GA-T597-2006中毒检材中静松灵的定性定量分析方法.pdf

I C S 1 3 . 3 1 0A 9 261 : 1中华 人 民共 和 国公 共 安全 行 业 标 准G A/ T 5 9 7 - 2 0 0 6中毒检材中静松灵的定性定量分析方法Q u a l i t a t i v e a n d q u a n t i t a t i v e a n a l y s i s f o r X y l a z o l i i n p o i s o n i n g s a m p l e s2 0 0 6 - 0 1 - 1 7 发布2 0 0 6 - 0 5 - 0 1 实施中华人民共和国公安部发 布GA/ T 5 9 7 -2 0 0 6目 U吕本标准由全国刑事技术标准化技术委员会毒物分析标准化分技术委员会提出并归口。本标准起草单位: 山东省济南市公安局刑警支队、 山东省公安厅科技处。本标准主要起草人: 梁凯军、 李长立、 陈鲁军、 刘海燕、 王可。G A/ T 5 9 7 -2 0 0 6中毒检材 中静松灵的定性定量分析方法范围本标准规定了中毒检材中静松灵的检验方法。本标准适用 于中毒检材 中静松灵的定性分析和定量分析 。规范性引用文件 下列文件中的 条款通 过本标准的引用而成为本标准的条款。凡是注日 期的引用文件， 其随后所有的修改单( 不包括勘误的内容) 或修订版均不适用于本标准， 然而， 鼓励根据本标准达成协议的各方研究是否可使用这些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件， 其最新版本适用于本标准。 G A/ T 1 2 2 -1 9 9 5 毒物分析名词术语术语 和定义G A / T 1 2 2 -1 9 9 5中确立的以及下列术语和定义适用于本标准。静松灵2 - ( 2 , 4 - D i me t h y l p h e n y l a m i d o ) - 4 H - 5 - d ih y d ro一 1 , 3 - t h i a z o l eC H N 2 S =2 0 6 . 3 ， 其他名称: 二甲苯胺唾哇。3 . 2S KF 5 2 5 n 2 - D i e t h y l a mi n o e t h y l - a, a - d i p h e n y l v a l e r a t eC 2 3 Hx 1 N认=3 5 3 . 3 ， 其他名称: 丙基解痉素、 波罗的芬。检材中毒者的呕吐物、 血液、 尿液。中毒尸体的胃及吃剩食物、 胃内容、 尿、 肺、 肝、 肾、 心、 脑、 血液。对怀疑注射人体内者， 还需提供注射部位肌肉、 可疑针剂、 注射器及器皿等。44.14.25气相色谱 法、 气相色谱一 质谱 联用法5 . 1 原理5 . 1 . 1 气相色谱法( G C / N P D ) 原理 本法以S KF s -为内标物， 经提取分离、 净化、 浓缩后， 用具有氮磷检测器( N P D) 的气相色谱仪进行检测; 经与静松灵标准品比较其保留时间或相对保留时间而定性; 与平行操作的随行参比( 已知浓度的静松灵和S K F -A ) 进行比较， 根据峰高比或峰面积值比， 用内标法计算检材中静松灵的含量。5 . 1 . 2 气相色谱一 质谱联用法( G C / MS ) 原理 本法根据静松灵出峰的质谱图而定性; 对静松灵选择质荷比M/ Z 2 0 6的离子峰， 内标物选择质荷比M/ Z 8 6 的离子峰， 与平行操作的随行参比( 已知浓度的静松灵和 S K F -A ) 进行比较， 根据峰高比或峰面积值比， 用内标法计算检材中静松灵的含量。5 . 2试荆5 . 2 . 1 常规试剂 本法所用试剂均为分析纯， 试验用水为蒸馏水。 a )甲醇 ;GA/ T 5 9 7 - 2 0 0 6 b ) 5 mo l / L的氢氧化钠溶液; c ) 0 . 2 5 mo l / L的氢氧化钠溶液; d )丙酮; e ) 6 m o l / L的盐酸; f ) 无水硫酸钠。5 . 2 . 2 静松灵标准溶液5 . 2 . 2 . 1 静松灵储备溶液 准确称取静松灵 1 0 0 . 0 mg ， 用 5 m L丙酮溶解后， 转移到1 0 mL容量瓶中， 添加丙酮到刻度， 混匀，得1 0 . 0 m g / m L 的储备液， 置一1 0 冰箱中保存。 保存期一年。5 . 2 . 2 . 2 静松灵标准使用液 将静松灵储备液用丙酮稀释 1 0 倍， 得 1 . 0 mg / mL的静松灵标准使用液。4 冰箱中保存， 保存期三个月。5 . 2 . 3 内标物标准溶液5 . 2 . 3 . 1 内标物储备溶液 准确称取内标物 S K F , 15 A 1 0 0 . 0 mg ， 用 5 mL丙酮溶解后， 转移到 1 0 mL容量瓶中， 添加丙酮到刻度， 混匀， 得 1 0 . 0 m g / mL的储备液， 置一1 0 冰箱中保存。保存期一年。5 . 23 . 2 内标物标准使用液 将内标物储备液用丙酮稀释 1 0 倍， 得 1 . 0 mg / mL的内标物标准使用液。4 冰箱中保存， 保存期三个 月。5 . 2 . 4 静松灵/ 内标物混合标准溶液 准确吸 取等量静松灵标准使用液和内标物标准使用液混合而成( 静松灵。 . 5 m g / m L ; S K F 5 2 5 A0 . 5 m g / m L ) , 4 冰箱中 保存， 保存期三个月。5 . 3仪器5 . 3 . 1 气相色谱仪 配有氮磷检测器( N P D ) 的气相色谱仪、 色谱数据处理系统。5 . 3 . 2 气相色谱一 质谱联用仪 配有标准 E l 源的四极杆质谱。5 . 3 . 3 G D X - 4 0 3固相柱 使用前用 5 m L甲醇活化， 再用 5 mL水淋洗。5 . 3 . 4 其他仪器 a )离心机 ; b ) 恒温水浴锅; c ) 1 5 mL具塞刻度试管; d ) 电动振荡器; e ) 1 0 p L , 1 0 0 I L 微量注射器。5 . 4 操作方法5 . 4 . 1 定性分析5 . 4 . 1 .1 提取5 . 4 . 1 . 1 . 1 固相萃取法5 . 4 . 1 . 1 . 1 . 1 尿液 1 ml ， 加 3 mL水稀释后， 加内标物标准使用液 1 p L - - - 2 u L ( S K F , , s1 w g -2 p g ) ,加 5 m o l / L的Na OH数滴调 p H值 1 1 -1 2 ， 然后加至经甲醇、 水活化处理过的 G D X - 4 0 3固相柱中， 控制流速为1 m I . / m i n - - 3 m L / m i n 。 过柱， 用5 m l 水清洗柱子， 真空抽干， 用氯仿: 丙酮( 1 : 1 ) 5 m L 洗脱。洗出液在 7 0 水浴上挥发浓缩到。 . 2 mL左右供检。 zGA/ T 5 9 7 - 2 0 0 6 同时取相应的空白检材两份( 各 1 mL ) ， 其中一份添加静松灵/ 内标物混合标准使用液 2 p L -4 p L( S K F s z 1 A 1 p g -2 p g ; 静松灵1 p g -2 p g ) ， 按上述程序平行操作， 进行空白 对照和已知 对照分析。5 . 4 . 1 . 1 . 1 . 2 血液1 m L， 肺、 肝、 肾、 心、 脑、 胃组织或肌肉等检材绞碎后取 1 g ， 添加内标物标准使用液1 p L -2 p L ( 内标物 1 p g -2 p g ) , 6 mo l / L的盐酸 2 mL ， 在 8 0 下水解 1h ， 冷后离心过滤， 滤液用5 mo l / L 和0 . 2 5 m o l / L的N a OH调 p H值 1 1 - 1 2 ， 然后加至经甲醇、 水活化处理过的 G D X - 4 0 3固相柱中， 控制流速为 1 mL / min -3 mI. / mi n 。用5 m L水洗柱子， 真空抽干， 用氯仿 : 丙酮( 1: 1 ) 5 mL洗脱。洗出液在 7 0 水浴上挥发浓缩到 0 . 2 mL左右供检。 同时取相应的空白 检材两份， 其中一份添加静松灵/ 内标物混合标准使用液2 p L -4 p L ( S K F s2 5 A1 p g -2 p g ; 静松灵 1 p g -2 p g ) ， 按上述程序平行操作， 进行空白对照和已知对照分析。5 . 4 . 1 . 1 . 2 液一 液萃取法5 . 4 . 1 . 1 . 2 . 1 尿液、 针剂取1 m L ， 加3 m L水稀释 后， 加内 标物标准 使用液1 p L -2 p L ( S K F , I , A 1 p g -2 p g ) ， 加 5 mo l / L的Na O H数滴碱化调 p H值 1 1 -1 2 ， 加氯仿 5 ml _ 振荡提取 1 0 mi n -1 5 m i n ， 离心1 min -2 mi n ， 吸取氯仿液， 经无水硫酸钠脱水， 于7 0 水浴上挥发浓缩到。 . 2 mL左右供检。 同 时取相应的空白检材两份， 其中 一份添加静松灵/ 内标物混合标准使用液2 p L -4 1, L ( S K F 1 2 1 A1 p g -2 p g ; 静松灵 1 p g -2 p g ) ， 按上述程序平行操作， 进行空白对照和已知对照分析。5 . 4 . 1 . 1 . 2 . 2 血液 1 m工 一 ， 肺、 肝、 肾、 心、 脑、 胃组织或肌肉等检材绞碎后取 1 g ， 添加内标物标准使用液1 p L - 2 p L ( S K F , , , A l p g -2 p g ) , 6 m o l / I 的盐酸2 m L ， 在8 0 下水解 1 h ， 冷后离心过滤， 滤液用5 m o l / L 和0 . 2 5 m o l / L的 N a O H调 p H值 1 1 -1 2 ， 加氯仿 5 m L振荡提取 1 0 m i n -1 5 m i n ， 离心 1 min -2 m i n ， 吸取氯仿液， 经无水硫酸钠脱水， 于 7 0 水浴上挥发浓缩到。 . 2 mI左右供检。 同时取相应的空白 检材两 份， 其中 一份添加静松灵/ 内 标物混合标准使用液2 p L -4 p L ( S K F 5 z 5 A1 p g -2 V g ; 静松灵 1 p g -2 p g ) ， 按上述程序平行操作 ， 进行空白对照和已知对照分析。5 . 4 . 1 . 2 检测5 . 4 . 1 . 2 . 1 分析条件5 . 4 . 1 . 2 . 1 . 1 气相色谱条件 色谱柱: ( 1 ) 0 . 2 m m-0 . 5 m mX2 5 m-3 0 m膜厚 0 . 2 5 p m D B - 1 石英毛细管柱; ( 2 ) 0 . 2 mm-0 . 5 m m X2 5 m-3 0 m膜厚 0 . 2 5 p m D B - 5 石英毛细管柱。 柱温: ( 1 ) 程序升温: 始温 2 0 0 0C， 速率 1 0 0 C / m i n ， 终温 2 8 0 0C( 5 mi n ) ; ( 2 ) 程序升温: 始温 2 2 0 0C， 速率 1 0 0C/ m i n ， 终温 2 8 0 0C ( 5 mi n ) . 检测器 : 氮磷检测器( N P D ) , 检测器温: 3 0 0 0C 。 汽化室温; 2 8 0 0C 载气( N a ) : 流速1 . 9 m L / m i n -2 m l . / m i n e5 . 4 . 1 . 2 . 1 . 2 G C / MS 质谱条件 E l 源电子能量( 7 0 e V) 、 质量扫描范围 1 0 a mu -7 0 0 a mu 、 扫描速度最高 6 0 0 0 a mu / s ; s i m数 3 2 X3 2 ( 通道X离子组) GC - 1 7 A电子式流量控制器( A F C ) 毛细管色谱柱和宽口毛细管柱接口 D B - 5 毛细柱， 3 0 m X 0 . 2 5 mm， 始温 1 0 0 0 C， 速率 2 0 0 C / mi n ， 终温 2 5 0 0 C ( 5 m i n ) ; 检测器温度2 3 0 0C， 近样口温度 2 6 0 0C ; H e 作载气， 流量 1 . 0 m l . / mi n ， 分流比( 3 0: 1 ) 05 . 4 . 1 . 2 . 2 进样 将检材提取浓缩液、 空白对照液和已知对照提取浓缩液 0 . 5 K L -2 I L及静松灵/ 内标物混合标准使用液 。 . 5 p L - v 2 F L， 按上述条件分别注人色谱仪及气质联用仪中， 每个试样进样 3 次。5 . 4 . 1 . 2 . 3 记录和计算 记录各样品中内标物、 静松灵标准品和可疑静松灵的保留时间及峰高和峰面积值， 填人 GC ,G C / MS 内标法定性分析结果表中。计算它们的保留时间平均值， 并以内标物的保留时间为 1 ， 计算静松灵的相对保留时间。计算静松灵的相对回收率。GA/ T 5 9 7 -2 0 0 6 相对回收率( %) 二( 添加后经提取的静松灵/ 内标物的峰高及峰面积比的均值)/( 添加量的静松灵/内标物混合标准液的峰高及峰面积比的均值) X1 0 05 . 4 . 2定f分析5 . 4 . 2 . 1 取样 准确称取或量取各种检材( 呕吐物、 胃内容、 搅碎的肝等脏器组织 1 g ， 尿、 血液、 可疑针剂等 1 mL )两份。按 其中 静松灵含量的多 少， 用 微量注射器准确加人内 标物 标准 使用液2 p L - - 2 0 p L ( S K F , z s A 2 p g -2 0 V g ) , 混匀。 另取相应的空白检 材两份， 用微量注 射器准确加人静松灵/ 内 标物混合标准使用液4 p L -4 0 p L( 静松灵2 p g -2 0 p g 9 S K F s z s n 2 p g -2 0 p g ) ， 混匀。5 . 4 . 2 . 2提取 根据不同检材的特点， 分别选用5 . 4 . 1 . 1 . 1 利 5 . 4 . 1 . 1 . 2 项中所述方法进行操作。5 . 4 . 2 . 3测定 按 5 . 4 . 1 . 2 项中所述操作进行。5 . 4 . 2 . 4 记录与计算5 . 4 . 2 . 4 . 1 记录检材及空白添加标准品中静松灵及内标物峰高或峰面积值 填人 G C定量分析记录表中， 并计算出检材中静松灵及内标物的平均峰高或峰面积。5 . 4 . 2 . 4 . 2 计算相对校正因子 了 = 添加于空白检材中静松灵进样量( 拜 9 ) x内标物峰高或峰面积平均值 /添加于空白检材中内标物进样量( p g ) X 静松灵峰 高或峰面积平均值5 . 4 . 2 . 4 . 3 计算检材中静松灵含f W( m g / 1 0 0 g 或 1 0 0 mL ) W= f x检 材中静松灵峰高或峰面积平均值X内 标物添加量( p g ) X 1 0 0 / 检材中内标物峰高或峰面积平均值X 检材量( 9 或m L ) X 1 0 0 5 . 4 . 2 . 4 . 4 计算相对相差 相对相差( %) =( I A-BI X2 ) / ( A+B ) X1 0 0 式中: A, B为两份检材平行定量测定的数值。5 . 5 结果评价5 . 5 . 1 定性结果评价5 . 5 . 1 . 1 气相色谱法( C G) 法、 气质联用法( C G / MS ) 在生物检材中的检出限分别为 5 n g / g ( mL ) 及0 . 2 p g / g ( m L ) ， 静 松灵及其内 标物的 气相色 谱保留值及检出极限见表1 。 如果添加于空白检材中的静松灵相对回收率在 6 0 %以上， 检材未出现相应的静松灵色谱峰， 可以认为检材中不含静松灵， 阴性结果可靠。如果静松灵的 相对回收率在6 0 %以下， 检材未出现相应静松灵色谱峰， 原操作有误， 阴性结果不可靠， 应重新检验 表 1 静松 灵及 其内标物的气相色谱保 留值及检 出极 限GA/ T 5 9 7 -2 0 0 65 . 5 . 1 . 2 气相色谱法( G O 法中如果空白检材经提取后， 未出现静松灵色谱峰， 而检材有相应色谱峰时， 说明空白检材无干扰， 阳性结果说明可能有静松灵; 如果空白检材中出现有静松灵相应的色谱峰， 空白有干扰， 即便检材有相应色谱峰， 结果也不可靠， 应用其他方法验证， 经选择不同色谱条件( 两种以上不同极性色谱柱) ， 均出现静松灵相应色谱峰时， 方可认定静松灵及内标物的G C分析图谱见图1 ,( s 1 0 0 0 0 0 0 峰1 睁松灵2 . 8 9 5 m i n ;峰2内标物( S K F s z s n ) 4 . 6 2 0 7 m in 图 1 静松灵及内标物( S K F 5 2 5 , ) 的 G C分析图谱5 . 5 . 1 . 3 G C / MS联用技术可用来确证生物检材中的静松灵。静松灵的质谱图见图2 ， 静松灵的特征离子: m / z 1 4 6 , m / z 1 5 9 , m/ z 1 9 1 , m/ z 2 0 6 ， 峰度 比为 2 / 1 / 1 . 2 / 4 。采用选择离子检测方式可提高其灵敏度 。 2爪 二 - - - - -13F-103 1I, II .二 146_ 159I L二 1781 三 干 二 二) 6 图 2静松灵的 GC / MS分析 图谱5 . 5 . 2 定f结果评价 两份检材的相对误差若不超过 1 0 %， 结果按两份检材含量的平均值计算。相对误差若超过 1 0 %,需要重新进行测定。6 薄层色谱法6 . 1 原理 检材中的静松灵经提取、 净化、 浓缩后 ， 与添加提取的静松灵标准品， 在同一薄层板上点样、 展开， 静松灵与显色剂作用而显现斑点。通过比较两者的R, 值及显色情况， 进行定性分析6 . 2试剂6 . 2 . 1 常规试剂 a ) 硅胶G或硅胶G F 2 1 ; b ) 其他试剂同5 . 2 . 1 .G A/ T 5 9 7 -2 0 0 66 . 2 . 2展开荆 a ) 氯仿 环己 烷 ， 丙酮( 4 0 ， 4 0 : 2 0 ) ; b ) 环己烷 : 丙酮( 4 0: 1 0 ) ; c ) 苯 ， 二氧六环 ， 乙醇 ， 浓氨水( 5 0， 4 0， 1 0， 1 ) ,62 . 3 改良碘化秘钾显色荆 次硝酸秘 2 0 0 mg , 碘化钾 5 g , 碘 2 g 、 浓盐酸 1 mL 、 冰醋酸 I mL同于5 0 0 m L烧杯中搅拌， 混匀后加水至2 5 0 mL再混匀。6 . 3仪器 a ) 电动振荡器; b ) 离心机; c ) 恒温水浴锅; d ) 0 . 2 5 m. -0 . 3 mm高效硅胶 G薄层板; e ) 层析缸 ; f ) 喷雾器6 . 4 操作方法6 . 4 . 1 提取 针剂、 呕吐物、 胃内 容、 尿等检材， 取0 . 5 g ( m L ) -