加工研究 所，410125。Email: sy6302 与传统提取方法相比，酶法提取具有无毒性、效率高、 反应条件温和及催化活力可被调节控制等优势11。因此， 本文着重对纤维素酶辅助提取柑桔皮黄酮的工艺进行了 较详细的研究，以期改善传统溶剂提取法的不足，为柑 桔皮总黄酮的进一步开发利用提供技术参考和支持。 1材料与方法 1.1试验材料 干燥柑桔皮（温州蜜柑） ，湖南熙可食品股份有限公 司提供，粉碎过 60 目筛后备用。 1.2主要试剂及仪器 芦丁（生化试剂，中国医药（集团）上海化学试剂 公司） ；纤维素酶（15 U/mg，上海东风生化技术有限公 司） ；无水乙醇、氯化铝均为国产分析纯，自配缓冲液。 DHG 9240A 型电热恒温鼓风干燥箱（上海精宏试验 设备有限公司） ； FA1104 上皿电子天平 （上海精科天平制 造） ；DK 98 1 型电热水浴锅（天津市泰斯特仪器有限公 司） ；UV 2450 型紫外可见分光光度计（日本岛津） ； FW100 型高速万能粉碎机（天津市泰斯特仪器有限公 司） ；DELTA320 型 pH 计（梅特勒托利多仪器（上海） 有限公司） 。 1.3试验方法 1.3.1提取工艺流程 柑桔皮55条件下烘干粉碎后过 60 目筛酶法 提取测定黄酮得率。 1.3.2黄酮类物质含量的测定 1）标准方程的建立 AlCl3法12显色（30%乙醇作溶剂） ， 用紫外可见分光 光度计在 275 nm处比色测定不同浓度芦丁标准品溶液吸 第 4 期苏东林等：酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究241 光度，绘制标准曲线： )9998. 0(0002. 0891.28 2 Rx（1） 式中 A 吸光度；x 芦丁含量，mg/mL。 2）样品中黄酮类物质含量的测定 取各组不同试验条件下所得的定容样液依法显色； 按下式计算柑桔黄酮得率（以芦丁计） 。 100 891.281000m 2500)0.0002-A( (%) y（2） 式中y 黄酮得率， %； A 样液的吸光度；m 各组试验样品质量，g；2500 总的稀释倍数。 2试验设计 2.1单因素试验 通过预试验，确定对酶用量、乙醇浓度、液固比、 提取时间、pH 值和提取温度进行单因素试验（n=2） 。 2.2优化试验 在单因素试验的基础上，确定酶用量、提取时间、pH 值和提取温度作为中心组合试验因子，见表 1。 表 1中心组合试验因素水平编码表 Table 1Coded levels of variables of the central composite experimental design (CCD) 因素 水平 纤维素酶用量 x1/%时间 x2/minpH 值 x3温度 x4/ +20.6140760 +10.5130655 00.4120550 -10.3110445 -20.2100340 j 0.11015 注：j=(Z2j- Z1j)/2；Z1j和 Z2j分别表示因素 Zj的下水平和上水平。 2.3数据分析 单因素试验数据使用Microsoft Excel软件；中心组合 试验数据使用The SAS(Statistical Analysis System) System for Windows 9.0(简体中文)试验版。 3结果与分析 3.1单因素试验分析 3.1.1酶用量对黄酮提取得率的影响 变动酶用量，在液固比为 25、提取时间 120 min、pH 值为 5、提取温度 50、乙醇浓度 75%的条件下提取并 测定对应的黄酮得率，结果如图 1 所示。 纤维素酶在酸性介质中催化柑桔皮中的纤维素水 解，使细胞壁部分破损，令细胞内的膜系统发生变形或 破裂，从而增加了膜的渗透性，减少了黄酮向主体溶剂 的扩散传质阻力，有利于桔皮黄酮的浸出。由图 1 可看 出：开始阶段，黄酮的得率随酶用量的增加而大幅上升； 在达到 0.6%以后，黄酮的得率随酶用量的增加而下降。 这是因为在试验条件下，酶量低于最佳值时，酶解未进 行完全；达最佳值时，酶解进行较完全；此时如果继续 加大酶量，底物浓度不能对酶达到饱和，导致酶的作用 受到抑制。 图 1不同纤维素酶用量对黄酮得率的影响 Fig.1Effects of different mass ratios of cellulose to solution on flavonoid yield 3.1.2乙醇浓度对黄酮提取得率的影响 变动乙醇浓度，在酶用量 0.4%、液固比为 25、提取 时间 120 min、pH 值为 5、提取温度 50的条件下提取 并测定对应的黄酮得率，结果如图 2 所示。 图 2不同乙醇浓度对黄酮得率的影响 Fig.2Effects of different ethanol concentrations on flavonoid yield 从图 2 可看出：当乙醇浓度小于 80%时，随着乙醇 浓度的增加，黄酮的得率随之增加；在 80%时达到最大 值，此后，随着乙醇浓度的增加，黄酮的得率随之减少。 这可能是过高浓度的乙醇不仅抑制了酶的活性；同时， 一些醇溶性杂质、亲脂性强的成分溶出量增加，这些成 分与桔皮黄酮竞争乙醇水分子结合，使溶液黏度变大， 增大了传质过程中溶剂的阻力，减缓了桔皮黄酮向主体 溶剂的扩散，减少了粉末表面与溶剂之间桔皮黄酮的浓 度差，从而导致桔皮黄酮提取得率的减少。 3.1.3液固比对黄酮提取得率的影响 变动液固比，在乙醇浓度80%、酶用量0.4%、提取 时间120 min、pH值为5、提取温度50的条件下提取并 测定对应的黄酮得率，结果如图3所示。 从图3可看出，当液固比25时，随着液固比的增 加，黄酮的得率随之增加；在25时达到峰值，这是因为 随着溶剂倍数的增大,溶剂和桔皮粉末之间的接触面变 大,从而有利于促进桔皮中黄酮成分的溶出。但过高的 液固比会稀释酶的有效作用浓度、降低酶的催化活性， 从而使黄酮的得率随着液固比的增加而降低；同时，溶 剂用量过大，既增加了提取成本，又会给其后的浓缩、 提纯等工序增加麻烦。 242农业工程学报2008 年 图 3不同液固比对黄酮得率的影响 Fig.3Effects of different ratio of solutions to material on flavonoid yield 3.1.4提取时间对黄酮提取得率的影响 变动提取时间，在乙醇浓度80%、酶用量0.4%、液 固比25、pH值为5、提取温度50的条件下提取并测定 对应的黄酮得率，结果如图4所示。 图 4不同提取时间对黄酮得率的影响 Fig.4Effects of different extraction time periods on flavonoid yield 酶解时间太短影响酶解效果，时间太长不利于工业 化生产。 45120 min内黄酮得率随着时间的增加而增大； 这是因为随着时间的延长，酶活力得到充分利用，酶解 反应进行得较完全，桔皮中的黄酮成分不断地溶出、进 入溶液,使得率上升。但提取一定时间后,黄酮成分已基 本溶出,继续增加提取时间，黄酮得率反而下降，表明过 长时间的提取无法增加桔皮黄酮的得率，且延长提取时 间还会增加能耗。 3.1.5pH 值对黄酮提取得率的影响 变动pH值，在乙醇浓度80%、酶用量0.4%、液固比 25、提取时间120 min、提取温度50的条件下提取并测 定对应的黄酮得率，结果如图5所示。 图 5不同 pH 值对黄酮得率的影响 Fig.5Effects of different pH values on flavonoid yield 每种酶都有最适 pH 值，在此 pH 值下催化反应的速 率最高。由图 5 可看出：pH 值在 24 之间，桔皮黄酮 得率一直随 pH 值的上升而增加；当 pH 值超过 5 之后， 化学环境不利于酶的作用，酶活力减小，黄酮得率下降 趋势明显；pH 值在 45 之间时，黄酮得率的数值是较 为理想的。这是因为：pH=45 时，一方面，处于纤维 素酶的最佳作用 pH 值区间(4.06.0)里11，能够发挥纤 维素酶的最大活力，使之最大限度作用于细胞壁纤维素 - 1,4 葡萄糖苷键，破坏细胞壁，减小传质阻力，加速桔 皮黄酮类化合物的溶出效率13；另一方面，可能是因为 它较为接近桔皮中酸性蛋白质的等电点，抑制了蛋白质 的溶出，因而有利于黄酮类物质的提取。 3.1.6提取温度对黄酮提取得率的影响 变动提取温度，在乙醇浓度80%、酶用量0.4%、液 固比25、pH值4、提取时间120 min的条件下提取并测定 对应的黄酮得率，结果如图6所示。 图 6不同提取温度对黄酮得率的影响 Fig.6Effects of different extractions temperature on flavonoid yield 由图 6 可看出：酶解温度在 2050时，桔皮黄酮 的得率随酶解温度的升高而增大；50达顶点，以后随 酶解温度的增大黄酮的得率减小。这是因为温度对酶解 反应速度的影响有两方面效应：一方面当温度升高，酶 活性增强、反应速度加快；另一方面温度继续升高，酶 活性减弱、酶的稳定性降低，同时高温还会破坏原本已 被提取出来的黄酮的结构； 低于 50时以前种效应为主， 高于 50时以后种效应为主。 3.2试验数据分析 依据表 1 的四因素五水平中心组合试验设计方案 L30（54）进行试验,并将试验结果按公式（2）计算，得出 不同试验条件下所提取样品中的黄酮得率（表 2） 。 表 2中心组合试验设计与结果 Table 2Central composite experimental design and its results 试验 序号 酶用量 x1/% 时间 x2/min pH 值 x3 温度 x4/ 黄酮得率 y/% 10.31104.0453.03 20.51104.0453.43 30.31304.0453.11 40.51304.0453.48 50.31105.0452.99 60.51105.0453.38 70.31305.0453.18 80.51305.0453.51 90.31104.0552.95 100.51104.0553.42 110.31304.0552.92 120.51304.0553.35 第 4 期苏东林等：酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究243 接上表 120.51304.0553.35 130.31105.0552.83 140.51105.0553.04 150.31305.0552.88 160.51305.0553.39 170.41204.5503.44 180.41204.5503.55 190.41204.5503.33 200.41204.5503.43 210.41204.5503.51 220.41204.5503.39 230.21204.5502.73 240.61204.5503.64 250.41004.5503.21 260.41404.5503.15 270.41203.5503.13 280.41205.5503.09 290.41204.5403.16 300.41204.5603.31 利用 SASRSREG Procedure 对表（2）的试验数据 进行方差分析、参数估计及显著性检测，具体结果分析 见表（3），得到如下标准形式的四元二次回归方程： 123412 13142324 2222 341234 18.22286.35200.12462.63620.26940.0106 0.28750.01620.00860.0002 0.01266.36460.00060.32960.0020 yxxxxxx x xxxxxxx xxxxxx （3） 表3二次响应面回归模型方差分析及参数估计 Table 3Analysis of variance and parameter estimate of the regression model of quadratic response 变异来源自由度 参数估计 标准误差t值P值 截距1-18.22286.8620-2.660.0180 x116.35205.02821.260.2258 x210.12460.06102.050.0588 x312.63621.11922.360.0325 线性项 x410.26940.11502.340.0334 x1x210.01060.02640.400.6929 x1x31-0.28750.5278-0.540.5940 x1x410.01620.05230.310.7624 x2x310.00860.00521.630.1231 x2x41-0.00020.0005-0.360.7274 交互项 x3x41-0.01260.0106-1.210.2458 x 2 1 1-6.36462.01566-3.160.0065 x2 2 1-0.00060.0002-3.220.0057 x2 3 1-0.32960.0806-4.090.0010 二次项 x2 4 1-0.00200.0008-2.540.0228 变异来源自由度平方和均方F值P值 模型141.48610.10629.53.0001 误差150.16720.0111 总和291.6533 失拟100.13540.01352.140.2078 纯误差50.03160.0063残差项 总和150.16710.0108 变异来源自由度平方和均方F值P值 响应均值3.2320 均方根0.1056 R20.8989 变异系数3.2662 从表3 来看，此模型的p0.0001，响应面回归模型 达到高度显著水平，决定系数R2为0.8989。逐项显著性检 验结果表明，二次项、交互项对试验结果有显著性影响； 一次项对试验结果的影响达到高度显著性水平；残差项 各项数据分析表明该模型失拟不显著；因此该二次方程 能够较好地拟合真实的响应面。 3.3回归方程优化 对不显著的项(P0.25)利用 SAS GLM Procedure 逐 步回归，得到优化后的回归模型： y= -17.4153+7.1458x1+0.1196x2+2.5212 x3+0.2534x4 +0.0086x2x3-0.0128x3x4-6.3646x21- 0.0006x2 2-0.3296x 2 3-0.0020x 2 4 （4） 对回归方程（4）进行方差分析和系数显著性检验, 结果表明，模型各项检测数据均达到理想指标，其中决 定系数 R2为 0.8988，说明 90%的试验数据可用这个方程 解释。t 检验表明：对方程，x1、x2 3都在 P0.001 水平上 影响显著；x4、x21、x2 2都在 P0.01 水平上影响显著； 2x、 3x、32xx 、 2 4 x都在 P0.1 水平上影响显著；43xx 在 P0.25 水平上影响显著。 3.4模型分析讨论 3.4.1主因子效应及其边际效应分析 通过直接比较方程中一次项系数绝对值的大小，可 以判断因子影响的主次性14。在纤维素酶辅助提取情况 下，酶用量对黄酮得率的影响最大，其次是 pH 值，然后 是温度，最后为时间。 回归方程（4）中，固定3因素于零水平，求第4个因 素与柑桔皮总黄酮得率的一元二次回归方程。根据这些 方程降维求导，得到4个因子在不同水平下对柑桔皮总黄 酮得率影响关系的边际效应，如图7所示。 从图中可以得知：酶用量、pH值2因子性状的边际效 应指数与产量边际效应指数呈显著负相关；温度、时间2 因子性状的边际效应指数与产量边际效应指数也呈负相 关，但不是太显著；酶用量，pH值，温度，时间4因子对 应线性方程的决定系数（即斜率）分别为-12.73，-0.66， -0.0041，-0.0013。各因子水平编码越大，边际产量越低； 但变化程度的大小依次为酶用量，pH值，温度和时间。 图7各因子边际效应指数 Fig.7Marginal effect indexes of the ratio of flavonoid yield to cellulose mass, temperature, time and pH value 244农业工程学报2008 年 3.4.2交互因子效应分析 将方程(4)中的任意两个因素固定在零水平，对余下 的两个因素按照所得的二元二次回归方程进行 SAS 软件 编程运算， 得到交互因子的响应面和等高线图 （图 8、 9） 。 如果一个响应曲面坡度相对平缓,表明黄酮得率可 以忍受处理条件的变异,而不影响到响应值的大小；相反, 如果一个响应曲面坡度非常的陡峭,表明响应值对于处 理条件的改变非常敏感。 等高线图表示在同一椭圆型的区域里面，黄酮类物 质的提取得率是相同的。在椭圆形区域中心，黄酮类物 质提取得率最高，由中心向边缘逐渐减少。图中椭圆排 列越密集，说明因素变化对黄酮类物质的提取得率影响 越大。同时等高线的形状可反映出交互效应的强弱大小, 椭圆形表示两因素交互作用显著；而圆形则与之相反,此 时两因素交互作用可忽略。由图 8、9 可知：提取时间和 pH 值之间的以及温度和pH 值之间的交互作用显著。 图 8提取时间(2x)与 pH 值(3x)对黄酮得率的影响 Fig.8Effects of extraction time and pH values on flavonoid yield 图 9pH 值(3x)与提取温度(4x)对黄酮得率的影响 Fig.9Effects of pH value and extractions temperature on flavonoid yield 3.4.3最佳工艺条件的确定 利用 SASRSREG Procedure 分析试验数据， 确定各 因子的优化参数。 分析该优化条件下的特征值，因为都是负值，故判 定该试验设计能获得黄酮类物质最大相对提取得率（y） 为 3.6216%。然后用岭脊(ridge analysis)回归寻优15，得 到理论上的最佳点：即编码半径 0.8、x1为 0.5546%、x2 为 122.8176、x3为 4.4256、x4为 48.7133，此时，响应预 测柑桔皮中黄酮类物质的提取得率为 3.6210%。 按实际生 产情况，可将酶用量(x1)0.55%、时间(x2)123 min、pH 值 (x3)4.4、温度(x4)48，作为最佳生产工艺参数。 3.4.4寻优条件的试验验证 在黄酮得率最高时对应的最佳提取参数情况下进行 试验验证，得到柑桔皮中黄酮类化合物的提取得率为 (3.51 0.13)%（n=3） ，与理论值 3.62%基本一致。 表4基于试验编码值的优化条件转化 Table 4Translation of experimental code to real value of the optimum conditions (canonical analysis) 特征向量 因子 编码值实际值 预测值 y x1x2x3x4 特征值 x10.81980.5640- 0.1471 0.46420.4914 - 0.7220 - 0.1458 x20.1521123.04180.66260.64060.13040.3655 - 0.2307 x3- 0.07784.4222- 0.7048 0.36060.26030.5526 - 0.2676 x4- 0.134448.6564 3.6216% 0.2063 - 0.4941 0.82080.1989 - 0.4042 第 4 期苏东林等：酶法辅助提取柑桔皮总黄酮的工艺优化研究245 表 5岭脊回归分析 Table 5Estimated ridge of maximum response for variabley 因子预测值 编码 半径 响应 预测值 标准 误差 x1x2x3x4 03.44160.04300.4000120.00004.500050.0000 0.13.48170.04280.4193120.25974.489049.8034 0.23.51660.04230.4386120.54564.478549.6170 0.33.54660.04170.4580120.85774.468449.4408 0.43.57150.04160.4773121.19624.458849.2750 0.53.59140.04240.4966121.56134.449749.1194 0.63.60630.04500.5160121.95314.441248.9741 0.73.61620.05000.5353122.37184.433148.8388 0.83.62100.05770.5546122.81764.425648.7133 0.93.62100.06800.5740123.29104.418748.5972 1.03.61590.08060.5932123.79224.412448.4901 4结论与讨论 1）建立了一个以总黄酮提取得率为目标值,以酶用 量、时间、pH值和温度为因子的数学模型，方差分析表 明拟合较好。通过对回归方程优化计算，得到提取的最 佳工艺条件为酶用量0.55%、时间123 min、pH值4.4、温 度48。 2）对所建立的数学模型进行了试验验证。在最优条 件下，得到总黄酮的提取得率为(3.51 0.13)%（n=3） ，与 理论值3.62%基本一致。 虽然回归模型对柑桔皮总黄酮的酶提得率可较好地 进行预测；但其中仍存在干扰因素，今后的研究，建议 考虑更为合适的缓冲液、采用混合酶提及选择适宜的提 取次数等。 参考文献 1单杨柑桔加工技术研究与产业化开发J中国食品学 报，2006，6(1)：423428 2吴厚玖，孙志高，王华试论我国柑橘加工业发展方向 J食品与发酵工业，2006，32(4)：8589 3Jones, Robert Allen. 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