瑞士乳杆菌发酵乳清产物抗氧化活性的条件优化.pdf

， 、 w c h i n a d a i r y ne t z g r p g y 1 6 3 c o rn 中 国乳品 工业 d a j r y l N D U S T R Y 瑞士乳杆菌发酵乳清产物抗氧化活性的条件优化 包毅宁 ， 胡易 ， 王正珊 ， 赵征 ( 天 津 科 技 大 学 ， 天 津 3 0 0 4 5 7) 摘要 ： 应 用产蛋 白酶 活力强的瑞 士乳杆 菌发 酵乳清， 讨论 了发 酵时间、 发酵温度、 发 酵初 k p Hq k 和瑞士乳杆 菌接种 量等条件对产物 抗氧化 活性 的影响 在单 因素实验 的基础上 ， 进行 正交实验 ， 得 到抗氧化活性最 高产物的发酵条件 为发 酵温度3 7、 乳清初 始p H值为 6 0 、 瑞士乳杆菌接种量 ( 体积分数 ) 5 和连 续培 养1 8 h 。在此条件下 ， 发酵产物的羟 自由基 清除能力达到5 4 7 3 。证明 了瑞 士乳杆菌发 酵乳清产物具有优于未发酵乳清的较 强抗氧化活性 在现有酶解法的基础 上开辟 了制备乳清 源抗氧化肽的新途径 关键词 ： 瑞士乳杆 菌； 乳清； 抗氧化 ； 羟 自由基 ； 水解 中图分类号 ： Q9 3 3 3 文献标识 码： A 文章编号 ： 1 0 0 1 2 2 3 0 ( 2 0 1 1 ) 0 3 0 0 0 7 0 3 O pt i m um f e r m e nt a t i on c o nd i t i o ns of La c t oba c i l l us he l v e t i c u sf o r pr oduc i ng a n- t i ox i da t i ve c he e s e whe y BAO Yi ni n g ，HU Yi ， W AN G Zh e ng s h a n， ZHAO Zh e n g ( Ti a n j i n Un i v e r s i t y o f S c i e n c e a n d Te c h n o l o g y ， T i a n j i n 3 0 0 4 5 7 ， Ch i n a ) Abs t r a ct ：Thi s s t ud y f oc u s e d o n t h e a nt i ox i da t i v e p r o pe r t y of c he e s e whe y f e r m e nt e d b y a La c t ob a c i l l u s h dv e t i c u s wh i c h wa s p r ov e d t O be e xc e l l e nt o n p r od uc i n g t he p r ot e i n a s e Afte r t he s i n g l e f a c t o r t e s t s ，t h e o r t hog o na l t e s t wa s c a r r i e d o ut t o o bt a i n t h e o p tima l f e rm e nt a t i on c on d i t i o n t o g e t t he p r o d uc t wi t h t he be s t a nt i o x i d a ti ve a c t i v i t yTh e o pt i ma l f e r me nt a ti on c on di t i o ns a r e a s f o ll owi n g：i n c ub a t i o n t e mp e r a t u r e 3 7 o C， i n i t i al p H 6 0 ， i n o c u l a t i o n 5 ( v o l v o 1 ) ， a n d f e r me n t e d 1 8 h Aft e r f e r me n t e d i n t his c o n d i ti o n ， t h e a b i l i W t O e l i mi n a t e f r e e r a d i c a l o f t h e pr od uc t i s u p t o 5 4 7 3Th i s s t ud y pr ov e d t h a t a f t e r f e r me n t e d b y t h e La ct ob a c i l l u s he l v eti c u s ，t he a n t i ox i da t i v e a c tiv i t y o f t h e c he e s e wh e y c ou l d be i mp r ov e d，a nd de ve l o pe d a ne w wa y t O pr e pa r e t h e a n t i o xi da tiv e p e pti de s f r o m wh e y Ke y wor ds ：La c t ob a c i l l us he l v e t i c u s ；whe y ；a n tio xi d a t i o n；fre e r a di c al； h yd r o l ys i s 0 引 言 随 着 干 酪 产 业 的 蓬 勃 发 展 乳 清 再 利 用 受 到 了人 们 的 重 视 乳 清 具 有 多 方 面 的 功 能 性 ， 近 年 来 乳 清 的 抗 氧 化 性 成 为 研 究 热 点 提 高 乳 清 抗 氧 化 活 性 的 方 法 目前 主 要 为 酶 解 法 P e n a -t L a mo s 等 发 现 乳 清 分 离 蛋 白 酶 解 产 物 在 脂 质 系 统 中 有 良好 的 的 抗 氧 化 能 力 ： 赵 文 博 等 证 明 了 碱 性 蛋 白 酶 可 提 高 乳 清 的 抗 氧 化 能 力 12 1 瑞 士 乳 杆 菌 是 一 种 高 产 蛋 白 酶 活 性 的 乳 酸 菌 嘲 Ka p i l a 等 对 用 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 乳 清 和 添 加 w P c乳 清 的 发 酵 条 件 进 行 优 化 。 体 外 试 验 结 果 表 明 瑞 士 乳 杆 菌 水 解 产 物 具 有 很 好 的 抗 氧 化 活 性 4 1 本 工 作 拟 利 用 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 浓 缩 乳 清 利 用 乳 酸 菌 所 产 蛋 白酶 将 乳 清 蛋 白水 解 以 提 高 乳 清 的 抗 氧 化 活 性 力 求 为 乳 清 功 能 性 的 提 高 提 供 酶 解 以 外 的 新 途 径 收稿 E t 期 ： 2 0 1 0 1 1 3 0 基金项 目： 天津市科技攻关项 目“ 瑞 士乳杆 菌发酵技术及其系列产品 的 工业化开发” ( 0 6 YF GZ S H0 2 3 0 0 ) 。 作者简介： 包毅宁 ( 1 9 8 5 一) ， 女 ， 硕士研究生 ， 研究方向为乳品科学与技术。 通讯作者 ： 赵征 1 实 验 1 1材 料 与 仪 器 瑞 士 乳 杆 菌 ( 天 津 科 技 大 学 干 酪 科 学 与 工 程 研 究 室 保 藏 ) ， 鲜 牛 乳 ， 盐 酸 、 F e S O 、 双 氧 水 、 水 杨 酸 ( 分 析 纯 ) 。 乳 脂 分 离 机( 9 N一1 0 0 ) 立 式 压 力 蒸 汽 灭 菌 器 ( YXQ-L S 一 5 0 S I I) ， 电 热 恒 温 水 浴 锅 ( HW S 2 6 型 ) ， 紫 外 可 见 分 光 光 度 计 ( 7 5 2 E) ， p Hg t( F E 2 0 ) ， RE一 5 2 AA旋 转 蒸 发 器 5 8 0 4 R低 温 离 心 机 BCM -1 0 0 0 A型 生 物 洁 净 工 作 台 ， L RH一2 5 0 培 养 箱 真 空 冷 冻 干 燥 机 。 1 2 方 法 1 2 1 工 艺 流 程 鲜 牛 乳 加 热 至 3 5一 脱 脂 一 杀 菌 ( 6 3 o C 3 0 mi n ) 一 冷 却 至4 5 一 加 稀 释 比 1： 9 的盐 酸 至p H值 为 4 6 并 不 断轻 轻 搅 拌 过 滤 除 去 酪 蛋 白得 到 酸 乳 清 一 5 5 6 0 真 空 旋 蒸 除 去 原 体 积 2 的 水 一 调 节 浓 缩 乳 清 的P H一 灌 入 无 菌 三 角 瓶 一 杀 菌 ( 6 3 ( 2 3 0 mi n ) 一 接 种 瑞 士 乳 杆 菌 一 静 置 发 酵 一 4 离 心 除 去 菌 体 一 上 清 液 灭 酶 ( 沸 水 浴 5 mi n) 一 真 空 冻 干 ( -5 5 q C 4 8 h) 得 产 物 一 测 V o 1 3 9， No 3 2 0 1 1 ( t o t a l 2 4 - _ 研究报告 Re s e a r c h P a p e r s 定 产 物 的1 溶 液 的抗 氧 化 性 1 2 2 瑞 士 乳 杆 菌 活 化 方 法 瑞 士 乳 杆 菌 冻 干 菌 粉 接 入 质 量 分 数 为 1 2 灭 菌 的 脱 脂 乳 粉 复 原 乳 进 行 活 化 凝 乳 后 按 体 积 分 数 为 3 接 种 量 接 入 1 0 mL 液 体 MRS 培 养 基 中 培 养 1 2 h然 后 后 按 体 积 分 数 为 3 接 种 量 接 入 1 0 0 mL t g4 8MRS 培 养 基 中培 养 1 2 h 后 使 用 1 2 3抗 氧 化 指 标 的 测 定 清 除 羟 自 由基 能 力 在 1 0 r I 1 L 试 管 中依 次 加 入 浓 度 为 6 mr n o l L 的F e S O 溶 液 2 mL发 酵 产 物 溶 液 2 mL 和 浓 度 为 6 mm o l L的 H： o2 溶 液 2 mL， 摇 匀 ， 静 置 1 0 mi n。 再 向A各 管 加 入 浓 度 为 6 mmo l L 的 水 杨 酸 溶 液 2 mL 同时 向 AI各 管 加 入 2 mL蒸 馏 水 ， 摇 匀 ， 静 置 3 0 mi n 后 以 5 0 0 0 r mi n N 心 5 mi n 于 5 1 0 n m：9 h 测 吸 光 度 嘲 每 个 样 品 测 3 次 取 平 均 清 除 率 计 算 公 式 为 清 除 率 = 1 一 厂 6 ) 】 1 0 0 ， 式 中 ： 为 空 白 对 照 ； 。为 有 水 杨 酸 时 水 解 产 物 的 吸 光 度 ； 为 无 水 杨 酸 时 水 解 产 物 的 吸 光 度 。 1 2 4单 因 素 实 验 ( 1 ) 时 间 的 影 响 。 培 养 温 度 4 2 ， 发 酵 初 始 p H值 为 6 0 ， 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 5 0 ， 每 隔 2 小 时 取 样 冻 干 后 测 产 物 抗 氧 化 活 性 ( 2 ) 温 度 的影 响 。发 酵 初 始 p H值 为 6 0 ， 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 5 。 O ，分 别 置 于 2 5 ， 3 0 ， 3 7， 4 2， 5 O 培 养 箱 内 培 养 1 8 h 后 取 样 冻 干 后 测 产 物 抗 氧 化 活 性 ( 3 ) 初 始 p H值 的 影 响 。培 养 温 度 4 2 c c 发 酵 初 始 p H值 分 别 为 5 O ， 5 5 ， 6 0， 6 5 和 7 0， 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 5 O 培 养 1 8 h 冻 干 后 测 产 物 抗 氧 化 活 性 ( 4 ) 瑞 士 乳 杆 菌 接 种 量 的 影 响 。 培 养 温 度 4 2 发 酵 初 始 p H值 为 6 0， 瑞 士 乳 杆 菌 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 分 别 3 9 o ， 2 5 ， 5 0 ， 7 5 和 1 0 0 ， 培 养 1 8 h 冻 干 后 测 产 物 抗 氧 化 活 性 正 交 实 验 结 果 如 表 1 所 示 。 表 1 正 交实 验 因 素 水 平 2结 果 与 讨 论 2 1 时 间 对 产 物 抗 氧 化 活 性 的 影 响 图 1 为 发 酵 产 物 抗 氧 化 性 与 发 酵 时 间 的 关 系 由 图 1 可 以 看 出 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 浓 缩 乳 清 产 物 的 抗 氧 化 活 性 随 发 酵 时 间 延 长 呈 增 加 趋 势 。 到 1 8 h达 到 4 9 2 4 。 发 酵 1 8 h 后 ， 产 物 的 抗 氧 化 活 性 开 始 降 低 ， 实 验 中测 得 发 酵 至4 8 h 的 水 解 产 物 的 羟 自由基 清 除 能 力 为4 5 7 6 略 高 于 发 酵 2 0 h 的 产 物 。由发 酵 液 中 活 菌 数 曲 线 可 以看 出 从 1 6 h 到 1 8 h的发 酵 过 程 中 活 菌 大 量 死 亡 其 破 裂 释 放 的 胞 内 蛋 白酶 进 一 步 水 解 乳 清 蛋 白产 生 了 抗 氧 化 肽 故 1 8 h 的 水 解 产 物 呈 现 出 更 好 的 抗 氧 化 活 性 。 n 燃 枯 划 t h 清 除 率 ；发酵 液p H值；-l g 发酵 液 中活 菌数 图 1 产 物 抗 氧 化性 与时 间的 关 系 2 2温 度 对 产 物 抗 氧 化 活 性 的 影 响 温 度 影 响 微 生 物 的 各 种 代 谢 过 程 和 酶 催 化 的 各 种 生 化 反 应 速 率 从 而 影 响 菌 体 的 生 长 和 蛋 白 酶 的水 解 效 力 温 度 还 通 过 改 变 发 酵 液 的 物 理 性 质 如 样 的 溶 解 度 、 基 质 的 传 递 速 率 及 菌 体 对 养 分 的 分 解 和 吸 收 速 率 间 接 影 响 微 生 物 的生 长 和 产 物 的形 成 。图2 为 发 酵 产 物 抗 氧 化 性 与 发 酵 温 度 的关 系 由 图2 可 以看 出 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 浓 缩 乳 清 产 物 的 抗 氧 化 活 性 随 发 酵 温 度 升 高 呈 增 加 趋 势 当 发 酵 温 度 为 4 2 时 达 到 5 2 ， 5 4 。温 度 继 续 升 高 。 抗 氧 化 活 性 显 著 下 降 。这 可 能 是 由 于 瑞 士 乳 杆 菌 产 酶 及 所 产 蛋 白 酶 的 最 适 作 用 温 度 3 7 - 4 2 o C温 度 过 高 影 响 了乳 酸 菌 产 酶 和 所 产 蛋 白酶 的 水 解 作 用 进 而 减 少 了 抗 氧 化 肽 的 生 成 量 降 低 了产 物 的抗 氧 化 活 性 静 蜒 Tf c 图2产 物 抗氧 化 性 与 温度 的关 系 2 3 DH值 对 产 物 抗 氧 化 活 性 的 影 响 乳 清 的 初 始 p H值 可 能 从 两 个 方 面 影 响 瑞 士 乳 杆 菌 的 生 长 和 蛋 白 水 解 能 力 ：一 是 影 响 菌 体 细 胞 膜 电 荷 状 况 引 起 膜 渗 透 性 的 变 化 从 而 影 响 菌 体 对 养 分 的 吸 收 ： 二 是 影 响 菌 体 细 胞 内 各 种 酶 活 、 菌 体 对 基 质 的 利 用 速 率 和 细 胞 的 结 构 从 而 影 响 菌 体 的 生 长 和 产 蛋 白 酶 能 力 图3 为 发 酵 产 物 抗 氧 化 性 与 发 酵 初 始 p H值 的 关 系 由 图 3 可 以 看 出 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 浓 缩 乳 清 产 物 的 抗 氧 化 活 性 随 在 初 始 p HN 为 6 5 时 达 到 最 大 此 条 件 下 的 清 除 率 为 5 1 3 。 这 与 瑞 士 乳 杆 菌 的 最 适 生 长 p H值 为 6 2 6 4 相 近 说 明 在 此 条 件 下 瑞 士 乳 杆 菌 能 够 较 高 的 吸 收 养 分 ，且 具 有 良好 的 产 酶 活 性 8 2 o “聿第3 9 卷第 3 期( 总第2 4 4 期) Re s e a r c h P a p e r s 研究报告 图3 产 物 抗 氧化 性 与 p H值 的 关 系 2 4接 种 量 对 发 酵 产 物 抗 氧 化 活 性 的 影 响 图 4 为 发 酵 产 物 抗 氧 化 性 与 接 种 量( 体 积 分 数 ) 的 关 系 由 图4 可 以看 出 ， 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 浓 缩 乳 清 产 物 的抗 氧 化 活 性 在 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 为 7 5 时 清 除 率 达 到 5 1 9 2 高 于 接 种 量 为 i 0 时 产 物 的 抗 氧 化 活 性 这 可 能 是 由 于 接 种 量 增 大 使 培 养 过 程 中菌 体 之 间 竞 争 营 养 物 质 而 大 量 死 亡 释 放 了 过 量 的 蛋 白 酶 使 乳 清 蛋 白 水 解 为 抗 氧 化 肽 后 又 进 一 步 水 解 抗 氧 化 活 性 降 低 图4 产 物抗 氧化 性 与 接 种 量 的 关 系 2 5正 交 实 验 正 交 实 验 由 表 2 所 示 由表 2 可 以 看 出 对 瑞 士 乳 杆 菌 发 酵 乳 清 水 解 产 物 抗 氧 化 活 性 影 响 程 度 大 小 按 顺 序 依 次 为 发 酵 温 度 发 酵 时 间 接 种 量 发 酵 液 初 始 p H值 。 最 佳 发 酵 条 件 为 ： 发 酵 温 度 3 7 ， 发 酵 时 间 1 8 h， 发 酵 初 始 p H值 为 6 0， 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 1 0 对 发 酵 条 件 优 化 实 验 进 行 方 差 分 析 结 果 如 表 3 表 2 正 交实 验 结 果 所 示 。 方 差 分 析 结 果 显 示 ， 以 初 始 p H为 误 差 项 在 a = 0 0 5 水 平 上 发 酵 温 度 和 发 酵 时 间 具 有 显 著 性 接 种 量 和 初 始 p H没 有 显 著 性 。 综 合 考 虑 方 差 分 析 结 果 与 经 济 因 素 ， 选 择 发 酵 条 件 为 培 养 温 度 3 7 ( 2 、 培 养 时 间 1 8 h、 发 酵 初 始 p H6 0 、 接 种 量 5 、 所 得 水 解 产 物 的 羟 自 由 基 清 除 率 为 5 4 7 3 而 对 照 组 中未 接 种 瑞 士 乳 杆 菌 乳 清 的羟 自由 基 清 除 率 为 3 3 2 1 表3方 差 分析 3 结 论 瑞 士 乳 杆 菌 可 以 显 著 提 高 浓 缩 乳 清 的 抗 氧 化 活 性 ， 发 酵 初 始 p H值 为 6 0 、 瑞 士 乳 杆 菌 接 种 量 ( 体 积 分 数 ) 5 的 浓 缩 乳 清 在 3 7 发 酵 1 8 h 后 所 得 水 解 产 物 的 羟 自 由基 清 除 率 为 5 4 7 3 与 酶 法 水 解 相 比 ， 用 微 生 物 水 解 法 制 备 生 物 活 性 肽 直 接 利 用 微 生 物 发 酵 过 程 中 产 生 的 复 合 蛋 白 酶 降 解 蛋 白质 经 过 优 化 可 达 到 较 高 的 水 解 度 ， 从 而 降 低 了 制 备 低 聚 肽 的 成 本 为 综 合 开 发 利 用 乳 清 提 供 了 思 路 参 考 文 献 ： 【 1 】P E NA RAMOS E A， XI ONG Y L _ A n t i o x i d a t i v e Ac t i v i t y o f Wh e y P r o t e i n Hy d r o l y s a t e s i n a L i p o s o ma l S y s t e m【 7 1 J o u rna l o f Da i r y S c i e nc e ，2 0 0 1 ， 8 4 ：2 5 7 72 5 8 3 【 2 赵 文博， 包毅 宁， 赵征 干酪乳清水解产 物的抗氧化活性研 究IJ 中国 乳 品工业 2 0 1 0 3 8 i 2 ) ： 1 3 1 5 【 3 】 张重 阳， 潘道东 瑞士乳杆菌产蛋 白酶的培养和提取 条件 的研究U 1 食 品科