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解螺旋 陪伴医生科研成长 1 稳转细胞株稳转细胞株 1.1. 实验原理实验原理 研究某个基因的功能最常用的手段是在宿主细胞中过表达或者沉默该基因， 建立细胞模 型。根据所用方法和目的，可以分为稳转细胞株和瞬转细胞株。稳转细胞即所做的基因编辑 不会由于长时间培养或传代而丢失。 目前常用的建立稳转细胞株的方法是用携带了基因编辑 功能的慢病毒感染细胞，再用抗性进行筛选。 慢病毒几乎可以感染所有种类的细胞，并且在感染后可以整合到受感染细胞的基因组， 进行长时间的稳定表达。 利用慢病毒的特性， 将外源 DNA 克隆到具有某种抗性的慢病毒载体 中并感染宿主细胞， 利用载体中所含的抗性标志进行筛选， 可得到稳定表达或沉默特定基因 的细胞株。解螺旋 2.2. 实验目的实验目的 建立稳转细胞株 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂 带有抗性筛选标签（如 puromycin）的慢病毒（可根据目的选择，过表达基因/沉默基因 /突变基因/敲除基因等） 、Opti-MEM 培养基、Polybrene、胰蛋白酶等 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 生物安全柜、二氧化碳培养箱、离心机、显微镜 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 4.4. 实验步骤实验步骤 4.1.4.1. 慢病毒感染慢病毒感染 1. 将处于对数期细胞用 0.25%胰酶消化 ， 1500rpm 离心 3min 去上清， 用培养基悬浮起 来，制成细胞悬液。 2. 将血球技术板洗净擦干，吸取 7.5L 细胞悬液，沿盖玻片一边缓慢加入细胞悬液，进 行细胞计数。 3. 调整细胞密度，接种于 6 孔板中。待细胞贴壁后，轻轻吸去培养基，小心加入 1ml 含 5 g/ml Polybrene 的 Opti-MEM 培养基，再加入计算出的病毒量（病毒所需体积=细胞 MOI*种板量/病毒滴度） ，轻轻混匀后放入细胞培养箱培养。 4. 培养 8h 后，吸去上清，加入新鲜培养基，继续放回培养箱中，培养 96h。 5. 若慢病毒带有荧光，可在荧光显微镜下观察荧光效率，由此初步判断感染效率。也可收 取部分细胞，qPCR或Western blot检测一下基因标记的效率。 4.2.4.2. 抗性标签筛选抗性标签筛选 1. 往感染好慢病毒的细胞中加入抗生素（如 puromycin） ，抗生素的浓度需事先经预实验 确认（细胞最佳的抗性筛选浓度） 。解螺旋 2. 培养一段时间后（一般 24-48h，可通过预实验确认）后，可显微镜下查看，是否剩下 的细胞都有荧光。 3. 取部分细胞，qPCR 或 Western blot 检测一下基因标记的效率。 4. 如果对稳转株纯度比较高（基因编辑效率 100%） ，可以进行单克隆筛选。 6.6. 应用应用示例文献示例文献 1,21,2 1. Shi X, Ran L, Liu Y, et al. Knockdown of hnRNP A2/B1 inhibits cell proliferation, invasion and cell cycle triggering apoptosis in cervical cancer via PI3K/AKT signaling pathway. Oncol Rep 2018; 3939(3): 939-50. 2. Wang S, Ning Y, Wei P, et al. The non-coding RNA OTUB1-isoform2 promotes ovarian 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 tumour progres