SN∕T 5116-2019 进出口食用动物、饲料孔雀石绿、结晶紫测定 液相色谱-质谱∕质谱法

书 书 书 犐 犆犛 犅 ? 犛犖犜 ?、?、 ? ? 犇犲 狋 犲 狉犿 犻 狀 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犿犪 犾 犪 犮 犺 犻 狋 犲犵 狉 犲 犲 狀犪 狀 犱犮 狉 狔 狊 狋 犪 犾狏 犻 狅 犾 犲 狋狉 犲 狊 犻 犱 狌 犲 狊犻 狀犲 犱 犻 犫 犾 犲犪 犻 狀犿犪 犾 狊 犪 狀 犱犳 犲 犲 犱 狊犳 狅 狉犻 犿狆 狅 狉 狋犪 狀 犱犲 狓 狆 狅 狉 狋 犔犆 犕犛犕犛犿狋 犺 狅 犱 ? ? ? ? 书 书 书 前 言 本标准按照 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国上海海关、中华人民共和国南京海关、中华人民共和国北京海关。 本标准主要起草人：赵善贞、张晓燕、崔凤云、霍忆慧、姜珊、李静静、程甲、宋蓉蓉、伊雄海、邓晓军、 郭德华。 犛犖犜 进出口食用动物、饲料孔雀石绿、 结晶紫测定 液相色谱质谱质谱法 范围 本标准规定了进出口食用动物和饲料中孔雀石绿、结晶紫及其代谢物隐色孔雀石绿、隐色结晶紫的 液相色谱质谱质谱测定方法。 本标准适用于鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加剂、精料补充料中 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的测定。 规范性引用文件 下列文件对于文本件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 分析实验室用水规格和试验方法。 方法提要 试样中的孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫残留用乙腈提取，中性氧化铝和阳离子交换 固相萃取柱净化，液相色谱质谱质谱仪检测，内标法定量。 试剂材料 除另有说明外，所用试剂均为分析纯，水为去离子水，符合 要求。 乙腈：色谱级。 甲醇：色谱级。 二氯甲烷：色谱级。 甲酸：色谱级。 乙酸铵：色谱级。 盐酸羟胺。 对甲苯磺酸。 氨水： 。 中性氧化铝柱：， 使用前用乙腈活化。 阳离子交换柱： ，使用前用甲醇， 甲酸溶液活化。 盐酸羟胺溶液：称取 盐酸羟胺，用水溶解并定容至 。 对甲苯磺酸溶液：称取 对甲苯磺酸，用水溶解并定容至 。 乙酸铵溶液：精确称取 乙酸铵（精确至 ） ，用水溶解并定容至。 甲酸溶液：准确移取甲酸，用水定容到 。 犛犖犜 含氨水的甲醇溶液：准确移取氨水， 用甲醇定容到 。 乙酸铵溶液，含 甲酸：精确称取 乙酸铵（精确至 ） ，加入甲酸， 用水溶解并定容至。 含 甲酸的乙腈；准确移取甲酸用乙腈定容到。 标准品：孔雀石绿（ 号： ） 、孔雀石绿（ ） 、隐 色孔雀石绿（ 号： ） 、隐色孔雀石绿（ ） 、 结晶紫（ 号： ） 、结晶紫（ ） 、隐色结晶紫（ 号： ） 、隐色结晶紫（ ） ，纯度均大于 。 标准工作溶液的配制：分别称取 （ 精确到 ）孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐 色结晶紫标准品，分别用乙腈溶解并定容至 ，各种标准储备溶液浓度为；标准储备溶液 于 冰箱内避光保存，有效期为个月。分别移取适量上述标准储备溶，用乙腈溶液逐级稀释，配 成 的标准工作溶液，于冰箱内避光保存，有效期为个月。 内标标准工作溶液的配制：分别称取 （ 精确到 ）孔雀石绿、隐色孔雀石绿、 结晶紫、隐色结晶紫标准品，分别用乙腈溶解并定容至 ，各种内标标准储备溶液浓度为 ；标准储备溶液于 冰箱内避光保存， 有效期为个月。分别移取适量上述内标标准储 备溶，用乙腈溶液逐级稀释，配成 的内标标准工作溶液，于冰箱内避光保存，有效期为 个月。 标准曲线的绘制：根据需要吸取一定量的标准工作溶液以及内标标准工作溶液， 用空白溶液配制 成标准曲线，临用前现配。 滤膜： 有机相滤膜。 仪器和设备 液相色谱质谱质谱仪：配有电喷雾离子源（ ） 。 分析天平：精确至 和 。 均质器。 离心机：转速可达 。 。 超声波发生装置。 旋转蒸发仪。 固相萃取装置。 试样制备与保存 取样品中有代表性的部分约 ，均分成两份，分别装入洁净容器作为试样，密封，并标明标记。 将试样置于 避光保存。 注：在制样的操作过程中，应防止样品污染或发生残留物含量的变化。 前处理步骤 鱼、虾、蟹、贝样品的提取、 净化 提取 称取 样品（精确到 ）于 塑料离心管中，加入 内标标准工作液，加入 乙 犛犖犜 腈，匀浆 （ ） ，超声提取 ，离心 （ ） ，取上清液，再加入 乙 腈，重复提取一次，用乙腈定容到 待净化。 净化 取提取液至中性氧化铝柱上，用乙腈淋洗固相萃取柱，收集流出液， 氮吹至 左右，残液用乙腈定容至，加入乙酸铵溶液混匀，过 微孔滤膜，上机分析。 其他样品的提取、净化 提取 称取 样品（精确到 ）于 塑料离心管中，加入 内标标准工作液，依次加入 盐酸羟胺溶液，对甲苯磺酸溶液、乙酸铵缓冲溶液、 乙腈溶液，匀浆 （ ） ，超声提取 ，离心 （ ） ，将上清液转移到 分液漏斗中，残 渣用 乙腈重复提取一次，合并上清液。分液漏斗中加入 二氯甲烷， 水，振摇 ， 静置分层，收集有机相层于梨形瓶中，再用 二氯甲烷萃取一次，合并有机层， 旋转蒸发至近 干，用乙腈分三次（每次）溶解上述提取物。 净化 将中性氧化铝柱串接在阳离子交换柱上方，取提取液至中性氧化铝柱上，依次过柱，用 甲醇淋洗，弃去中性氧化铝柱，依次用的甲酸溶液，甲醇淋洗阳离子交换柱，弃去流出 液。用 含氨水的甲醇溶液洗脱，收集洗脱液，氮吹至干，乙腈水（）定容，过 滤膜，上机分析。 测定 液相色谱条件 色谱柱： ，粒径 ， 或性能相当者； 流动相： 乙酸铵 甲酸，：乙腈 甲酸； 流速： ；梯度洗脱程序见表； 进样量： ； 柱温：常温。 表 梯度洗脱程序表 时间（ ） 乙酸铵含 甲酸 （流动相） 含 甲酸的乙腈 （流动相） 犛犖犜 质谱条件 离子源：电喷雾 正离子模式； 扫描方式：多反应监测； 其他参考质谱条件见附录。 定量测定 根据试样中被测物的含量情况，选取响应值适宜的标准工作液进行色谱分析，标准曲线工作液应有 个浓度水平。基质标准工作液和待测液中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的响应值均 应在仪器线性响应范围内。在上述色谱条件下雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的参考保留 时间参见附录。标准溶液中待测物的多反应监测色谱图参见附录。 定性测定 按照液相色谱质谱质谱条件测定样品和标准工作溶液，如果检测的质量色谱峰保留时间与标准 品一致，定性离子对的相对丰度，是用相对于最强离子丰度的强度百分比表示，应当与浓度相当标准工 作溶液的相对丰度一致，相对丰度允许偏差不超过表规定的范围，则可判断样品中存在对应的被 测物。 表 定性确证时相对离子丰度的最大允许偏差 相对离子丰度 至 至 允许的相对偏差 空白试验 除不加试样外，均按上述操作步骤进行。 结果计算和表述 用色谱数据处理机或按式（）计算试样中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的残留含 量，计算结果需扣除空白值： 犡犮犮 犻犃犃狊 犻犞 犮狊 犻犃犻犃狊犿 （） 式中： 犡 试样中待测组分的含量，单位为微克每千克（ ） ； 犮 标准工作液待测组分的浓度，单位为纳克每毫升（ ） ； 犆狊 犻 标准工作液中内标物的浓度，单位为纳克每毫升（ ） ； 犆犻 测试液中内标物的浓度，单位为微克每毫升（ ） ； 犃狊 标准工作液中待测组分的峰面积； 犃 测试液中待测组分的峰面积； 犃狊 犻 标准工作液中内标物的峰面积； 犃犻 测试液中内标物的峰面积； 犞 样品总稀释体积，单位为； 犿 试样质量，单位为。 犛犖犜 测定低限、回收率 测定低限（犔犗犙） 本方法对鱼、虾、蟹、贝中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的测定低限为 。 本方法对鱼粉、植物源性饲料、配合饲料、浓缩饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫 的测定低限为 。 本方法对饲料添加剂、精料补充料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的测定低限为 。 回收率 采用本方法对鱼、虾、蟹、贝、鱼粉、植物源性饲料、浓缩饲料、配合饲料、饲料添加剂、精料补充料等 基质进行添加回收试验，孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫中的回收率资料参见附录。 犛犖犜 附 录 犃 （资料性附录） 串联四级杆质谱仪参数（ ） 质谱仪参数： ） 电喷雾电压（ ） ：正模式： 。 ） 雾化气压力（ ） ； （ ） 。 ） 气帘气压力（） ： （ ） 。 ） 辅助气流速（ ） ： （ ） 。 ） 离子源温度（） ： 。 ） 监测离子对、碰撞电压（） 、去簇电压（）如表 所示。 表犃 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的定性、定量离子对、碰撞能量（犆犈） 、 去簇电压（犇犘）参考值、以及保留时间 化合物 定性离子对 （） 去簇电压 （） （） 砰撞气能量 （） （） 参考保留时间 （ ） 孔雀石绿 隐色孔雀石绿 结晶紫 隐色结晶紫 孔雀石绿 隐色孔雀石绿 结晶紫 隐色结晶紫 （） 非商业性声明：附录所列参考质谱条件是在 质谱仪上完成的，此处列出试验用仪器型号仅为 提供参考，并不涉及商业目的，鼓励标准使用者尝试不同厂家或型号的仪器。 犛犖犜 附 录 犅 （资料性附录） 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的多反应监测（犕犚犕）色谱图 图犅 孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的多反应监测（犕犚犕）色谱图 犛犖犜 附 录 犆 （资料性附录） 食用动物和饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的添加回收率范围 表犆 食用动物和饲料中孔雀石绿、隐色孔雀石绿、结晶紫、隐色结晶紫的添加回收率范围 基质 化合物 孔雀石绿隐色孔雀石绿结晶紫隐色结晶紫 添加浓