南京医科大学博导论坛-细胞与分子实验-周建伟.ppt

基因的结构和功能关系 理论与实践,周建伟 drjwzhou,认识基因的结构和功能 理论基础,真核和原核细胞的基因转录与翻译,值得纪念的里程碑，人类首次解密自身的基因密码,科学家对DNA含义的理解,科学家对DNA含义的理解,科学家对DNA含义的理解,科学家对DNA含义的理解,蛋白质的相互作用,HGP的完成为探索基因功能打下了坚实的基础,机体易感性对环境因素致癌的影响,基因表型联系的复杂性,/sci/techresources/Human_Genome/home.shtml,JWA基因的结构和功能关系研究：实践探索,建立诱导细胞分化模型，克隆调节细胞分化的关键基因，解析基因结构功能关系，发展基于机制研究的基因干预手段,科研思路,恶性肿瘤是危害人类健康最主要的疾病 之一，大多数恶性肿瘤是由环境因素和 基因交互作用所致 恶性肿瘤的生物学特征包括无限增殖、 分化和凋亡障碍、浸润以及转移,肿瘤转移是恶性肿瘤威胁生命的最主要原因 细胞迁移是肿瘤浸润和转移的必备条件 对肿瘤细胞迁移及其调控机制的研究已成为肿瘤预防和治疗领域的热点 Ridley A J., et al. Science. 2003; 302(5651):1704-1709 Condeelis and Pollard. Cell. 2006; 124: 263-266,细胞的各种生物学行为是由细胞内相应分子按信号通路执行完成的 丝裂原活化的蛋白激酶 （MAPK）信号通路是细胞内最主要的信号通路之一，可介导多种细胞生物学行为 在细胞迁移过程中, MAPK信号通路起重要调节作用 Raftopoulou M. Nature Cell Biology. 2006; 8, 654 Huang C, et al. Jorunal of Cell Scicence. 2004; 117(20): 4619-4628 Hashiramoto A. et al. Oncogene. 2006; 25, 39483955,MAPK Signal Pathway,细胞信号转导的一般规律,JWA基因,由我本人1997年发现和克隆，1998年获GenBank新基因号：AF070523 2002年HUGO把JWA正式命名为ARL6IP5；GenBank中的其它别名：GTRAP3-18; PRAF3; jmx等 JWA在人染色体定位是3p14; cDNA全长为2.1kb, 其编码蛋白定位于细胞浆，含188个氨基酸 JWA在生物进化中保守,课题组登录在GenBank的人和大鼠JWA基因序列,HUGO正式批准JWA及其同源基因的基因名为ARL6IP5,JWA基因的染色体定位,人类3号染色体的基因构成和特点,人、小鼠、大鼠 JWA基因染色体定位对应关系,JWA同源基因DNA和蛋白质相似性,人黑猩猩犬小鼠大鼠鸡斑马鱼果蝇蚊线虫,LOCUS AAC64360 188 aa DEFINITION JWA protein Homo sapiens. AUTHORS Zhou,J.W., Di,Y.P. and Wu,R. TITLE A novel differentially displayed vitamin A responsive gene that is cytoskeleton related JOURNAL Submitted (02-JUN-1998) Internal Medicine, UC at Davis, Rm 1121, Surge I, CCRBM, UC Davis, Davis, CA 95616, USA,MDVNIAPLRAWDDFFPGSDRFARPDFRDISKWNNRVVSNLLYYQTNYLVV 50 AAMMISIVGFLSPFNMILGGIVVVLVFTGFVWAAHNKDVLRRMKKRYPTT 100 FVMVVMLASYFLISMFGGVMVFVFGITFPLLLMFIHASLRLRNLKNKLEN 150 KMEGIGLKRTPMGIVLDALEQQEEGINRLTDYISKVKE 188 Open Reading Frame(ORF) of JWA PKC phosphorylation sites: SDR, SLR Three transmembrane domains,氨基端在膜外侧，羧基端在膜内侧； 第一个跨膜区为一级螺旋结构，第二和第三个跨膜区为二级螺旋结构；两个PKC磷酸化位点分别在膜两侧；第一个跨膜区为一级螺旋结构，第二和第三两个跨膜区为二级螺旋结构。,JWA蛋白磷酸化基序预测,97年以来，课题组对JWA基因结构功能关系研究取得一系列创新性成果,围绕JWA应答环境理化因素（H2O2、热休克、UV）， 着重研究： JWA应答细胞氧化应激 调节DNA碱基切除修复（BER） 调节细胞凋亡的作用和机制 围绕JWA是细胞骨架相关蛋白，调节多种细胞分化，着重研究： JWA调节细胞迁移/细胞恶性转化调节细胞粘附、浸润 体内肿瘤转移的作用和机制,JWA基因与细胞凋亡,JWA 表达是As2O3通过活性氧-线粒体信号通路诱导肿瘤细胞凋亡的必需分子,As2O3 诱导 HeLa 和 MCF-7 细胞凋亡与JWA表达相平行,HeLa Cell,MCF-7 Cell,JWA 表达是As2O3抗增殖和促凋亡作用的必需条件,HeLa Cell,MCF-7 Cell,下调JWA表达 阻止 As2O3诱导肿瘤细胞凋亡的作用 依赖于 caspase-9表达,下调JWA表达抑制As2O3 对线粒体膜电位的影响,C1-HeLa,As-HeLa,As2O3 产生的ROS诱导JWA表达,JWA激活MEKERK1/2 和JNK分子的磷酸化,JWA与肿瘤细胞凋亡小 结,As2O3 产生的H2O2通过诱导JWA表达触发一系列信号转导机制诱导HeLa和MCF-7细胞凋亡 JWA为As2O3诱导活化MEKERK和JNK所必需，进一步影响线粒体膜电位并激活 casepase-9，从而在As2O3诱导细胞凋亡中发挥中心作用 As2O3诱导 Bad活化与细胞凋亡有关，也受JWA调节，但与MEKERK/JNK机制无关,Zhou J., et al. Toxicol Appl Pharmacol, 2008, 230: 33-40,JWA应答氧化应激的分子机制,问题的提出,JWA应答细胞的氧化应激？是否应答？如何应答？,SOD:,catalase:,O-2.,O-2.,H2O2,H2O2,细胞中活性氧代谢规律,氧化应激作用于细胞的过程和转归,JWA参与B(a)P 诱导细胞DNA损伤与修复,损伤,修复,B(a)P代谢产物暴露使细胞形成8-OH-dG,H2O2所致细胞DNA损伤和8-OH-dG的形成,胞内H2O2自由基诱导JWA的表达,H2O2处理后细胞内O-2.和H2O2变化 (活性氧染色实验),B(a)P处理后细胞内O-2.和H2O2变化 (活性氧染色实验),筛选转录活性最强的 启动子区域 (报告基因模型),relative luciferase activity,核因子与 转录活性最强的 启动子区域结合 (凝胶阻滞实验),证实该核因子的分子量为47kD (Southwestern 实验),H2O2和B(a)P共同激活的转录因子,证实该核因子可能为NF1(1) (Western blot 实验),核因子为NF1 (2) (Supershift 实验),E,F,进一步证实该核因子为NF1 (3) (免疫沉淀实验),干涉NF1可有效阻断H2O2和B(a)P诱导的JWA转录活性(1),G,relative luciferase activity,干涉NF1后阻断了H2O2和B(a)P诱导的JWA表达(2) (RNAi实验),-94/-90,-53/-49,CCAAT box,CCAAT box,-107,-28,CBF ,NF1 ,CEBP ,GATA-1 ,?,?,JWA启动子区有两个NF1结合元件,A,制备CCAAT 变异探针用于检测其与NF1结合,NF1与第二个CCAAT元件结合(1) (Southwestern 实验),C,NF1与第二个CCAAT 元件结合(2) (凝胶阻滞实验),NF1与第二个CCAAT元件结合(3) (定点突变实验),B,JWA保护氧化应激引起的DNA损伤,损伤,修复,JWA通过调节BER信号通路参与DNA修复,JWA应答氧化应激-小结,JWA应答氧化应激 氧化应激产生的H2O2通过NF1与JWA启动子区CCAAT元件结合后激活JWA表达 JWA进一步通过BER信号通路促进DNA修复,Chen R., et al. Free Radic Biol Med, 2007,42:1704,作为细胞氧化应激条件下的应答基因，JWA如何保护细胞拮抗氧化损伤？ 作为还原性蛋白直接中和细胞内活性氧？ 作为DNA修复蛋白修复DNA损伤？,进一步的问题,JWA作为还原性蛋白直接中和 细胞内活性氧？,JWA缺陷细胞在氧化应激条件下细胞内活性氧含量增加？使细胞回复表达JWA后细胞内活性氧含量减少？,实验结果：细胞内JWA表达水平不影响活性氧含量JWA可能不是直接的还原性蛋白 JWA作为DNA修复蛋白修复DNA损伤？,实验模型,H2O2：Hydrogen Peroxide, 过氧化氢 MMS: methyl methanesulfonate, 甲磺酸甲酯,JWA参与氧化应激诱导的DNA损伤修复,宿主细胞活性实验,细胞中JWA的表达增强DNA损伤修复能力,JWA低表达的细胞对氧化剂造成的损伤更加敏感,MTT实验,JWA低表达的细胞表现出氧化损伤更加严重,检测细胞中NAD(P)H水平,免疫共沉淀,A,B,JWA作为BER复合物中新的修复分子,C,D,JWA调节XRCC1和Lig III的表达而不影响APE1的表达,A,B,C,氧化损伤引起JWA的核移位,D,E,敲减JWA抑制XRCC1进核,氧化损伤诱导JWA浆核易位,F,XRCC1对JWA的浆核易位起重要的作用,A,B,B1,2,H2O2 通过E2F1调节XRCC1转录,JWA影响H2O2 对XRCC1的转录调节,D,C,Probe：5-TAA TTT TTT TCG CGC GTG CGC GCG CGC GTA-3 biotin Competitor Probe： 5-TAA TTT TTT TCG CGC GTG CGC GCG CGC GTA-3,JWA通过E2F1调节XRCC1的转录水平,Mutated Competitor Probe：5-TAA TTT TCG AGC TGC GTA GAC TCA CGC GTA-3,B,JWA通过调节MAPK信号通路影响E2F1的表达,A,JWA维持XRCC1的蛋白稳定,敲减JWA加速泛素化酶对XRCC1的降解,JWA抑制XRCC1通过泛素-蛋白酶体途径降解,G,JWA表达不受泛素化影响,JWA与DNA碱基切除修复小结,氧化应激激活的JWA通过MAPK-E2F1转录调节XRCC1及其下游分子表达，启动细胞应答氧化应激机制 JWA与XRCC1相互调节核内表达量，协调DNA氧化损伤后的BER修复过程 JWA通过泛素化途径调控核内XRCC1的表达量,JWA应答氧化应激调节BER信号通路的机制,Wang SY, et al. Nucleic Acids Res. 2009, 37(6):1936-1950,进一步的问题,细胞JWA表达水平是否影响其抵抗环境因素的损伤作用？ 细胞JWA表达水平与肿瘤易感性关系？ JWA与XRCC1的相互调节关系与肿瘤发生发展？,JWA基因-76GC多态性增加胃癌和食管癌易感性,Tang WY, JTEH, 2007,JWA基因的SNPs与肿瘤易感性有关,JWA和XRCC1用于预测胃癌患者术后预后以及指导个体化治疗,2019/11/16,111,JWA基因在人胃癌和癌旁组织中的表达,2019/11/16,112,胃癌组织中JWA和/或XRCC1表达与预后关系,2019/11/16,113,胃癌组织中JWA或XRCC1表达对化疗效果的影响,2019/11/16,114,配对癌旁组织中JWA/XRCC1表达与预后关系,TNM I-II 期单纯手术胃癌患者术后生存,TNM III-IV 期单纯手术胃癌患者术后生存,DNA修复蛋白XRCC1是调节胃癌铂类耐药重要分子,伊立替康通过TXNL1调节XRCC1，逆转胃癌铂类耐药,正常细胞：JWA 高 XRCC1高 及时修复DNA损伤,胃癌细胞：JWA 低 XRCC1 低 基因组不稳定,铂类耐药患者胃癌细胞：JWA低 XRCC1高 失调的DNA修复能力、抗凋亡能力,基因-环境交互作用,铂类药物耐药产生,JWA调节XRCC1修复DNA损伤,科学问题：胃癌细胞耐药的产生是DNA修复和凋亡平衡紊乱所致？,JWA-XRCC1水平影响胃癌细胞顺铂耐药,顺铂敏感的胃癌细胞 顺铂耐药的胃癌细胞,JWA XRCC1,JWA XRCC1 ,JWA reverses cisplatin resistance via the CK2XRCC1 pathway in human gastric cancer cells unpublished,JWA与癌症小结,是ROS应答基因