荧光共振能量转移（FRET）.pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 1 荧光荧光共振共振能量能量转移转移(fluorescence resonance energy (fluorescence resonance energy transfertransfer，FRETFRET) ) 1 1实验实验原理原理 荧光共振能量转移技术， 是采用物理方法去检测分子间的相互作用的方法， 适用于在细 胞正常的生理条件下，验证已知分子间是否存在相互作用。 荧光共振能量转移是指两个荧光发色基团在足够靠近时， 当供体分子吸收一定频率的光 子后被激发到更高的电子能态，在该电子回到基态前，通过偶极子相互作用，实现了能量向 邻近的受体分子转移（即发生能量共振转移） 。 应用原理： 将要检测的蛋白 （如图 X 和 Y） ， 分别偶联上 ECFP 和 EGFP 荧光蛋白， ECFP 和 EGFP 是一对荧光物质，我们称之为供体（donor）和受体（acceptor） 。当用 433nm 的紫 光去激发 X 融合蛋白时，它能够产生 475nm 的青色荧光；同样，当我们用 475nm 的蓝光 去激发 Y 融合蛋白时，它能够产生 507nm 的绿色荧光。 当蛋白 X 和 Y 间没有相互作用时（两者的空间距离10nm） ，融合蛋白 X 和 Y 分别产 生相应的荧光而被检测到，如果蛋白 X 和 Y 间存在相互作用（两者的空间距离需10nm） ， 用紫光激发融合蛋白 X 其产生的青光会被融合蛋白 Y 吸收，从而产生绿色荧光，这时，在 细胞内将检测不到青色荧光的存在。 这时因为能量从 X 融合蛋白转移到了 Y 融合蛋白， 这 就是荧光共振能量转移技术。解螺旋 较为常用的供体-受体分子对，主要有绿色荧光蛋白类（GFPs）和染料类。绿色荧光蛋 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 白类有CFP-YFP，BFP-GFP，BFP-YFP 等，染料类的有 Cy3-Cy5，FITC-Rhodamine 等。 将供体-受体分子对分别标记在不同的分子上， 可以研究蛋白-蛋白、 RNA-RNA、 蛋白-RNA、 蛋白-DNA、DNA-DNA 等相互作用，本文以蛋白-蛋白相互作用为例。 2 2. .实验实验目的目的 活细胞内检测蛋白 A 和蛋白 B 的相互作用； 3 3. .实验材料实验材料 3 3.1.1 主要试剂主要试剂 CFP-A 基因和 YFP-B 基因质粒等。 3 3.2.2 主要试剂主要试剂 多光子共聚焦显微镜等。解螺旋 4 4. .实验实验步骤步骤 1. 实验所用细胞的培养； 2. 细胞转染质粒： 构建质粒载体 CFP-A 和 YFP-B， 将 A、 B 蛋白分别偶联上荧光蛋白 CFP 和 YFP，并将两个质粒共转染到培养的细胞内； 3. 多光子共聚焦显微镜和 FRET 观察； 1) FRET 检测时间：质粒共转染细胞后 12h、18h、24h、36h、48h、72h ，检测是否 发生 FRET； 2) FRET 图像采集： 确定 FRET 配对的激发波长， 蓝宝石激光被调谐分别用于探测最大 和最小的供体和受体信号， 最大供体信号和最小受体信号对应的波长用于收集双表 达细胞的 FRET 信号； 4. 标定 CFP（供体）和 YFP（受体） ，调整激光变化，以便获取最大 CFP 信号和最小 YFP 信号的激发光波长，以此激发（CFP-YFP）双表达细胞，选择合适的滤镜组合和高灵敏 的 PMT，采集供体和受体图像，收集 FRET 信号，调整供体激光强度，固定用于激发供 体，对受体激发波长也类似要求，注意调整能量，使用合适的中性密度滤光片，避免光 漂白。每个细胞 FRET 检测重复 3 次，每种转染至少完成 6 个细胞的 FRET 检测； 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 5. FRET 数据处理：去除 FRET 信号 DSBT 和 ASBT 的光谱串色信号；受体通路的 FRET 信号 需要对供体受体光谱灵敏度的变化进行矫正、 对自发荧光和光学噪声进行矫正； 利用矫 正系数对双标定细胞进行象素匹配矫正。解螺旋 5 5. .典型文献典型文献 1,21,2 1. Kopp MC, Nowak PR, Larburu N, Adams CJ, Ali MM. In vitro FRET analysis of IRE1 and BiP association and dissociation upon endoplasmic reticulum stress. Elife 2018; 7 7. 2. Dolde C, Bischof J, Gruter S, et al. A CK1 F