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环境微生物生态学 学时：3,罗剑飞ljfjf2002 课件地址：,Contents,1：微生物生态学概念 2：微生物生态学基本原理 3：自然界中的微生物 4：未培养微生物 5：环境微生物生态学研究方法,1：微生物生态学概念,1.1 生态学发展背景 生态学（ecology）一词最初由希腊文“oekologie”衍生而来，“oikos”是指“居住地、栖息地”，“logos”意为“学科、研究或讨论”，因此，生态学原意为“居住地管理的科学或研究生物栖息环境的科学”，后人将其概括为“研究生物与其生存环境相互关系的学科”。,微生物生态学定义 微生物生态学（microbial ecology）是研究微生物（细菌、真菌、病毒等）与其周围环境（有生命的和非生命的）之间相互关系的一门科学。人们从20世纪60年代初才开始使用微生物生态学这个名称，因此它还是一个比较年轻的科学。 根据微生物生态学研究的特点，微生物生态学的现代定义可以理解为环境生物学。其具体的研究范畴包括微生物的空间分布、组成、结构、生理生化，以及它们与环境间的相互关系和功能等。,1.2 微生物生态学研究内容,按研究对象划分 水域微生物生态学（海洋、河口、湖泊等淡水系统）； 土壤微生物生态学； 作物根系微生物生态学； 草地微生物生态学； 工业发酵微生物生态学（食品、药物、饮料、饲料等）； 废水处理系统微生物生态学（工业废水、农业废水等）； 肠道微生物生态学（人体、动物、昆虫等）。,1.3 微生物生态学研究方向,存在哪些微生物？各有多少？ 发现新的微生物并对其分类、类群的丰度、微生物的多样性、群落的空间结构。 微生物的新陈代谢活动？正在进行什么反应？ 某一类群细胞的潜在功能及可能的行为范围、在环境中实际发生的行为。 不同微生物之间以及微生物与环境之间如何相互作用？ 种群的相互作用、物质交换、信号传递、种群遗传学及进化等。,当前，微生物生态学研究方向的主要热点包括：1）微生物分子生态学；2）微生物与环境修复；3）微生物与碳、氮、磷、硫等元素的生物地球化学循环；4）未培养微生物；5）海洋环境微生物与生物活性物质；6）人体肠道微生物菌群与健康；7）环境微生物宏基因组和宏转录组学；8）极端环境微生物；9）微生物与动植物相互作用；10）微生物与全球气候变化；等。,1.4 微生物生态学研究意义,微生物生态学作为一门独立的学科，与农业、工业、医药、环保、能源等领域有着密切的联系，已成为解决环境污染、能源短缺、资源匮乏等日益严重的社会问题的关键之一，微生物生态学研究也成为微生物学乃至整个生物学中最活跃和最有潜力的研究方向。随着高通量测序技术、生物信息学、计算生物学和系统生物学的发展，微生物生态学研究已不满足于仅对微生物群落结构的揭示，而是在各种组学水平上分析群落结构与功能、微生物与环境的相互作用。,2： 微生物生态学基本原理,自然界中微生物种类繁多，构成了地球生态系统（ecosystem）中最庞大、分布最广的群体。单个微生物细胞生长形成种群（population），各种种群构成生态系统的微生物群落（community），在微观的微生物世界中，为了竞争有限的生存空间和资源，种群与种群之间无时不刻进行着角逐，通过限制其它种群的生长为本种群的繁衍争取更多的可能，亦或与其它种群合作，共同营造适宜的生存空间。环境决定了生境中种群的数量和群落的大小，而微生物也不断改造着其生存的环境。,环境 环境是指某一特定生物体或群体以外的空间，以及影响该生物体或群落生存与生活的外部条件的总和。这些空间由无机的物理、化学因素以及有机的生物因素构成。无机的物理化学因素：土壤、温度、水分、阳光、气候等；有机的生物因素：研究对象以外的其它生物的作用和影响，如拮抗等。,生态系统（ecosystem） 生态系统是指生物群落与生存环境之间，以及生物群落内的生物之间的密切关系、相互作用，通过物质交换、能量转化和信息传递，成为占据一定空间、具有一定结构并执行一定功能的动态平衡整体。生态系统=非生物环境+生物群落，在这个紧密结合的系统中，物质、能量在生物与生物、生物与环境之间不断循环流动，形成一个能够自己维持下去的、相对稳定的，并具有一定独立性的整体。,生态系统组成,种群（population） 种群是指在特定空间内，分布在同一区域的同种生物个体的集合。自然界中，同种生物的许多个体以群体聚集的方式生活在同一生境中；种群是种族存在的前提，是物种具体的存在单位、繁殖单位和进化单位；在地球上的各种生态系统中任何微生物物种的个体不可能单一存在，微生物个体必须与同种及其它种类的许多个体联系形成一个相互依赖、相互制约的群体才能生存。,群落（community） 微生物群落结构包括了垂直结构（空间的垂直分布）、水平结构（地点的不同）和时间结构（随时间的周期性变化）。微生物群落结构具备合理的空间和时间结构是生态系统存在和发展的基础。 在特定生境内的微生物种群随着时间的推移出现取代或被取代，最终形成比较稳定的群落结构，其过程是群落的演替（自然界选择压力的结果）。,种间关系（interspecific interaction） 种间关系是指不同种群之间的相互作用。这些关系有相互依存、相互制约和相互补偿的关系，也称为种间相互作用。自然界中，任何一种生物都不是孤立存在的，而是与其它不同种类的生物之间有着各种各样的联系。,中性同生（neutralism）：又称中性共栖，是指两种微生物生活在同一环境内，但不发生生态关系，至少没有明显直接的生态关系。因为它们要求的环境条件不同，互不改变各自所需要的环境，故称为中性同生。微生物的中性同生现象在自然界很普遍，如淡水中生长的某些藻类与水生细菌，共同处于同一水域，但相互影响很小。由于中性同生不能明显地表现生物间的相互作用，因而研究极少。,偏利共生（commensalism）：又称同住，是指两种微生物生活在同一环境内，在生长过程中其中一种受益，而另一种不受影响。偏利共生常见的现象是一种微生物产生的代谢产物作为另一种微生物的营养。例如，湿土表面或水面上生长的藻类和蓝细菌能分泌多糖、多肽或有机酸，供给细菌生长。另外，一种微生物生长导致的环境改变给其它微生物的生长提供有利条件，也属于偏利共生。例如好氧菌的生长导致环境的氧化还原电位降低，使之适合厌氧菌的生长。因此，当好氧菌和厌氧菌共存与一小环境时，可造成有利于厌氧菌生长的无氧环境。,互惠同生（protocooperation）：又称初级合作，是指两种可以单独生活的生物，当它们生活在一起时，通过各自的代谢活动而有利于对方。因此，这是一种“可分可合，合比分好”的相互关系。例如，在土壤中，纤维素分解菌与好氧性自生固氮菌生活在一起时，后者可将固定的有机氮化物供给前者，而前者因分解纤维素而产生的有机酸可作为后者的碳源和能源，两者相互为对方创造有利的条件，促进了各自的生长繁殖。人体肠道正常菌群与宿主间的关系，主要是互惠同生的关系。,共生（mutualism，symbiosis）：两种生物共同生活在一起，相互依赖，在生理代谢中相互分工协作，不能独立生存。地衣是微生物间共生的典型，是真菌和藻类的共生体。地衣中的真菌一般都属于子囊菌，而藻类则为绿藻或蓝细菌。藻类或蓝细菌进行光合作用，为真菌提供有机营养，而真菌则以其产生的有机酸去分解岩石中的某些成分，为藻类或蓝细菌提供所必需的矿质元素。根瘤菌与豆科植物共生形成根瘤共生体，形成共生关系。,追逐阳光的水母世界七大生物奇观之一,（1）微生物间的共生关系地衣,叶状地衣 （南极石耳）,壳状地衣 （南极中国长城站海边崖岩上的地衣群落）,壳状地衣 （南极丽石黄衣，红色和赤星衣，米黄色）,壳状地衣 （南极的瘿茶渍衣）,（2）微生物与植物间的共生关系,b. 菌根,a. 根瘤,（3）微生物与动物间的共生关系 a. 微生物和昆虫的共生 白蚁、蟑螂等昆虫的肠道中有大量的细菌和原生动物与其共生。有的生活在共生体的细胞外（外共生生物），有的生活在共生体的细胞内（内共生生物）。它们可在厌氧条件下分解纤维素供白蚁营养，而微生物则可获得稳定的营养和其它生活条件。 b. 瘤胃微生物和反刍动物的共生 牛羊等反刍动物食草，但它们没有分解纤维素的能力，而是靠瘤胃微生物帮助分解，使纤维素变成能被牛羊吸收的糖类。瘤胃中生活着多种细菌和原生动物。,捕食（predation）：又称猎食，一般指一种大型的生物直接捕捉、吞食另一种小型生物以满足其营养需要的相互关系。例如，原生动物捕食细菌和藻类，是水体生态系统中食物链的基本环节，对污水的净化处理具有重要的作用。,寄生（parasitism）：一般指一种小型生物生活在另一种较大型生物的体内或体表，从中取得营养和进行生长繁殖，同时使后者蒙受损害甚至被杀死的现象。前者称为寄生物，后者称为寄主。有些寄生物一旦离开寄主就不能生长繁殖，这类寄生物称为专性寄生物。有些寄生物在脱离寄主以后营腐生生活，这些寄生物称为兼性寄生物。在微生物中，噬菌体寄生于细菌是常见的寄生现象。此外，细菌与真菌，真菌与真菌之间也存在着寄生关系。,偏害共生（amensalism）：又称拮抗，是指一种微生物在其生命活动过程中，产生某种代谢产物或改变环境条件，从而抑制其他微生物的生长繁殖，甚至杀死其他微生物的现象。根据拮抗作用的选择性，可将微生物间的拮抗关系分为非特异性拮抗关系和特异性的拮抗关系两类。在制造泡菜、青贮饲料过程中，乳酸杆菌能产生大量乳酸导致环境的pH下降，从而抑制了其他微生物的生长发育，这是一种非特异拮抗关系，因为这种抑制作用没有特定专一性，对不耐酸的细菌均有抑制作用。许多微生物在生命活动过程中，能产生某种抗生素，具有选择性地抑制或杀死别种微生物的作用，这是一种特异性拮抗关系。,竞争（competition）：当两种微生物对某种环境因子有相同的要求时，就会发生争先摄取该种因子以满足生长代谢的需要。由于微生物的群体密度大，代谢强度大，所以竞争十分激烈。在一个小环境内，不同的时间会出现不同的优势种群，优势微生物在某种环境下能最有效地适应当时的环境，但环境一旦改变，就可能被另外的微生物替代形成新的优势种群，这就是微生物间的相互竞争。,3.1 土壤中的微生物 土壤能提供微生物需要的全部营养和环境条件，因而是自然界中微生物最适宜的生存环境和大本营，是微生物菌种资源的宝库。,3：自然界中的微生物,岩石在风化过程中产生的矿质元素和微量元素，能满足多数自养微生物的生长需要，土壤中的有机物质为异样微生物提供了良好的碳源、氮源和能源，土壤中的水分也可以满足微生物的要求。 土壤的pH值接近中性，缓冲性也较强，适合大多数微生物生长。 肥沃的土壤具有较好的团粒结构，空隙中充满着空气和水分，为好氧和厌氧微生物的生长提供了良好的环境。 土壤的保温性能好，昼夜温差和季节温差的变化不大。在表层土几毫米以下，微生物便可免于被阳光直射致死。,土壤中微生物数量,据估计，每亩耕作层土壤中约有微生物250kg，其中，霉菌150kg，细菌75kg，原生动物15kg，藻类7.5kg，酵母菌7.5kg。,不同土壤中微生物数量,有机物质含量丰富的黑土、草甸土、磷质石灰土和植被茂盛的暗棕土中，微生物的数量较多；而在西北干旱地区的棕钙土，华中、华南地区的红壤和砖红壤，以及沿海地区的滨海盐土中，微生物的数量较少。,土壤中生存的大部分细菌为G+菌，数量比海水或海洋环境中的高，常见的属包括：不动杆菌属（Acinetobacter）、农杆菌属（Agrobacterium）、产碱杆菌属（Alcaligenes）、芽孢杆菌属（Bacillus）、短杆菌属（Brevibacterium）、柄杆菌属（Caulobacter）、纤维单胞菌属（Cellulomonas）、梭菌属（Clostridium）、棒状杆菌属（Corynebacterium）、黄杆菌属（Flavobacterium）、分支杆菌属（Mycobacterium）、假单胞菌属（Pseudomonas）、葡萄球菌属（Staphylcoccus）、黄单胞菌属（Xanthomonas）等。,土壤中放线菌的数量占细菌总量的10%30%，链霉菌属（Streptomyces）和诺卡氏菌属（Nocardia）占的比例最大，其次是微单胞菌属（Micrococcus）、放线菌属（Actonomyces）和其它稀有放线菌属。放线菌大部分为腐生菌，常分布于有机质含量较高的土壤中，一般都是好气性，随着土壤深度的增加而数量减少；放线菌适合于在碱性或中性条件下生长，对酸性条件敏感，且对对干燥条件具有一定抗性。,土壤中常见的蓝细菌包括：鱼腥藻属（Anabaena）、眉藻属（Calothrix）、色球藻属（Chroococcus）、念珠藻属（Nostoc）、筒孢藻属（Cylindrospermum）、鞘丝藻属（Lyngbya）、小枝藻属（Microcoleus）、节球藻属（Nodularia）、颤藻属（Oscillatoria）、席藻属（Phormidium）、织线藻属（Plectonema）、裂须藻属（Schizothrix）、伪枝藻属（Scytonema）、单歧藻属（Tolypothrix）等。这些蓝细菌中，鱼腥藻等在一些条件下可直接固定大气中的氮，其合成的含氮化合物可以为其它微生物和高等植物提供氮营养，也可以提高土壤肥力，使农作物增产。,土壤真菌多为好氧菌，常分布于土壤表层10cm处，主要包括来自霉菌的曲霉属（Aspergillus）、地霉属（Geotrichum）、青霉属（Penicillum）和木霉属（Trichoderma），以及来自酵母菌的假丝酵母属（Candida）、红酵母属（Rhodotorula）、隐球酵母属（Cryptococcus）、油脂酵母属（Lipomyces）、施瓦酵母属（Schwanniomyces）、克鲁氏酵母属（Kluyveromyces）、裂殖酵母属（Schizoblastosporion）、汉逊酵母属（Hansenula）等。真菌具有大量的酶系，能降解植物的残体，甚至木质素。,3.2 水体中的微生物 地球上有着广阔的海洋、江、河、湖泊等自然水域，水中含有不同数量的有机物和无机物，具备各种微生物生长、繁殖的基本条件。因此，水体是微生物广泛分布的第二个理想环境。依照水体的化学组成，天然水体可大致分为淡水和海水两大类型。,（1）淡水微生物 远离人类居住地区的湖泊、池塘和水库，有机物含量少，因而微生物数量也少。此时水体中的微生物以自养型种类为主，如硫细菌、铁细菌和含有光合色素的蓝细菌、绿硫细菌和紫硫细菌等；另外还有色杆菌属，无色杆菌属和微球菌属等腐生型细菌。,（1）淡水微生物 处于城镇等人口密集区的湖泊、河流以及下水道的污水中，由于流入了大量的人畜排泄物、生活污水和工业废水等，有机物的含量大增，微生物的数量可高达107108ml，这些微生物大多数是腐生型细菌和原生动物，其中数量较多的是无芽孢革兰氏阴性细菌，如变形杆菌属，大肠杆菌、产气肠杆菌和产碱杆菌等，有时甚至还含有伤寒、痢疾、霍乱及传染性肝炎等病原体。,（2）海水微生物 海洋覆盖了地球表面的71%，平均深度约4km。海水含有相当高的盐分，一般为3.24.0。海洋水体的特点是有机质等营养物的含量低、盐含量高、温度低，因此，海洋微生物具有耐盐、耐压、嗜冷和低营养要求的特点。 海洋生态中，近海海水中微生物数量较高，而远离海岸的大洋中微生物数量较少。一般在河口、海湾的海水中，细菌数约有105个ml，而远洋的海水中，只有10250个ml。,广阔的海洋中，由于营养水平通常非常低，特别是氮、磷和铁这些关键的无机营养，微生物的活性和数量从而受到限制。在贫瘠的海水中，多数初级生产力是由原核和真核的微藻光合作用产生的。原绿藻（Prochlorophyte）是原核微藻的典型代表，目前发现的原绿藻主要有原绿球藻蓝细菌属（Prochlorococcus）、原绿蓝细菌属（Proshloron）和原绿丝菌属（Prochlorothrix）。原绿藻同时含有叶绿素a和叶绿素b，而缺乏藻胆素，因此，它们既像蓝细菌（原核生物且含有叶绿素a），同时也和植物的叶绿体相似（含叶绿素b，不含藻胆素），但从系统发育而言，原绿藻与蓝细菌亲缘关系更近。,原绿藻与叶绿体 原绿蓝细菌是最早被发现的原绿藻，是作为一种与海鞘类共生的生物被发现的，还未能在实验室培养。原绿蓝细菌的细胞为粗球形，直径810m，有一层很厚的类囊体膜系统，与叶绿素的结构类似。 在发现原绿藻之前，人们一直认为叶绿体最初来源于蓝细菌和原始真核细胞的内共生作用。然而，如果目前所有的植物叶绿体色素最初来源于含有藻胆素的内共生生物体，那么它的叶绿素b是从何进化来的？原绿藻的发现，取代了蓝细菌作为绿色植物叶绿体的祖先的假设。然而，现有的系统发育分析没有表明原绿蓝细菌、原绿球蓝细菌或原绿丝菌是绿色植物叶绿体的祖先，而证明原绿藻、蓝细菌和植物叶绿体都是来自于一个共同的祖先。,在海洋环境中，细菌和古菌随着海水深度变化有着不同的分布，在上层水域（1000m），细菌占有优势，数量105个，而下层水域细菌和古菌数量差异不大，数量103个。古菌在海洋中分布很广，从表层水域到深海环境，都有古菌的存在，而分布于下层水域的古菌几乎都是古菌的一个门泉古菌（Crenarchaeota）。,3.3 空气中的微生物,1）无原生的微生物区系，主要以气溶胶形式存在； 2）来源于土壤、水体及人类的生产、生活活动； 3）种类主要为真菌和细菌，一般与其所在环境的微生物种类有关； 4）数量取决于尘埃数量； 5）停留时间和尘埃大小、空气流速、湿度、光照等因素有关； 6）与人类的关系：传播动、植物疾病，造成食品及发酵生产中的污染,7）城市街道、医院、宿舍等公共场所空气中含量高；森林、海洋、高纬度地带的空气中微生物含量很少。 8）微生物在空气中只能短时间停留，就要落地，大部分死亡，包括一些人体病原菌。但结核、白喉、炭疽等杆菌和肺炎双球菌、葡萄球菌、流感病毒、脊髓灰质炎病毒抗性比较强。能传染疾病。 9）微生物在空气传播的距离是无限的，因而其分布是世界性的。 10）空气中的微生物的数量是大气污染程度的标志之一。,3.4 极端环境下的微生物 存在于地球的某些局部地区、绝大多数微生物所不能生长的特殊环境称为极端环境。极端环境主要有高温、低温、高酸、高碱、高盐、高压或高辐射强度等环境。在极端环境下生活的微生物如嗜热菌（thermophiles）、嗜冷菌（psychrophiles）、嗜酸菌（acidophiles）、嗜碱菌（alkaliphiles）、嗜盐菌（halophiles）、嗜压菌（barophiles）或耐辐射菌等，被称为极端环境微生物或极端微生物。,嗜热菌 广泛分布在草堆、厩肥、温泉、煤堆、火山地、地热区土壤及海底火山附近等处。人为的高温环境，如工厂的热水装置和人造热源等处也是嗜热菌生长的良好环境。,耐热菌,兼性嗜热菌,专性嗜热菌,极端嗜热菌,超嗜热菌,嗜热菌的类型：,一般将能在55以上环境中生长的微生物统称为嗜热菌。,嗜热菌中细菌和古菌较多，且分布广泛。细菌以酸热性硫化叶菌（Sulfolobus acidocaldarius）为代表，是一种严格好氧，兼性化能自养细菌，分布在酸性温泉和存在火山岩浆的土壤中，生长的最适pH 为3，最高生长温度为8590。在酸性温泉中，还存在氧化硫杆菌、嗜热硫球菌、嗜热放线菌等。在深海热液中存在嗜热嗜盐菌，如栖热菌属（Thermus）的细菌和海洋红栖热菌（Rhodothermus marinus）。古菌以詹氏甲烷球菌（Methanococcus jannaschii）和炽热甲烷嗜热菌（Methanothermus fervidus）为代表，它们广泛分布在一些污泥、温泉和深海热液中。,嗜冷菌 嗜冷菌是最适生长温度为不高于15或更低，最高生长温度为不高于20的微生物，主要分布在极地、深海、冻土、冰箱等环境中。 目前得到的嗜冷菌主要是G-，主要有假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、无色杆菌属（Achromobacter）、黄杆菌属（Flavobacterium）、噬纤维菌属（Cytophaga）、科尔维尔氏菌属（Colwellia）、西瓦氏菌属（Shewanella）、海洋杆菌属（Marinobacter）、交替单胞菌属（Alteromonas）、弯杆菌属（Flectobacillus）、极地杆菌属（Polaribacter）、盐杆菌属（Halobacillus）、动球菌属（Planococcus）等细菌，以及假丝酵母属（Candida）、隐球酵母属（Cryptococcus）、红酵母属（Rhodotorula）、青霉菌属（Penicillum）、分子孢子菌属（Cladosporium）等真菌。,嗜酸菌 自然界有很多酸性环境，例如采矿废水、酸性温泉、发酵制品等，在这些天然或人工的环境中分布着许多微生物。酸性条件下生长的微生物根据对酸的特性主要分为两类：1）耐酸菌：在酸性环境中能生长或生存，但它们最适的pH值为49的微生物；2）嗜酸菌：在pH大于3的环境中不能生存的微生物。,大多数酸性环境中的嗜酸菌主要以氧化S0和Fe2+获得能量，氧化S0的嗜酸菌主要包括氧化硫硫杆菌（Thiobacillus thiooxidans）、嗜酸硫杆菌（Thiobacillus acidophilus）、铜硫单胞菌（Thiomonas cuprinus）、喜温硫杆菌（Thiobacillus caldus），还有硫化叶菌属（Sulfolobus）和硫磺球菌属（Sulfurococcus）的一些古菌；氧化Fe2+的嗜酸菌主要包括（Thiobacillus ferrooxidans）、氧化亚铁钩端螺旋体（Leptospirillum ferrooxidans）、嗜酸铁微菌（Ferromicrobium acidophilus）、嗜酸硫化杆菌（Sulfobacillus acidophilus）、氧化亚铁嗜酸微菌（Acidomicrobium ferrooxidans）等细菌，还有酸菌属（Acidianus）、生金球菌属（Metallosphaera）和硫磺球菌属（Sulfurococcus）等古菌。,除了嗜酸的细菌和古菌，在酸性环境中还分离到了嗜酸的酵母，如红酵母、椭圆酵母、酿酒酵母、假丝酵母等；霉菌包括菌幕枪丝霉（Acontium velatium）、黑色枪丝霉（Acontium pullans）、头孢霉（Cephalosporium）等，菌幕枪丝霉和头孢霉是目前发现的抗酸能力最强的微生物，它们可以在1.25mol/L的H2SO4中生长。此外，在一些酸性温泉中发现了嗜酸的藻类，主要包括温泉红藻（Cyanidium caldarium）、嗜酸衣藻（Chlamydomanas acidophila）、绿藻（Chlorella spp.）、环丝藻（Ulothrix zonata）等。,嗜碱菌 嗜碱菌是指在pH 9以上生长良好，在中性或酸性pH下不能生长或生长缓慢的微生物。嗜碱菌主要分布在碱性湖泊中，根据生理类型不同可分为嗜碱菌和嗜盐嗜碱菌（haloalkaliphiles）。嗜碱菌生长的最适pH在10左右，而嗜盐嗜碱菌的生长除了要就碱性环境，还需要高盐环境（NaCl浓度高于3.3%（m/V）。 芽孢杆菌属（Bacillus）、微球菌属（Micrococcus）、假单胞菌属、黄杆菌属、梭菌属（Clostridium）等；嗜碱蓝细菌：集胞藻（Synechocystis）、拟鱼腥藻（Anabaenopsis）、聚球藻（Synechococcus）、念珠藻（Nostoc）等；嗜碱古菌：嗜盐碱杆菌属（Natrialba）、嗜盐碱单胞菌属（Natronomonas）、盐杆菌属（Halobacterium）等；此外，嗜碱放线菌和嗜碱酵母菌也有发现。,嗜盐菌 自然界中存在很多高盐的环境，如自然形成的死海和大盐湖，盐度分别为200300g/L和150288g/L，比海水盐度（35g/L）高出很多；制盐场和腌制食品是会造成人工的高盐环境。高盐环境中，由于高渗透压，大部分微生物细胞因质壁分离而不能生长或生存，但一些微生物可以抵抗高渗透压，在高盐环境中生存。这些在高盐环境中生存的微生物可分为三类：1）抗盐菌，能够适应的盐度范围是01.0mol/L，最适生长盐度为00.3 mol/L；2）中度嗜盐菌，能够适应的盐度范围是0.14.5mol/L，最适生长盐度为0.52.5 mol/L；3）极端嗜盐菌，能够适应的盐度范围是1.05.0mol/L，最适生长盐度为3.0 mol/L以上。,耐辐射菌 环境中的辐射可分为非电离辐射和电离辐射，非电离辐射包括紫外线、可见光和红外线。适量的可见光和红外线对微生物是有益的，紫外线低剂量时会导致微生物遗传物质的突变但不会导致细胞死亡，但高剂量时对微生物有致死作用。电离辐射包括X射线、射线和宇宙射线，这些射线波长很短，带有较高的能量，并且穿透力强，作用于微生物细胞时会造成很大的损伤，导致细胞死亡。,耐辐射奇球菌（Deinococcus radiodurans）是自然界中较为常见的一种抗辐射细菌，其家族成员都具有抵御电离辐射、紫外线等引起的致死和致突变的能力，对数生长期的细胞对电离辐射和紫外线的抗性是大肠杆菌的200倍和20倍。,4：未培养微生物,培养物及环境DNA样品的细菌rRNA多样性,顶角表示该门中RNA序列的相对丰度,红色程度代表可培养微生物的比例,黄色部分表示该种群中全部为未培养微生物。,1987年Carl Woese通过生物核糖体RNA的序列分析提出了生物体三域的学说，自此，16S rRNA的系统分类学研究日见广泛地应用于环境微生物分析。这种基于DNA/RNA测序技术与序列分析的方法不依赖于传统的微生物培养技术，极大的拓宽了人们对地球上微生物多样性的认识。至今为止，在人类已知的原核生物53个门的分类单元中，只有26个门囊括了经过实验室培养的细菌。剩下目前定义为： 未培养微生物,活的但不可培养（viable but nonculturable, VBNC）微生物,Colwell 实验室在1982年提出活的但不可培养微生物的概念，他们发现将霍乱弧菌和大肠杆菌转到不含营养物质的盐水中，经常长时间的低温保存，细菌会进入一种数量不减、有代谢活力、但在正常试验室培养条件下不能生长产生菌落的状态，称为活的但不能培养（viable but nonculturable, VBNC）状态。其后对多种属细菌进行试验证明，这种不可培养状态是普遍存在的。自然界中也广泛存在着这种活的但不可培养微生物，未被培养的种类却代表了巨大的多样性。,不可培养微生物的概念不仅仅局限于VBNC微生物，不可培养是由于受现有纯培养分离技术的限制，目前自然界中绝大部分的微生物是人们还无法纯培养的，甚至是不曾认识的，迄今可培养的微生物仅约占自然界存在微生物的1.0%或更少。它们主要存在于有机物质贫乏的极端环境中，如远洋、深海、贫瘠土壤等环境。一般地，海水中微生物可培养的约为0.001%0.1%，淡水约为0.25%，土壤约为0.3%，活性污泥为1%15%左右。,（1）微生物不可培养的原因,1）寡营养微生物： Kuznetsov等将寡营养微生物定义为可在有机碳含量10 mg/L的培养基上生长的微生物。通常情况下，海洋是典型的寡营养环境，溶解性有机碳(DOC)水平常年维持在50mol/L100mol/L或0.6 mg/L1.2 mg/L。这些寡营养微生物进化形成了个节约能量的生存策略，它们自由生活在极低水平碳环境中，个体微小，生长缓慢，生长速率和丰度变化很小，以达到最大的营养利用率。这些微小的寡营养细菌有一个高效的营养吸收机制，在低营养浓度下，它们依然可以吸收足够的有机质来维持生长，营养的增加甚至会阻碍其生长。,2）协同生长方式的破坏：互养(Syntrophism)和共代谢(Co-metabolism)等方式是微生物在自然界中重要的生存模式之一，共栖、互生与共生等便是微生物自然生态关系中共同协作生存方式的不同层次。同一生境的微生物之间联系千丝万缕，细胞与细胞之间有着广泛的通讯和联系。因此，对微生物而言，纯培养所导致的共同协作的自然生存方式的崩溃是造成其可培养性低的重要生态学原因。,3）特殊营养物质的未知或缺乏：纯培养很难提供对许多细菌潜在重要的外源活性物质。比如：在海水或淡水中ATP的浓度可达1nmol/L，很可能源自浮游植物和其它浮游生物；许多水生细菌离不开藻类分泌的生长因子和维生素；植物、动物病原菌对寄主活性物质的依赖等都是传统纯培养法难以提供的。所以，潜在外源活性物质的缺乏也是导致部分微生物难以获得纯培养的重要生态学原因。,（1）微生物不可培养的原因,4）生长缓慢。 5）氧的毒害作用。 6）生长条件苛刻。 7）样品采集过程的影响。,（2）新型微生物分离方法,1）菌落转移法：当环境样品转移到固体培养基上时，一些寡营养菌的生长可能会有一个延迟期，在此期间，这些菌可能会被其他快速生长的菌落所掩盖，如一些可以在平板表面滑动和快速分散的细菌。菌落转移法是将平板上新形成的菌落不断地转移到新的培养基上，通过长时间的培养使那些生长较缓慢的寡营养菌得到生长和分离的机会。,2）极端稀释法：极端稀释培养是将环境微生物样品不断稀释，使最后一个稀释度中的细胞含量极低(110个细胞），其培养液中的营养物浓度一般也很低，最大程度的模拟自然条件下的寡营养状态，会使用未加改动的环境水体作为稀释液和培养液。这种培养方法倾向于选择丰度最大而不是营养感应与耐受性最强的微生物，也就是说，不是最容易培养的，而是自然环境中数量上占有优势的种群。在这种菌群和营养都极端稀释的条件下，数量较多、生长缓慢的海洋寡营养菌的培养占优势。,3）扩散培养室及单细胞封装培养：扩散培养室两端用0.03m微孔滤膜封闭，样品稀释后与自然海水琼脂培养基混合倒入培养室，然后整体置于类似于自然水体的环境中进行培养。这种培养室限制了微生物细胞的进出，但允许化学物质的交换，提供了环境相同组成的化学成分，微生物可以得到由环境提供的各种营养物质。 与扩散培养室法类似,单细胞封装培养同样允许细胞在环境营养浓度条件下生长。这种方法又称凝胶微滴培养,是结合单细胞包埋和流式细胞技术的高通量培养法。,左：扩散盒，中间为实验样品与琼脂的混合物，两端用0.03um的聚碳酸酯膜封住；右：原位环境培养。,分离芯片法：与标准扩散盒法相比，有更短的扩散距离，使更多细胞能感应外部环境并生长；更容易检测和观察；适合于大规模分离和培养。,凝胶微滴培养,4）单细胞分离：借助特殊的仪器设备，如:显微操作仪、光学镊子、流式细胞仪等。可对单个细胞进行细微操作将其从微生物群体中分离出来，再对分离出的单细胞进行扩大培养以获得纯培养物或进行单细胞PCR扩增。这样就可以避免由于某些微生物数量少、生长受其他微生物抑制或生长缓慢等因素导致的“不可培养性”。,不可培养微生物资源,由于未培养微生物无论是其物种类群，还是新陈代谢途径、生理生化反应与产物等，都存在着丰富的新颖性和多样性，因而比以往的可培养微生物具有更为丰富和多样化的、可供人类开发利用的生物资源，蕴藏着丰富的新基因。不可培养微生物的研究开拓了微生物学研究的新领域，不仅在基础生物学研究中具有意义，同时发现新的物种、新的基因和新的代谢产物，将对发现新化合物特别是新药开发具有积极意义。,4.1 未培养微生物甲烷营养古菌与甲烷厌氧氧化,a：火山泥中的微生物群，b：黑海沉积物中的产甲烷微生物群，c：含油沉积物上的微生物群，d：沥青流中的微生物群,海底样品DNA的分子分析揭示了微生物巨大的多样性，而其中大多是难以培养的。尽管2-4km的海底微生物的产出率低于海洋表面环境，但任何深度的单位体积海底沉积物中微生物的数量是海水中的10-1000倍。由于海洋面积巨大，海洋深层生物圈构成了地球上所有微生物的一个“潜伏主体”，相当于地球微生物总量的50-80%。,海洋环境中，仅有0.01-0.1%的微生物目前是可培养的。在这些不可培养微生物中，最具代表性之一的是催化甲烷厌氧氧化（AOM）两个关键共生菌群甲烷营养古菌（ANME）和硫酸盐还原菌（SRB）。 ANME和SRB催化的AOM是海底沉积物中的一个关键的生物地球化学过程，但是，由于缺乏ANME和SRB的纯培养物，AOM的生物化学途径还没有得到很好地揭示。这些微生物无法分离的主要原因是生长缓慢，和两者之间存在的共生关系。,一、硫酸盐偶联型AOM（SAMO）及其关键微生物,通常，厌氧微生物较之好氧微生物以更低的能量产出进行生长代谢，而-20kj/mol的产能反应被定义为微生物代谢的一个门槛，即阈值。,早在20世纪70年代就发现了该反应，研究发现在与氧气有接触之前，从深层沉积物区域向上扩散的甲烷会在硫酸盐存在的区域消失，并且甲烷的氧化伴随硫酸盐还原的增加而增加。因此推测微生物催化了上述反应，但由于该反应产能极低，认为该反应不足以支持微生物的生命活动。,ANME存在的直接证据来自于对环境中古菌脂质的研究：从伊尔河流域（释放甲烷到水体而著名）的沉积物中提取到了古菌所特有的脂质生物标志；从东地中海火山泥和水合物海脊的沉积物中获取的古菌脂质与甲烷产生菌科Methanosarcinales相似，表明甲烷是有机体合成脂质时的碳源。有趣的是，从伊尔河流域样品的rRNA基因文库中得到了新的古菌进化群，其中一个试与产甲烷菌相关的新分支，并被作者提议为厌氧甲烷氧化菌的代表。,发现ANME的第二步是通过显微镜对荧光素标记的特异性寡核苷酸探针杂交的甲烷厌氧氧化菌细胞进行观察鉴定。奇怪的是，在这些沉积物中ANME与SRB的聚集体丰度非常高，占整个微生物群落的90%以上。这一发现支持了Hoehler的假设，即通过活化甲烷的古菌和提供电子的SRB耦合进行甲烷的厌氧氧化作用。 在AOM过程中ANME和SRB共生关系的发现来自于特异性探针的荧光原位杂交（FISH）技术对甲烷水合层中微生物菌团进行观察，发现ANME与SRB抱团生长。,Red：ANME Green：SRB,尽管AOM反应释放的能量极低，在该反应在海洋沉积物的SMTZ中非常普遍。此外，在大部分甲烷和硫酸盐存在的缺氧海水水体、淡水沉积物和陆地生态中，都有AOM过程的存在，尽管AOM是迄今为止已明确的以硫酸盐氧化有机质的微生物中生长最缓慢及生长量最低的反应，但这些微生物在自然界中组成了最为密集和庞大的细胞集群。,过去的十年，微生物学家们对自然界中ANME种群的多样性进行了大量的研究，基于16S rRNA和mcrA基因多态性，在73种不同海洋环境和24种不同陆地环境中发现了ANME（截止2008.12）；这些ANME主要分为三个分支，ANME-1、ANME-2和ANME-3。,SRB一般属于脱硫八叠球菌属（Desulfosarcina）、脱硫球菌属（Desulfococcus）和脱硫叶菌属（Desulfobulbus）；与ANME-1和ANME-2共生的SRB往往属于Desulfosarcina和Desulfococcus，因为这些SRB很容易吸附在这些古菌上，形成外包有机物的细胞絮凝体；而ANME-3共生的SRB通常属于Desulfobulbus 。随着研究的继续进行，发现与ANME关联的细菌并非只有SRB，-变形菌纲的Sphingomonas spp.和-变形菌纲的Burkbolderia spp.也会成为与ANME-2c关联的优势或主要菌群。,二、反硝化偶联型AOM（DAMO）及其关键微生物,目前，在环境中发现了两类AOM反应类型：（1）与硫酸盐还原偶联的甲烷氧化称为硫酸还原型甲烷厌氧氧化（Sulfate-dependant Anaerobic Methane Oxidation, SAMO）；（2）与AOM偶联的反硝化型甲烷厌氧氧化（Denitrification- dependant Anaerobic Methane Oxidation, DAMO）；目前，SAMO过程不仅发现于海洋生态中，陆地环境中也有发现，而DAMO主要发现于淡水沉积物和污水处理系统中。,SAMO,DAMO,SAMO的发现：1999年,DAMO的发现：2006年,Islas-Lima等通过试验首次证明了反硝化型甲烷厌氧氧化过程。他们接种了以乙酸作为基质长期运行的反硝化污泥，在缺氧的条件下启动甲烷氧化反应器，在运行过程中不断向反应器内通入甲烷气体，经过6个月的运行，反应器内NO3-N的去除速率达295 mg L-1d-1，并保持了较好的稳定性。而在没有通入甲烷气体的对照试验组中，反应器内的NO3-N浓度基本不变。因而认为在该反应器内NO3-N的还原耦联了甲烷的氧化。遗憾的是该研究缺乏了反应器内菌群分析的数据支持。,2006年，Raghoebarsing等采用厌氧SBR反应器成功富集了DAMO培养物，首次证明了DAMO的存在。研究发现，该富集培养物能够在完全无氧的条件下和反硝化耦联将甲烷厌氧氧化，利用NO2-和NO3-作为DAMO的最终电子受体，但优先利用NO2-。富集培养物的系统发育分析表明，一些细菌序列在整个细菌克隆库中占据主导地位，这些序列都归属于NC10门，该门的细菌都是不可培养的，且与其他细菌门的亲缘关系较远(序列相似度小于85%)。在古菌的克隆库中包含了与ANME-2(序列相似度为86%88%)和甲烷短杆菌属(序列相似度为86%87%)亲缘关系较远的古菌。因而认为此DAMO富集培养物的功能微生物为ANME和NC10门细菌。,ANME,对DAMO培养物进行进一步的富集，结果发现，随着富集过程的推移，培养物中古菌数量不断减少，直至完全消失，但甲烷和NO2-的转化速率并不受影响。据此，认为该培养物的DAMO过程主要由NC10门的细菌完成。此外，获得了另一种DAMO富集培养物，16s rRNA系统发育表明，此培养物中同样不存在古菌，只存在一种NC10门的细菌占主导地位。他们监测了此类细菌的生长状况，发现其与培养物内NO2-的还原速率和生物量的增长呈现很好的正相关，该实验结果也再次证实了DAMO富集培养物中甲烷的氧化由NC10门的细菌独立完成。 因此，与SAMO不同，DAMO过程可以有古菌的参与，但古菌的存在并非是必需的。,目前关于DAMO的研究尚处于起步阶段，由于缺乏足够的DAMO富集物（截止目前共有四种DAMO富集物），对DAMO机理、以及DAMO过程中ANME和NC10门细菌所扮演的角色也尚不明确，只是推测古菌在还原NO3-为NO2-的过程中起了重要作用，而细菌则在还原NO2-成氮气的过程中起了关键作用。与SAMO不同，迄今发现的DAMO主要发生于淡水环境，例如淡水沉积物和人工污水处理系统中。这些环境中硫酸盐浓度较低，NO3-和NO2-是主要的电子受体，且淡水沉积物中有机质含量较高，分解后释放的甲烷极易与NO3-或NO2-接触，继而发生DAMO过程。,三、其它AOM途径,除SO42-、NO2-和NO3-外是否可能还存在其他AOM的电子受体?在各种水体中往往会含有较多的高价金属和非金属离子，如Fe3+、MnO4-和ClO4-等，从热力学角度分析，这些物质与甲烷反应所释放的能量都较大，因而它们都有可能成为AOM过程的电子受体，AOM过程可能会有更多的代谢途径。,5: 环境微生物生态学研究方法,5.1 微阵列技术,微阵列（Microarray）是近些年发展起来的一种非常有用的染色体基因组技术，1998年被science杂志和媒体评为10项最有突破的技术之一。 该技术是一种新的研究工具，它可以让研究人员从综合和动态的分子角度观察不同生理状况的活细胞中基因的转录、表达。为细胞生长、分化和进化到疾病的发病机理、耐药性和癌症、新药开发、环境治理等研究提供了有效的工具。,一、DNA微阵列的概念,通过自动化的仪器将大量的DNA序列附着在几个平方厘米的固体基质上，包含数千至数万个核苷酸探针的小型化阵列。这些微阵列常被称为微芯片、生物芯片、DNA芯片或基因芯片，但为了与计算机芯片区分开来，统一称之为微阵列。 DNA序列来源：PCR、cDNA、RNA;,1）高通量和平行分析,2）高灵敏度,3）不同标记，同时分析,4）背景干扰低,5）实时数据分析,6）自动化控制,优点,二、DNA微阵列检测过程,三、DNA微阵列在不可培养微生物研究中应用,微阵列作为一种特异性好、灵敏度高、可定量及高通量的技术，在不可培养微生物的检测和鉴定中有着巨大的应用前景。,系统发育寡核苷酸芯片,功能基因芯片,群落基因组芯片,宏基因组芯片,全基因组开放阅读框芯片,5.2 宏基因组学（metagenomic）,人类基因组计划(human genome project，HGP)的完成，从结构基因组学进入以功能