外泌体（示踪）.pdf

解螺旋 陪伴医生科研成长 1 外泌体（外泌体（示踪示踪） 外泌体具有典型的脂质双分子层结构； 参与细胞之间的交流， 物质的运输以及正常生理 过程的维持。 对分离的外泌体进行体外标记或活体示踪， 有助于对外泌体的功能进行进一步 的研究。目前对于外泌体的标记方法有很多种，包括亲脂性的染料和膜渗透型的化合物等。 一、一、亲脂性染料亲脂性染料 1.1. 实验原理实验原理 染料可以稳定的与细胞膜脂质区结合并发出荧光， 主要用于细胞体外标记、 体外细胞增 殖研究以及体内外的细胞失踪研究。PKH67（green）的体内荧光半衰期为 10-12 天。相比于 PKH-67，PKH-26（red）具有更长的半衰期，标记在兔红细胞上的 PKH26 半衰期长达 100 天 以上。特别适用于体外增殖研究以及长期的体内细胞跟踪研究。 2.2. 实验目的实验目的 标记外泌体。解螺旋 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂 PKH-67/PKH-26 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 电子显微镜 4.4. 实验步骤实验步骤 使用 PKH67 绿色荧光标记试剂盒（Sigma-Aldrich，MINI67）标记外泌体；将标记的外 泌体与受体细胞 37共温育 12 小时；将受体细胞固定并成像。 二、二、亲脂性羰花青染料亲脂性羰花青染料 1.1. 实验原理实验原理 DiI, DiO, DiD, DiR 是一系列亲脂性的荧光染料，可以用来染细胞膜和其它脂溶性生 解螺旋 陪伴医生科研成长 2 物结构。 这些环境敏感性荧光染料在进入细胞膜之前荧光非常弱， 当与细胞膜结合后其荧光 强度大大增强。 且具有消光系数高、 极性依赖性、 激发态寿命短等特点。 一旦进入细胞膜后， 可在整个细胞膜上扩散，最佳浓度时可以使整个细胞膜染色。 2.2. 实验目的实验目的 标记外泌体。 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂 DiI/DiO/DiD/DiR 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 电子显微镜 4.4. 实验步骤实验步骤 外泌体用红色荧光亲脂性染料 DiI， 允许监测外来体运动。 当被绿光激发并掺入膜中时， DiI 发出强荧光，并且不会破坏膜的性质。 将外泌体重悬浮于无菌 PBS 中，并与 5M DiI 孵 育 10 分钟。然后洗涤 DiI-外泌体并在无菌 PBS 中重悬浮三次以除去游离的 DiI 和其他杂质 （如脂蛋白） 。解螺旋 三、三、渗透型的化合物标记法渗透型的化合物标记法 1.1. 实验原理实验原理 羧基荧光素二醋酸盐琥珀酰亚胺酯，常称为 CFSE，可被动扩散进入细胞。这种试剂没 有颜色和荧光， 直至细胞内的酯酶去除其醋酸盐基团， 产生能发出明亮荧光的羧基荧光素琥 珀酰亚胺酯。 琥珀酰亚胺酯与细胞内氨基反应， 形成稳定且能用醛固定剂固定的荧光偶联物。 在传统的 Calcein （钙黄绿素） 基础上引入乙酰甲氧基甲酯 （AM） 基团， 增加了疏水性， 使其能够轻易穿透活细胞膜。一旦进入细胞后，Calcein-AM（本身不发荧光）被细胞内的酯 酶剪切形成膜非渗透性的极性分子 Calcein，从而被滞留在细胞内并发出强绿色荧光。 2.2. 实验目的实验目的 标记外泌体。 解螺旋 陪伴医生科研成长 3 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂 CFSE/Calcein-AM 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 显微镜、流式细胞仪 4.4. 实验步骤实验步骤 将 Calcein-AM（Life Technologies, C3100MP）溶解于 DMSO 并将该储备溶液在过滤的 PBS 中稀释至终浓度为 10mM。 将细胞外囊泡沉淀重悬于 100mLCalcein-AM 溶液中， 并在 37 下孵育 20 分钟以允许囊泡内酯酶活性使 Calcein-AM 荧光。标记的细胞外囊泡悬浮液用 200mL PBS 稀释，然后通过流式细胞术（Becton Dickinson，LSRII）进行数据采集。FSC / SSC 点图将门控事件（细胞外囊泡候选者）与尺寸校准珠（Bangs Laboratories，Inc.，832 和 833）进行比较。然后在未染色的细胞外囊泡候选物的背景自发荧光之上选择门控事件用 于荧光。使用 20mM 孵育与 10mMCalcein-AM 作为达到不同细胞外囊泡的最大荧光的标准条 件。然后将过滤的 PBS（200mL）加入悬浮的荧光细胞外囊泡（300mL 终体积）中，然后通过 流式细胞术分析。 为了确认荧光是由于囊内钙黄绿素与游离钙黄绿素相比， 标记的细胞外囊 泡用 PBS 进行多次洗涤。 洗涤后荧光光谱没有明显变化， 表明荧光不是由于游离活化的钙黄 绿素引起的，这可能导致非囊泡事件的错误检测。事实上，洗涤细胞外囊泡引起显着的事件 损失，因此洗涤循环的次数不宜过多，并且在流式细胞术处理之前直接用 Calcein-AM 标记 细胞外囊泡。解螺旋 四四、利用外泌体表面的巯基对外泌体进行标记利用外泌体表面的巯基对外泌体进行标记 1.1. 实验原理实验原理 Alexa 系列染料通过化学合成方法在香豆素、氧杂蒽(如荧光素和罗丹明)、青色素等染 料中引入磺酸酯基团，使得 Alexa 染料呈负电性和亲水性，让 Alexa 具有更好的光学稳定 性、发光强度以及 pH 的适应性。有研究则发现 Alexa 染料的染色亮度的光稳定性更好。 2.2. 实验目的实验目的 标记外泌体。 解螺旋 陪伴医生科研成长 4 3.3. 实验实验材料材料 3.1.3.1. 主要试剂主要试剂 C5-maleimide-Alexa 488/C5-maleimide-Alexa 633 3.2.3.2. 主要仪器主要仪器 荧光显微镜 4.4. 实验步骤实验步骤 用 Alexa488/633 标记细胞外囊泡 将 C5-maleimide-Alexa 488/C5-maleimide-Alexa 633（200g/ml-2.5l）加入到含 有 60-100g 蛋白质的 30l 细胞外囊泡等分试样中，并在孵育前用 PBS 补足至 50l，不 搅拌，在室温黑暗环境中放置 60 分钟。在孵育期间，根据说明书制备外来体旋转柱 （Invitrogen） ，并将粉末树脂在室温下水合 15-30 分钟。将置于收集管中的旋转柱在摆动 转子中离心 2 分钟（750g） 。在将标记的细胞外囊泡等分试样添加到树脂中之前丢弃收集 管。将柱置于 1.5ml eppendorf 管中并离心 3 分钟（750g）以收集标记的细胞外囊泡。通 过树脂保留未掺入的过量染料， 并且平行进行涉及染料但没有细胞外囊泡的对照以确认柱的 染料保留。 对于显微镜分析， 将标记的细胞外囊泡 （称为细胞外囊泡 488 或细胞外囊泡 633） 轻轻混合至 1000l 无酚红的 DMEM 中，然后通过 0.22m 过滤器（Millex）过滤，等分并 储存在-80直至需要。解螺旋 用葡聚糖-Alexa647 标记溶酶体 在葡聚糖孵育当天将细胞接种为 50-60汇合。 将 Dextran647（Dx647,100g/ ml） 与细胞一起温育 2 小时（5CO 2,37） ，然后用 PBS 洗涤并重新添加完整的细胞培养基。 然后将细胞孵育 18 小时（5CO 2,37） ，然后与 50-60g/ ml EV488 一起孵育用于共定 位分析。 五、五、射线标记射线标记 1.1. 实验原理实验原理 99mTc-HMPAO 被称为不带电和高度亲脂性的放射性示踪剂，其已被广泛用于细胞标记。 细胞内谷胱甘肽将 99mTc-HMPAO 转化为亲水形式以被捕获在细胞内。 基于这一特性， 99mTc- 解螺旋 陪伴医生科研成长 5 HMPAO 已被临床用于炎症成像的白细胞（WBC）标记。由于 99mTc-HMPAO 在临床环境中是易 于接近的放射性示踪剂。解螺旋 2.2. 实验目实验目的的 标记外泌体。 3.3. 实验实验材料材料 99mTc-HMPAO 试剂盒 4.4. 实验步骤实验步骤 将含有 0.5mg HMPAO 和 4.0gSnCl2 的小瓶用 1110MBq 的 99mTcO4 在 5mL 0.9NaCl 溶液中重构，并摇动 10 秒。 孵育 5 分钟后，立即将 99mTc-HMPAO 加入到制备的细胞外囊泡 中。在室温下将细胞外囊泡（100g/100l）与制备的 185-370MBq 的 99mTc-HMPAO 温育 1 小时。在孵育期间，将管缓慢摇动直至标记结束。 六、典型文献六、典型文献 1 1 2 2 3 3 4 4 5 5 6 6 1. Hwang DW, Choi H, Jang SC, et al. Noninvasive imaging of radiolabeled exosome- mimetic nanovesicle using (99m)Tc-HMPAO. Sci Rep 2015; 5 5: 15636. 2. Gray WD, Mitchell AJ, Searles CD. An accurate, precise method for general labeling of extracellular vesicles. MethodsX 2015; 2 2: 360-7. 3. van der Vlist EJ, Nolte-t Hoen EN, Stoorvogel W, Arkesteijn GJ, Wauben MH. Fluorescent labeling of nano-sized vesicles released by cells and subsequent quantitative and qualitative analysis by high-resolution flow cytometry. Nat Protoc 2012; 7 7(7): 1311-26. 4. Zheng T, Pu J, Chen Y, et al. Plasma Exosomes Spread and Cluster Around beta- Amyloid Plaques in an Animal Model of Alzheimers Disease. Front Aging Neurosci 2017; 9 9: 12. 5. Roberts-Dalton HD, Cocks A, Falcon-Perez JM, et al. Fluorescence labelling of extracellular vesicles using a novel thiol-based strategy for quantitative ana