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第 31 卷 第 14 期 农 业 工 程 学 报 Vol.31 No.14 2015 年 7 月 Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering Jul. 2015 291 秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化 赵谋明,徐巨才,刘 洋,赵容钟,吴长平,苏国万 (华南理工大学轻工与食品学院,广州 510640) 摘 要:为探讨秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶(XOD,xanthine oxidase)抑制肽的最佳工艺,该文以氮回收率和体外 XOD 抑 制活性为指标,首先通过单因素试验确定中性蛋白酶和胰酶为水解秋刀鱼制备 XOD 抑制肽的最佳蛋白酶。在此基础上, 采用响应面分析法研究加酶量、 酶解时间和中性蛋白酶所占比例对酶解氮回收率及酶解产物 XOD 抑制活性的影响, 进一 步优化并最终确定了水解秋刀鱼制备 XOD 抑制肽的最优工艺:料液比 12 (g/g),总加酶量 0.3%(中性蛋白酶胰酶质 量比=64) ,在 pH 值 7.0 和 55条件下酶解 6 h,其理论氮回收率和酶解产物 XOD 抑制率分别为 72.69%和 30.32%,对 应实际值分别为 72.03%和 30.96%,预测模型可靠性高,可用于秋刀鱼 XOD 抑制肽的酶法制备,为工业化利用秋刀鱼生 产降尿酸肽提供一定的理论和技术指导。 关键词:优化;酶;水解;黄嘌呤氧化酶;秋刀鱼;抑制肽;肽分子量 doi:10.11975/j.issn.1002-6819.2015.14.040 中图分类号:TS201.1 文献标志码:A 文章编号:1002-6819(2015)-14-291-07 赵谋明,徐巨才,刘 洋,等. 秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化J. 农业工程学报,2015,31(14):291 297. doi:10.11975/j.issn.1002-6819.2015.14.040 Zhao Mouming, Xu Jucai, Liu Yang, et al. Technology optimization on preparation of XOD inhibition peptide from SauryJ. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2015, 31(14): 291297. (in Chinese with English abstract) doi:10.11975/j.issn.1002-6819.2015.14.040 0 引 言 在人体的新陈代谢过程中,从食物中摄取的嘌呤类 物质以及体内的核酸和 ATP(adenosine triphosphate)会 生成次黄嘌呤,然后由黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase, XOD) 作用而转化生成尿酸1。 国际上将男性血尿酸浓度 超过 420 mol/L、女性超过 357 mol/L 时定义为高尿酸 血症2。 高尿酸血症易导致尿酸盐在关节处结晶析出并沉 积,从而引发痛风。研究表明长期高尿酸血症与高血压、 糖尿病、冠心病、肾衰竭等密切相关3-6。目前常使用西 药如秋水仙碱、非甾体抗炎药物及泼尼松龙(促肾上腺 皮质激素) 等治疗高尿酸或痛风7。 西药治疗虽然见效快, 但存在一定的副作用。已有研究发现秋水仙碱及非甾体 抗炎药物易造成肾脏和肝脏功能紊乱8-9,而泼尼松龙亦 被证实具有引起糖代谢异常、中枢神经系统损坏、肌肉 萎缩等多种毒副作用10。别嘌呤醇是目前唯一一款通过 抑制黄嘌呤氧化酶(XOD)活性而减少尿酸生成、降低 血尿酸浓度的药物,但服用初期易诱发痛风,且存在一 定副作用11。 收稿日期:2015-05-05 修订日期:2015-06-17 基金项目:国家高技术研究发展计划(863 计划) (2013AA102201) ;广东 省战略性新兴产业核心技术攻关(2012A080800014,2012A020800002) 作者简介:赵谋明,男,湖南益阳人,教授,博士,博士生导师,研究方向 为食品生物技术及食品风味化学。广州 华南理工大学轻工与食品学院, 510640。Email:femmzhao 通信作者:苏国万,男,广东茂名人,讲师,博士,研究方向为食品生物 技术及食品风味化学。广州 华南理工大学轻工与食品学院,510640。 Email:fegwsu 已有研究发现有机茶 Rooibos 中含有一种黄嘌呤氧 化酶抑制活性良好的物质 aspalathin,可显著降低小鼠的 血尿酸水平12。刘晓宇等从丹参中提取出一种紫草素, 可显著抑制黄嘌呤氧化酶的活性13。但由于这些天然活 性物质的提取成本极高,限制了其工业化应用。蛋白多 肽作为健康食品配料或药物的重要来源,有着良好的加 工性能14-15。研究发现小分子肽比蛋白质和氨基酸更易 被吸收,且具有多种生理活性,如降血压、降胆固醇、 抗血栓、抗癌、抗氧化等16-19,但鲜见关于降尿酸方面 的研究。 黄嘌呤氧化酶(XOD)是体内生成尿酸的关键酶, 它不仅能与黄嘌呤、次黄嘌呤相结合,还能与吡唑并嘧 啶类、苯基吡唑类、黄酮类等具有杂环的化合物结合, 因而可利用这些杂环化合物与黄嘌呤氧化酶竞争性结 合,从而抑制尿酸的生成20。秋刀鱼作为一种冷温性海 洋鱼,蛋白质含量丰富,且其生命周期短,生长迅速, 是一种很重要的经济鱼类。中国台湾省 2012 年秋刀鱼的 捕获量已达 16 万 t,仅次于日本。中国大陆市场规模庞 大,对秋刀鱼的需求量不断增加,且秋刀鱼本身价格低 廉,因而市场前景非常广阔。然而中国目前对于秋刀鱼 的加工仍局限于制作罐头和干货,深加工少之又少21。 而利用生物酶解技术处理秋刀鱼以获得功能性多肽,则 可以充分利用秋刀鱼的营养价值和功能价值,市场前景 广阔。本文对秋刀鱼进行酶解处理,以氮回收率和 XOD 抑制率为指标,通过优化酶解工艺,制备具有明显抑制 XOD 活性的生物活性肽,并分析其分子量分布情况,以 期为工业生产降尿酸肽提供理论和技术指导。 农业工程学报() 2015 年 292 1 材料与方法 1.1 主要材料 秋刀鱼:购于广州市黄沙水产市场,去头、尾及内 脏,冲洗干净后放入绞肉机中绞成肉糜,置于18冰箱 中冷冻保存,备用。 Alcalase 2.4L(1.73105 U/g,最适 pH 值 8.0)、风 味蛋白酶(1.84 104 U/g,最适 pH 值 7.0)、酸性蛋白酶 (4.57104 U/g, 最适pH 值3.5) 、 复合蛋白酶 (1.86105 U/g, 最适 pH 值 7.0)、中性蛋白酶(8.82104 U/g,最适 pH 值 7.5)均购于美国诺维信公司;木瓜蛋白酶(5.65105 U/g,最适 pH 值 6.5)购于广州华琪生物科技有限公司; 胰酶(2.31105 U/g,最适 pH 值 8.0)购于重庆市祥盛生 物制药有限公司。黄嘌呤、黄嘌呤氧化酶、尿酸、别嘌 呤醇、甲醇均为色谱纯,购于美国 sigma 公司。磷酸二氢 钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、乙酸铵、 正己烷、盐酸、硫酸、硫酸钾、硒粉,三氟乙酸 (Trifluoroacetic Acid)等试剂均为分析纯。 1.2 主要试验仪器 KND-2C 型蛋白质测定仪 (上海纤检仪器有限公司) ; SHA-C 水浴恒温振荡器(江苏省金坛市农仪器厂); Waters 高效液相色谱(美国 Waters 公司);XDB C18 色 谱柱 (安捷伦科技有限公司) ; METTLER TOLEDO ME20 (瑞士梅特勒-托利多集团) ; GL-21M 高速冷冻离心机 (长 沙湘仪离心机仪器有限公司);全波长扫描多功能读数 仪(Varioskan Flash), 美国 Thermo Fisher Scientific 有限公 司;LABCONCO 冻干机,美国 LABCONCO 有限公司。 1.3 试验流程 秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺流程如图 1 所示。 图 1 秋刀鱼源黄嘌呤氧化酶抑制肽制备工艺流程22 Fig.1 Flow chart of preparation technology of XOD inhibition peptide from saury 1.4 试验方法 1.4.1 单因素试验 取秋刀鱼肉糜 50 g,加入 100 g 去离子水,分别加入 0.3%(以鱼糜质量计)的木瓜蛋白酶、酸性蛋白酶、复 合蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、Alcalase 2.4L 及胰 酶,在其最适 pH 值、55下水解 6 h,根据试验结果选 取最优的酶制剂与其他 5 种酶制剂按照 11 的比例复配 进行酶解,酶解条件为 pH=7.0,55,加酶量 0.3%(以 鱼糜质量计),酶解时间 6 h22。 1.4.2 响应面法优化试验 根据 central composite 试验设计原理,综合单因素试 验所得结果, 以 Y1氮回收率(%)和 Y2XOD 抑制率 (%) 为响应值,选取 X1加酶量(以鱼糜质量计)、X2酶 解时间和 X3中性蛋白酶所占比例,设计三因素五水平 试验(试验方案见表 2),采用响应面分析法分析、优化 秋刀鱼源 XOD 抑制肽的最佳制备工艺。 1.5 分析测定 1.5.1 氮回收率测定 采用凯氏定氮法(参照 GB5009.5-1985)测定秋刀鱼 糜与上清液中总氮23。氮回收率计算公式如下: 氮回收率=(m上清液N上清液)/(m鱼糜N鱼糜) 其中:m上清液表示上清液质量,g;N上清液表示上清液总 N 质量分数,%;m鱼糜表示酶解时加入鱼糜的质量,g;N鱼 糜表示鱼糜的总 N 质量分数,%。 1.5.2 秋刀鱼酶解产物 XOD 抑制活性测定 将酶解产物稀释至 6.4 mg/mL(以氮计),在 96 孔 酶标板中依次加入 50 L 样品或磷酸缓冲盐溶液(PBS, phosphate buffer solution)与 150 L 0.4 mmol/L 黄嘌呤, 每个样品做 3 个平行,以 PBS 组作为空白对照组。25 保温 5 min,再加入 50 L 0.05 U/L 黄嘌呤氧化酶,反应 25 min 后以 80 L 1 mol/L HCl 终止反应,取反应液以超 纯水稀释 10 倍,过 0.25 m 水性膜,用高效液相色谱法 检测尿酸生成量,色谱柱为 Zorbax Eclipse XDB-C18 柱 (5 m,4.6250 mm,安捷伦科技有限公司),液相条件: 洗脱液体积分数为 15%甲醇+85% 0.015 mol/L 磷酸二氢 胺溶液,进样体积为 20 L,流速 1 mL/min,检测波长为 290 nm,运行时间 15 min24。 1.5.3 肽分子量测定 取最优酶解工艺酶解后的秋刀鱼酶解产物稀释至 1 mg/mL,采用凝胶色谱法测定肽的分子量分布,检测条 件: Waters 高效液相色谱(Waters 600) ,TSK gel G2000 SWXL 分析柱;洗脱液为 38 g Na2HPO412H2O+5.04 g NaH2PO42H2O+1 mL TFA 定容到 1 L,流速 1 mL/min, 检测波长 214 nm25。标准肽样品:Conalbumin (75000 Da),Oralbumin (43000 Da),Cytochrome c (12384 Da), Aprotinin (6512 Da),Vitamin B12 (1855 Da),Glutathione (307 Da),相对分子质量的对数值与洗脱体积拟合直线方 程为 y=0.1547x+5.6431(R2=0.9957),其中,y 为标准 肽分子量的对数;x 为洗脱体积,mL。 1.6 数据处理方法 每个数据均为 3 次测定的平均值,试验数据处理和 分析采用 Excel 2013、SPSS 19.0、Design Expert8.05 及 Orgin 9.0 软件,结果采用均值标准偏差形式,不同样 品间的差异采用单因素方差分析进行比较,以 p0.05 为有 显著性。 2 结果与分析 2.1 不同蛋白酶对秋刀鱼酶解效果的影响 图 2 为各种蛋白酶水解秋刀鱼所得氮回收率及酶解 产物的黄嘌呤氧化酶(XOD)抑制率,从样品的氮回收 效果来看,以木瓜蛋白酶酶解的氮回收率最好,高达 第 14 期 赵谋明等:秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化 293 72.69%,中性蛋白酶及胰酶次之;从酶解产物的 XOD 抑 制率来看,酸性蛋白酶最佳(27.62%),中性蛋白酶稍 低。这可能与酶的特异性有关。秋刀鱼蛋白组成中谷氨 酸、酪氨酸、苯丙氨酸及赖氨酸含量较高,而木瓜蛋白 酶及中性蛋白酶可特异性识别这些剪切位点,这对于提 高氮回收率有着积极意义21。然而由于二者所剪切出来 的肽段结构不一,因此其 XOD 抑制活性也不同。由于具 有较高氮回收率的胰酶与木瓜蛋白酶的秋刀鱼酶解产物 的 XOD 抑制率低,分别仅为 9.52%和 2.65%,而具有高 XOD 抑制率的酸性蛋白酶的氮回收率却仅为 43.88%, 其 酶解产物 XOD 抑制率较中性蛋白酶高 1.61 个百分点, 但 氮回收率低了 22.43 个百分点。因此,选取中性蛋白酶为 较佳用酶进行一下步优化试验。 注:不同字母代表样品间的显著差异(P0.05),料液比:1:2(g/g),温度55 , pH 值为相应酶的最适值, 加酶量 0.3% (以鱼糜质量计) , 酶解时间 6 h。 Note: Different letter indicate significant (P0.05);但中性蛋白酶与胰酶对秋刀鱼进行复合酶解 时,使酶解产物 XOD 抑制活性得到了较大提升,XOD 抑制率达到 39.24%,而与 Alcalase 2.4L 复合酶解时仅有 小幅度提升。分析原因这主要与酶的特异性有关22。因 此,试验选用中性蛋白酶与胰酶为较佳复合酶解方案。 2.3 响应面法优化秋刀鱼源抗痛风肽酶解工艺 取秋刀鱼糜按 1:2 的比例加入离子水,在 pH 值 7.0 和 55 的条件下,以加酶量、酶解时间和中性蛋白酶占 总酶量之比为自变量,采用响应面法优化秋刀鱼源抗痛 风肽酶解工艺,探讨三者对秋刀鱼氮回收率、XOD 抑制 率的影响, 筛选最优酶解工艺, 其试验设计及结果见表 2, 回归方程方差分析和显著性比较结果见表 3 和表 4。 由表 3 可知, 氮回收率的响应面二次模型中, 模型 F 值为 14.81,说明模型显著;其 P=0.0001,说明模型各因 素水平项极显著。该模型中失拟检验 P=0.4813,远大于 0.05,其决定系数 R2高达 0.9302,变异系数仅为 1.38%, 信噪比为 12.744,综上说明该模型拟合度高。回归模型 各因素的方差分析还表明一次项因素 X1(加酶量)、X3 (中性蛋白酶所占比例) , 交互项 X2X3及二次项 X12、X22、 X32为显著性因素,其中中性蛋白酶所占比例(X3)对氮 回收率的影响最大,其次是加酶量(X1),且 X2X3存在 相互作用。 表 1 多种蛋白酶的复配对秋刀鱼酶解效果的影响 Table 1 Protein recovery and XOD inhibition activity of saury hydrolysates prepared by multiple proteases 样品 Sample 氮回收率 Nitrogen recovery /% XOD 抑制率 XOD inhibition rate/% 中性蛋白酶+复合蛋白酶 Neutral protease+compound protease 66.60.69 d 23.650.78 d 中性蛋白酶+风味蛋白酶 Neutral protease+flavourzyme 69.920.38 c 21.030.39 e 中性蛋白酶+胰酶 Neutral protease+Pancreatin 72.520.69 b 39.241.01 a 中性蛋白酶+Alcalase 2.4L Neutral protease+Alcalase 2.4L 72.000.14 b 27.831.24 b 中性蛋白酶+木瓜蛋白酶 Neutral protease+papain 80.301.34 a 19.530.65 f 中性蛋白酶 Neutral protease 66.221.38 d 25.340.32 c 注:不同字母代表样品间的显著性差异(P0.05),料液比:1:2(g/g),温度 55,pH 值 7.0,加酶量 0.3%(复配比例 1:1),酶解时间 6 h。 Note: Different letter indicate significant (P0.05),该模型的 R2=0.8741,且从表 4 可知,X1,X2,X1X2,X12、X22、X32 为显著性影响因素,在各影响因素中,酶解时间(X2)对 XOD 抑制率的影响最大,其次是加酶量(X1)。在总的 作用因素中,一次项、二次项和交互相中加酶量和酶解 时间的影响较为显著,说明该模型与试验值拟合较好。 运用 Design Expert(Trial Version 8.0.6)软件,对试 验因素与对应响应值进行回归分析,经回归拟合后,得 到二次元标准回归方程: Y1=0.0404+2.855X1+0.0542X2+0.712X37.96210-3X1X2 +0.121X1X30.0427X2X35.210X122.30310-3X22 0.399X32 (1) Y2=0.274+3.606X1+0.0214X2+0.808X3+0.292X1X2 0.311X1X3+0.0297X2X311.186X120.0103X22 0.877X32 (2) 式中: Y1,Y2分别为氮回收率 (%) 及 XOD 抑制率 (%) 。 X1、X2和 X3分别为加酶量(%,以鱼糜质量计)、酶解 时间(h)和中性蛋白酶所占比例。 上述方程(1)揭示了加酶量、酶解时间、酶比例与 秋刀鱼氮回收率之间的交互影响。 由图 3a 和图 3b 知, 秋 刀鱼氮回收率的最大值出现在各自变量的中心值,说明 加酶量过大、酶解时间过长及中性蛋白酶比例过大都不 利于酶解的进行,分析原因可能是由于蛋白质深度降解 产生了较多疏水性氨基酸含量高的小肽,在疏水相互作 用及静电相互作用的影响下导致肽凝集26-27。由图 3c 可 知中性蛋白酶所占比例比酶解时间对氮回收率影响更 大。方程 2 体现了加酶量、酶解时间和酶比例与秋刀鱼 肽 XOD 抑制活性之间的相互关系。结合图 3d、图 3e 和 图 3f 可知,加酶量和酶解时间对酶解产物 XOD 抑制活 性有显著影响。分析原因可能是:当加酶量较小或酶解 时间较短时, 蛋白质水解程度低, 所生成的大分子肽 XOD 抑制活性较差;而当加酶量过大或酶解时间过长时, XOD 抑制活性较好的多肽被过度水解成抑制活性较差的 多肽或氨基酸。由于不同酶的活性位点不同,因此酶比 例的变化对酶解产物 XOD 抑制活性存在较大影响28, 但 结合回归方程(2)及响应面图形分析可知酶解时间比加 酶量对 XOD 抑制活性影响更大。综合比较,经响应面优 化确定秋刀鱼源 XOD 抑制肽的最佳酶解工艺为: 料液比 12,加酶量 0.29%(其中中性蛋白酶占 56%,胰酶占 44%),在 pH 值 7.0 和 55下酶解 5.99 h。结合生产实 际情况,其最优工艺简化为:料液比 12(g/g),加酶 量 0.3%(中性蛋白酶胰酶=64),在 pH 值 7.0 和 55 下酶解 6 h。此时,氮回收率和酶解产物 XOD 抑制率 的模型预测值分别为 72.69%和 30.32%, 对应验证值分别 为 72.03%和 30.96%,预测模型可靠性高,可应用于秋刀 鱼 XOD 抑制肽的酶法制备。 2.4 秋刀鱼酶解产物的肽分子量分布 秋刀鱼酶解产物肽分子量分布的测定结果如图 4 所 示。近年来的研究表明小分子肽的生物活性更强,张荣 华29研究发现猪皮胶原蛋白酶解产物中分子量范围在 35 kDa 的组分对 DPPH自由基清除效果最佳。周雪 松30的研究表明鸡肉蛋白酶解产物中 2.2 kDa 以下的肽 段抗氧化活性最强。张瑞等人31发现分子量小于 1.0 kDa 的花生肽具有显著抗氧化活性。Itsuki Murota32等人通过 第 14 期 赵谋明等:秋刀鱼制备黄嘌呤氧化酶抑制肽的工艺优化 295 对鲨鱼软骨酶解产物的分离纯化, 发现小分子肽 Tyr-Leu- Asp-Asn-Tyr 和 Ser-Pro-Pro-Tyr-Trp-Pro-Tyr 可显著降低 小鼠血尿酸水平。由本文图 4 可知,秋刀鱼蛋白质经中 性蛋白酶和胰酶作用,降解成不同分子量的肽段,其中 小于 3 kD 的肽段质量分数高达 76.35%, 这可能是秋刀鱼 酶解产物具有明显 XOD 抑制活性的主要原因。 注:其他因素固定在 0 水平。 Note: Other factor levels were 0. 图 3 氮回收率和 XOD 抑制率响应面分析 Fig.3 Response surface plot of XOD inhibition activity and nitrogen recovery 图 4 秋刀鱼酶解产物肽分子量分布情况 Fig.4 Molecular weight distribution of hydrolyzates for saury 2.5 成本分析及应用前景 秋刀鱼经酶解后进行喷雾干燥,得到总蛋白含量约 为 90%的降尿酸肽产品。 秋刀鱼原料蛋白含量约为 20%, 目前价格为 6 000 元/t。 根据上文计算 (72.75%氮回收率) , 生产 1 t 降尿酸肽产品的原料成本约为 3.71 万元, 加工成 本(包括水、电、气、人工费、设备折旧费及酶制剂等) 在 1 万元以下,因此,降尿酸肽产品的总生产成本约为 4.71 万元/t。由于目前市面上尚无降尿酸肽产品销售,该 产品作为工业原料预计售价可在 25 万元/t 以上;如进一 步将肽粉压片或制成其他保健食品其经济价值将更高, 由此可见秋刀鱼经现代生物酶解技术处理后,其营养价 值和经济价值得到更加充分的挖掘,市场发展前景非常 广阔。 3 结 论 本文经单因素试验确定制备秋刀鱼源黄嘌呤氧化酶 (XOD, xanthine oxidase) 抑制肽的最佳复配酶为中性蛋 白酶和胰酶,并在此基础上进一步采用响应面分析法研 究了加酶量、酶解时间和中性蛋白酶所占比例对酶解产 物氮回收率和 XOD 抑制率的影响,优化秋刀鱼源 XOD 抑制肽的最佳制备工艺为:料液比 12 (g/g),总加酶量 0.3%(中性蛋白酶胰酶质量比=64),在 pH=7.0 和 55条件下酶解 6 h,其理论氮回收率和酶解产物 XOD 抑制率分别为 72.69%和 30.32%。 采用优化后的酶解工艺 进行验证, 得到秋刀鱼氮回收率和 XOD 抑制率结果分别 为 72.03%和 30.96%,与理论值基本一致。肽分子量分析 结果表明秋刀鱼酶解产物以小于 3 kDa 的肽段为主。 本文 研究表明秋刀鱼是潜在的优质降尿酸食品原料,且优化 后的 XOD 抑制肽酶法制备工艺操作简单,成本低廉,可 为工业化生产降尿酸肽提供一定的理论和技术指导。 农业工程学报() 2015 年 296 参 考 文 献 1 冯晓晶. 嘌呤及其代谢产物尿酸检测方法研究和应用D. 太原:山西医科大学,2011. Feng Xiaojing. Methods study for determination and application of purine and uric acidD. Taiyuan: Shanxi Medical University, 2011. (in Chinese with English abstract) 2 胡大一,丁荣晶. 无症状高尿酸血症合并心血管疾病诊治 建议中国专家共识J. 中国全科医学,2010(11):1145 1149. Hu Dayi, Ding Rongjing. Diagnosis and Treatment of Asymptomatic Hyperuricemia with Cardiovascular Diseases Suggesting Consensus of Chinese ExpertsJ. Chinese General Practice, 2010(11): 11451149.(in Chinese with English abstract) 3 Mazzali M, Hughes J, Kim Y G, et al. Elevated uric acid increases blood pressure in the rat by a novel crystal-independent mechanismJ. Hypertension, 2001, 38(5): 11011106. 4 Bickel C, Rupprecht H J, Blankenberg S, et al. Serum uric acid as an independent predictor of mortality in patients with angiographically proven coronary artery diseaseJ. American Journal of Cardiology, 2002, 89(1): 1217. 5 Levine W, Dyer A R, Shekelle R B, et al. Serum uric acid and 11.5-year mortality of middle-aged women: findings of the Chicago Heart Association Det

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