课件：三蛋白质化学.ppt

第三章 蛋白质化学 （Protein）,2,主要内容,3.1 蛋白质的重要性和一 般组成 3.2 氨基酸 3.3 肽 3.4 蛋白质的分类 3.5 蛋白质的结构 3.6 蛋白质的重要性质,3.7 蛋白质的结构与功能 3.8 蛋白质的修饰 3.9 糖蛋白和脂蛋白 3.10 免疫球蛋白质和病 毒蛋白 3.11 蛋白质的抽提、分 离、纯化和鉴定,3,本章重点 氨基酸和蛋白质的结构、性质和功能的关系； 蛋白质元素组成特点； 两性解离、等电点、肽键、肽键平面，蛋白质一、二、三级四级结构； 蛋白质结构与空间构象的关系； 蛋白质变性； 常用蛋白质分离纯化技术。,4,3.1 蛋白质的重要性及一般组成,蛋白质存在于所有的生物细胞中，是生活细胞中数量、种类最丰富的生物大分子。,蛋白质是生命活动的物质基础，它参与了几乎所有的生命活动过程。,蛋白质是生物体的结构物质。 蛋白质是生物体的功能物质。 生命是蛋白质的存在方式。,3.1.1 重要性,5,没有蛋白质就没有生命。 动物的毛和蚕丝的成分都是蛋白质，它们是重要的纺织原料；动物的皮可加工成柔韧的皮革； 牛奶中的蛋白质酪素除做食品外，还能和甲醛合成酪素塑料； 酶的主要成分是蛋白质，酶广泛应用于食品、纺织、医药、制革和试剂等工业上。,6,自然界常见蛋白质的成分,1 大部分酶 2 胰岛素、生长激素 3 载体、 4 抗体 5 抗毒素、凝集素 6 部分抗原 7 神经递质的受体 8 朊病毒 9 糖被 10单细胞蛋白,11 丙种球蛋白 12 细胞色素C 13 纤维蛋白原、凝血酶原 14 血红蛋白、肌红蛋白 15 细胞骨架 16 微管、微丝 17 干扰素 18 动物细胞间质 19 含蛋白质成分的食品 如：豆浆、蛋清等,7,蛋白质在生命活动中的重要作用,.酶的催化功能 .控制生长和分化 .转化和贮存功能 .运动功能 .结构支持作用 .免疫保护作用 .代谢调节功能 .接受和传递信息 .生物膜功能 10.感染和毒性作用 11.其它作用,8,3.1.2 蛋白质的一般组成,蛋白质是由20种左右-氨基酸组成的高分子有机物质，相对分子质量由数千至数千万。,元素组成：C（53%）、H（7%）、O（23%）、N（16%）、S（1%） 及 P、Fe、Cu、Zn、Mo、I、Se 等微量元素。,蛋白质平均含N量为16,这是凯氏定氮法测蛋白质含量的理论依据： 蛋白质含量蛋白质含N量6.25,9,氮折算系数,10,3.2 蛋白质的结构单元-氨基酸,3.2.1 氨基酸（amino acid）的结构,氨基酸是羧酸分子中- 碳原子上的一个氢原子被氨基取代而成的化合物。因而，称为-氨基酸。 例外： 赖氨酸，有两个氨基，一个在a位，一个在 位,3.2.1.1 -氨基酸的结构通式,或,结构通式(投影式),两性物质,光活性物质,11,氨基酸,3.2.1.2 氨基酸的分子构型,天然蛋白质中的氨基酸都属L型。,12,3.2.2 氨基酸的分类及其结构,(1)按侧链R基的结构,13,含羟基或硫氨基酸,一氨基一羧基氨基酸,14,一氨基二羧基（酸性）氨基酸及酰胺,天冬氨酸 （Asp,D）,15,二氨基一羧基（碱性）氨基酸,组氨酸 （His,H）,杂 环氨基酸,16,杂环氨基酸,色氨酸 （Trp,W）,17,芳香族氨基酸,18,氨基酸,(2) 按侧链R基的极性,19,20,21,22,人体必需氨基酸有八种： Met Trp Lys Val Ile Leu Phe Thr “假 设 来 借 一 两 本 书”,重要概念： 必需氨基酸：人和动物体不能自身合成，必须由食物供给的氨基酸。从广义上讲，生物体能合成 ，但合成量较少，不足以维持正常生理，还必须由食物补充一部分，称为半必需氨基酸，如Arg、His。,23,特殊氨基酸(Special amino acids) Gly,无光学活性(optically inactive),甘氨酸,24,具环式结构的亚氨基酸(ring structure and imino acid),特殊氨基酸(Special amino acids) Pro,脯氨酸,25,具有活性的巯基 (active thiol)易氧化形成二硫键(disulfide bond), 可用作还原剂( reducing reagent),特殊氨基酸(Special amino acids) Cys,半胱氨酸,26,特殊氨基酸(Special amino acids) His,组氨酸,27,特殊氨基酸(Special amino acids) Phe, Tyr 和Trp,苯丙氨酸,酪氨酸,色氨酸,28,4. 蛋白质分子中不常见(非标准)的L-氨基酸,在少数蛋白质中分离出一些不常见的氨基酸，通常称为非标准(non-standard)氨基酸。这些氨基酸都是由相应的基本(标准)氨基酸衍生而来的。,氨基酸,29,30,在细胞内已发现的非蛋白组成成分的氨基酸有300多种，尽管它们不是蛋白质的构成成分，但具有广泛的生物学功能。,如在尿素循环中的关键代谢中间产物：,L-瓜氨酸：,(Citrulline),5. 天然的非蛋白质氨基酸,氨基酸,存在于脑组织中，与脑组织营养及传递有关的：,H2N-CH2-CH2-CH2-COOH （Y-氨基丁酸）,31,常见氨基酸均为无色结晶, 其形状因构型而异。,溶解性：在水中的溶解度差别很大，并能溶解于稀酸或稀碱中，但不能溶解于有机溶剂。通常酒精能使其从溶液中沉淀析出。 (2) 熔点： 熔点极高，一般在200以上。 (3) 味感：其味随不同氨基酸有所不同，有的无味、有的味甜、有的味苦，谷氨酸的单钠盐有鲜味，是味精的主要成分。 旋光性：除甘氨酸外，氨基酸都具有旋光性，能使偏振光平面向左或向右旋转，左旋者通常用（-）表示，右旋者用（+)表示。 (5) 极性：R残基是亲水性的为极性氨基酸；疏水性的为非极性氨基酸。,3.2.3 氨基酸的主要物理性质,32,（6）光吸收 可见光（390770nm）： 无光吸收。 紫外光（220300nm）：Phe（257nm） Tyr（275nm） Trp（280nm）,测定蛋白质浓度的基础。,33,(1) 氨基酸的离解性质及等电点,3.2.4 氨基酸的主要化学性质,氨基酸在水中的两性离子既能像酸一样放出质子，也能像碱一样接受质子，氨基酸具有酸碱性质，是一类两性电解质。(又称酸碱质子理论),34,As an acid（proton donor）：,As a base（proton acceptor）：,氨基酸的两性解离,35,不同pH时，氨基酸以不同的离子化形式存在：,当氨基酸溶液在某一定pH值时，使某特定氨基酸分子上所带正负电荷相等，成为两性离子，在电场中既不向阳极也不向阴极移动，此时溶液的pH值即为该氨基酸的等电点(isoelctric point)，以pI表示。,pH的影响,36,实验证明在 pI 时，氨基酸主要以两性离子形式存在，但也有少量的而且数量相等的正、负离子形式，还有极少量的中性分子。,当溶液的pH=pI时，氨基酸主要以两性离子形式存在。,pHpI时，氨基酸主要以正离子形式存在。,pHpI时，氨基酸主要以负离子形式存在。,等电点,2019/8/27,37,可编辑,38,氨基酸的等电点pl值相当于该氨基酸的两性离子状态两侧的基团pk值之和的一半； 氨基酸的解离 在一定的pH范围，-氨基酸的-氨基、-羧基和可解离R基团均能解离。可以按照下列步骤分析氨基酸的解离： （1）将氨基酸盐酸盐（即质子化形式）看成多元酸，确定质子供体基团； （2）根据质子供体的解离常数写出该氨基酸盐酸盐的解离方程； （3）根据解离方程确定该氨基酸的等电形式及其解离趋势； （4）根据解离方程计算等电点或在一定pH下氨基酸不同解离形式的比例。,等电点的计算,39,中性氨基酸：以Gly为例,40,酸性氨基酸，以Asp为例：,Asp+,41,碱性氨基酸，以Lys为例：,Lys+,42,甘氨酸滴定曲线,甘氨酸盐酸盐（A+）,等电点甘氨酸（A）,甘氨酸钠（A-）,43,谷氨酸（A）和赖氨酸（B）滴定曲线和等电点计算,B,A,B,44,P82,思考题3 Key：pH值从7下降到6，说明氨基酸溶于水的过程释放出质子，溶液存在如下平衡： AA+H2O AA-+H3O+ 为了使氨基酸达到等电点，只有加酸才能使上述平衡向左移，因此，pI小于6.,45,（a）与亚硝酸（HNO2)的反应,（2）氨基酸的化学反应 （氨基、羧基、侧链R基）,-氨基参加的反应,可用气体测定仪测定N2的量，测定氨基氮的含量; 伯胺反应，赖氨酸的-氨基也能反应，但速度慢；,46,（b）与甲醛的反应,（2）氨基酸的化学反应,一羟甲基衍生物,二羟甲基衍生物,甲醛测定法 测定游离氨基 或蛋白质的水解度,47,（c）酰基化反应,酰氯：,苄氧羰酰氯（Cbz-Cl）:,对甲苯磺酰氯(Tos-Cl)or 5一二甲氨基萘-1-磺酰氯 (dansyl chloride, DNS):,叔丁氧酰氯(Boc-Cl):,酸酐：,邻苯二甲酸酐：,（R酰基）,or,48,Cbz-Cl,Cbz-氨基酸,举例1：,氨基酸与苄氧酰氯（Cbz-Cl）的反应,人工合成肽中保护氨基,49,氨基酸与 5一二甲氨基萘-1-磺酰氯（dansyl chloride, DNS）的反应,举例2：,测定微量AA,有荧光,50,（d）烃基化反应,举例1：与2、4一二硝基氟苯的反应,2，4一二硝基氟苯,（R烃基）,51,DNFB,DNP-氨基酸（稳定、黄色）,肽链N端分析,52,桑格法(F.Sanger),此法的缺点是在水解时，整个肽链都被破坏、所以在肽链上只能进行一次N 端分析。,53,举例2：与苯异硫氰酸（酯）的反应,PITC,肽链N端分析,54,爱得曼（Edman)降解法 这种方法是瑞士化学家爱得曼于1950年提出来的，其优点是每次测定肽链的其余部分不受影响而被保留下来，这样又获得了一个新的N-端氨基。用同样的方法可确定下一个氨基酸组分。,55,（e）脱氨反应,氨基酸经氧化剂或酶（AA氧化酶）的作用，脱氨产生酮酸。,是生物体内氨基酸分解代谢的重要方式之一。,56,(f)成盐作用 R-CH-COOH+HCl R-CH-COOH NH2 NH2HCl,57,（a）成酯和成盐反应,-羧基参加的反应,58,酰化氨基酸对-硝基苯酯,（活化酯）,（式中Y酰基）,人工合成肽,59,（b）酰氯化反应,人工合成肽中和AA中的羧基活化。,60,（c）成酰胺反应,体外：,体内：,61,（d）脱羧基反应,谷氨酸,-氨酸丁酸,胺,62,（e）叠氮反应,人工合成肽中和AA中的羧基活化。,氨基酸,酰化氨基酸,酰化氨基酸甲酯,酰化氨基酸的肼衍生物,酰化氨基酸叠氮,63,-氨基和-羧基共同参加的反应,茚三酮反应 脯氨酸和羟脯氨酸（黄）,64,此反应在分析氨基酸方法上极为重要，产生的蓝基色物质在570nm比色测定。,65,（b）成肽键,肽键,66,侧链R基参加的主要反应,(a) -S-S-和-SH的氧化还原反应,保护AA的SH基不被破坏。,67,侧链R基参加的主要反应,(b) -S-S-和-SH的氧化还原反应,R-SH：HS-CH2CH2OH 巯基乙醇（mercaptoethanol）,HS-CH2COOH 巯基乙酸（mercaptoacetic acid）,HS-CH2(CHOH)2-CH2SH二硫苏糖醇（dithiothreitol, DTT）,68,氨基酸重要化学反应见P89，表3-9,69,3.2.5 氨基酸分析分离,3.2.5.1 分配层析法的一般原理：,主要根据被分析的样品（如aa混合物）在两种互不相溶的溶剂中分配系数的不同而达到分离的目的，,70,纸层析法 氨基酸在纸上移动的速率称比移值或迁移率，以Rf符号代表。也就是原点到溶剂前沿的距离(Ds)同原点到层析斑点(即显色点）中心的距离（DA)的比值。 柱层析法 高效液相层析法 薄层层析法,71,离子交换反应,将氨基酸溶液通过装有离子交换剂的玻璃管