SN∕T 2622-2019 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法

书 书 书 犐 犆犛 犅 中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 犛犖犜 代替 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 犇犲 狋 犲 犮 狋 犻 狅 狀犪 狀 犱犻 犱 犲 狀 狋 犻 犳 犻 犮 犪 狋 犻 狅 狀狅 犳犡犪 狀 狋 犺 狅犿狅 狀 犪 狊犮 犻 狋 狉 犻狊 狌 犫 狊 狆 犮 犻 狋 狉 犻犌犪 犫 狉 犻 犲 犾犲 狋犪 犾（ ） 发布 实施 中华人民共和国海关总署发 布 书 书 书 前 言 本标准按照 给出的规则编写。 本标准代替 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 ，与 相比主要变化 如下： 对原标准柑桔溃疡病菌检疫鉴定判定程序进行了修订； 补充了柑桔溃疡病菌图片资料； 补充了柑桔溃疡病菌荧光实时检测方法等更多可选择的方法； 补充了柑桔溃疡病菌致病性测定反应。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中华人民共和国成都海关、中华人民共和国上海海关。 本标准主要起草人：向勇、陈玲玲、付景圆、易建平、邵宝林、何万兴、王成华。 本标准代替标准的历次发布版本为： 。 犛犖犜 柑桔溃疡病菌检疫鉴定方法 范围 本标准规定了进出境植物检疫中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定方法。 本标准适用于进出境芸香科（ ）植物及其果实中柑桔溃疡病菌的检疫鉴定。 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本 文件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 实验室用水规格和试验方法 进出境植物苗木检疫规程 进出境植物及植物产品检疫抽样 病菌的基本信息 柑桔溃疡病菌犡犪 狀 狋 犺 狅犿狅 狀 犪 狊犮 犻 狋 狉 犻 犮 犻 狋 狉 犻 犲 狋犪 犾（ ） ，属细菌域 ，变形菌门 ，变形细菌纲 ，黄单胞菌目 ，黄单胞杆菌科 ，黄单胞菌属犡犪 狀 狋 犺 狅犿狅 狀 犪 狊，该病菌的其它信息参见附录。 方法原理 该病菌的为害症状、菌落形态特性、致病性反应、特异性反应是其检疫鉴定的主要依据。 主要试剂 除另有说明，本标准中试剂均为分析纯或生化试剂，试验用水参照 。 乙醇、蛋白胨、牛肉浸膏、酵母膏、蔗糖、琼脂、溴化乙锭（） 、琼脂糖、 、 聚合酶、体系、 、 探针等。 仪器设备 体式显微镜、超挣工作台、高压灭菌锅、生物培养箱、电子天平、普通冰箱、超低温冰箱、离心机、涡旋 混匀仪、纯水仪、浊度计、仪、实时荧光仪、电泳仪、凝胶成像系统、微量可调加样器、剪刀、培 养皿、三角瓶。 检疫鉴定 检疫鉴定流程 柑桔溃疡病菌鉴定流程如图所示。 犛犖犜 图 柑桔溃疡病菌鉴定流程 症状检查 按照 和 中规定的程序进行现场检疫并抽取样品。实验室对样品进行症状 检查，观察待检样品是否带有疑似症状（参见附录） ，如有症状，切取症状处组织在显微镜下观察是否 有喷菌现象，如有喷菌，直接从喷菌组织分离病菌。 如样品无症或有症样品未见喷菌，进行初检，方法见附录。结果为阳性的样品再 进行病菌分离。 犘犆犚检测 取无症样品或未见喷菌的有症样品，灭菌生理盐水室温浸泡处理 或冰箱过夜，震荡，取 浸泡液 离心 ，沉淀提取。常规或实时荧光检测（附录） ，柑桔溃 疡病菌作为阳性对照，非柑桔溃疡病菌作为阴性对照，双蒸水作为空白对照。 病菌分离 有症样品症状处切取小块组织，制片后于显微镜 倍下观察切口处是否 有云雾状细菌从切口处喷出。每个样品切取 个小块组织观察喷菌，分离其中有喷菌的个小 犛犖犜 块组织，如不足个喷菌组织，可增加镜检的组织数量。如有喷菌，将喷菌组织块取出，无菌水冲洗一 次， 酒精表面消毒处理 ，无菌水冲洗三次，转入 无菌水中浸泡 ；处理液于 平板上划线分离，每个处理划线个个平板； 培养后观察是否有典型菌落。疑似 菌落纯化三次后进行下一步鉴定试验。 如有症样品未观察到喷菌现象，取症状处组织剪刀剪成见方小块，加入适量灭菌水中室温浸 泡 或冰箱过夜，取一半处理液 离心 ，沉淀提取，常规或实时 荧光初检。阳性样品处理液稀释 、 和 ，分别取 涂布平板，每个处理 涂布个 个平板。培养和观察方法同上。如阳性样品未分离出典型菌落，可增加样本重复， 或处理液不稀释直接涂布平板，观察培养情况。 无症样品的初检和分离参考本方法。 鉴定 菌落形态特征 培养基上菌落平滑，不透明，有光泽，圆形，凸起，边缘完整；初始为白色，后变为浅黄色； 培养基上的菌落浅黄色，圆形，凸起，粘液状；培养基上菌落浅黄色，粘液状，有光泽。挑取可疑菌 落在培养基平板上纯化三次后进行 测定或鉴定。 病菌生理生化特征见附录。 犘犆犚扩增 疑似分离物在平板上 培养 ，收集菌体提取，进行常规或实时荧光检 测，检测程序见附录。 致病性测定 疑似分离物在上 培养 ，用无菌水配成 菌悬液，采用针刺接种法接种柑桔（葡 萄柚、墨西哥来檬、枸桔和甜橙）幼嫩叶片，以无菌水作为阴性对照。接种植株 培养，后开始观察叶片 发病情况。对接种出现症状处组织进行病菌再分离，并与最初的接种分离物比较，完成致病性测试。 结果评定 分离获得疑似分离物， 测定符合或检测结果为阳性，致病性测试表现典型症状，判定样 品为检出柑桔溃疡病菌；其余情况判定为未检出柑桔溃疡病菌。 样品保存与处理 样品经登记和经手人签字后妥善保存。对检出柑桔溃疡病菌的样品保存，以备复核。样品保 存期满后高压灭菌灭活处理。 菌株保存与处理 从样品中分离并鉴定为柑桔溃疡病菌的菌株，应妥善保存。配置成 菌悬液，加入 甘油于 下冻存；也可将菌株冻干， 或 下长期保存。保存期满高压灭菌 灭活处理。 犛犖犜 附 录 犃 （资料性附录） 柑桔溃疡病菌信息 犃 英文名 ； ； ； 犃 学名 中文名：柑桔黄单胞柑桔亚种 学名：犡犪 狀 狋 犺 狅犿狅 狀 犪 狊犮 犻 狋 狉 犻 犮 犻 狋 狉 犻 （ ） ，简称： 。 异名：犘狊 犲 狌犱 狅犿狅 狀 犪 狊犮 犻 狋 狉 犻 ， ；犅犪 犮 狋 犲 狉 犻 狌犿犮 犻 狉 狉 犻（ ） ， ；犅犪 犮 犻 犾 犾 狌 狊犮 犻 狋 狉 犻 （ ） ， ；犘犺狔 狋 狅犿狅 狀 犪 狊犮 犻 狋 狉 犻（ ） ， ；犡犮 犻 狋 狉 犻（ ） ， ；犡 犮 犻 狋 狉 犻 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犪 犲 ， ；犡犮 犪犿狆 犲 狊 狉 狉 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻（ ） ；犡 犮 犪犿狆 犲 狊 狋 狉 犻 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻 ， ；犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻 ， ； 犡犳狌 狊 犮 犪 狀 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻 ， ；犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻（ ） ， 。 柑桔溃疡病菌的种名随黄单胞杆菌属（犡犪 狀 狋 犺 狅犿狅 狀 犪 狊）种类的调整而发生较大变化。最初的种名为 犡犮 犻 狋 狉 犻， 年伯杰氏细菌鉴定手册将黄单胞杆菌属中的种合并为个种，将其它 个种以致病 变种的形式并入犡犮 犪犿狆 犲 狊 狋 狉 犻 狊种下，柑桔溃疡病菌的种名为犡犮 犪犿狆 犲 狊 狋 狉 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻。 根据病菌的地理分布和对柑桔类植物的致病性不同，通常将柑桔溃疡病菌分为个菌系，分别为 、和菌系。 年， 等研究了各菌系染色体的限制性酶切片段长度多态性 （） ，将菌系提升到种的水平，命名为犡犮 犻 狋 狉 犻，、菌系命名为犡犮 犪犿狆 犲 狊 狋 狉 犻 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻，菌系为犡犮 犪犿狆 犲 狊 狋 狉 犻 狊 犮 犻 狋 狉 狌犿犲 犾 狅（ 犲 狋犪 犾 ） 。该分类命名未被广泛认同 （ 犲 狋犪 犾 ） 。 年， 等（ 犲 狋犪 犾 ）利用 微孔板测试 犡犪 狀 狋 犺 狅犿狅 狀 犪 狊属种类对 种碳源的反应，并结合 杂交、以及 技术，将黄单 胞杆菌进行重新分类。柑桔溃疡病菌的个菌系均划入地毯草黄单胞杆菌犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊种下，根据 致病性、寄主专化性以及杂交同源性的不同分为柑橘、枳壳和枳柚个致病变种：犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻（菌系） 、犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻（菌系）和犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 狌犿犲。 年， 等根据血清学、 杂交、序列、 和培养形状的不同，将犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻（菌系）命名为犡 犮 犻 狋 狉 犻 犮 犻 狉 狉 犻；犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻（菌系）命名为犡 犳狌 狊 犮 犪 狀 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻；将犡 犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 狌犿犲命名为犡犪 犾 犳犪 犾 犳犪 犲 犆 犻 狋 狉 狌犿犲 犾 狅 狀 犻 狊（ 菌系） 。 菌系（亚洲菌系）起源于亚洲，侵袭力最强，大多柑桔品种都可受其侵害，但葡萄柚、枳和甜橙最 易受侵害，世界性分布。菌系，又称来檬菌系。其中菌系于 年在阿根廷报道，能在柠檬 和墨西哥来檬上造成病斑，在葡萄柚与甜橙上几乎不发病，主要在南美洲流行。 年，菌系被发现 于巴西，在墨西哥来檬与酸橙上发病，在葡萄柚与甜橙上不发病。 年，菌系在墨西哥 地 区发现，致病力非常弱，其症状与型溃疡类似，但还没有危害果实的报道。主要危害墨西哥来檬，也 可危害波斯来檬及生长在墨西哥来檬病树周围的柚子树（ 犲 狋犪 犾 ） 。菌系和菌系似乎与 菌系有联，其划分只是暂时性（ 犲 狋犪 犾 ） 。 年，美国佛州发现苗圃菌系（菌系） ，与前 犛犖犜 个菌系不同，引起的病害也称细菌性斑点病（ ）或苗圃型溃疡（ 犲 狋犪 犾 ） 。 其症状与、型溃疡明显不同，叶片病斑水渍状，褪绿并坏死，但组织不木栓化隆起，也不破裂， 枝梢上的病斑与菌系极为相似。 将其命名为犡犮 犻 狋 狉 犻 犮 犻 狋 狉 狌犿犲 犾 狅。该菌系只危害苗木，自 然条件下不危害果实，对葡萄袖的侵袭力更强。 犃 地理分布 亚洲：阿富汗、孟加拉国（局部分布） 、柬埔寨、中国、圣诞岛、科科斯群岛、格鲁吉亚（可能） 、印度、印 度尼西亚、伊朗（局部分布） 、伊拉克（可能） 、以色列、日本、韩国、朝鲜、老挝、马来西亚、马尔代夫、缅甸、 尼泊尔、阿曼、巴基斯坦、菲律宾、沙特阿拉伯（局部分布） 、新加坡、斯里兰卡、中国台湾、泰国、土耳其、阿 拉伯联合酋长国、越南、也门（局部分布） 。 非洲：阿尔及利亚、贝宁、布基纳法索、科摩罗、刚果、科特迪瓦、埃及、埃塞俄比亚、加蓬、冈比亚、加 纳、几内亚、肯尼亚、利比亚、马达加斯加岛、马里（限制性分布） 、毛里求斯、马约特岛、莫桑比克、留尼旺 岛、罗德里格斯岛、塞内加尔、塞舌尔、索马里、南非（可能，报道已根除） 、苏丹、斯威士兰、坦桑尼亚（局部 分布） 、突尼斯、津巴布韦。 美洲：墨西哥、美国（局部分布） 、巴哈马群岛、伯利兹、英属维尔京群岛、美属维尔京群岛、哥斯达黎 加、古巴、多米尼加、多米尼克（可能） 、萨尔瓦多、瓜德罗普岛（法国） 、海地、洪都拉斯、牙买加、马提尼克、 荷属安德烈斯群岛（可能） 、尼加拉瓜、波多黎各、圣卢西亚岛（可能） 、特立尼达拉和多巴哥（可能） 、阿根 廷、玻利维亚、巴西、智利、哥伦比亚、厄瓜多尔、巴拉圭、秘鲁、苏里南、乌拉圭（局部分布） 、委内瑞拉。 欧洲：阿尔巴尼亚、克罗地亚、塞浦路斯、马耳他、荷兰。 大洋洲：美属萨摩亚、澳大利亚（可能，报道已根除） 、斐济、关岛（可能） 、马绍尔群岛、密克罗尼西亚 群岛、新西兰（可能，报道已根除） 、北马里亚纳群岛（可能） 、帕劳、新几内亚岛、所罗门群岛。 柑桔溃疡病菌有不同的致病型、血清型和遗传型菌株，通常分成以下几个菌系：菌系（ ， 亚洲型溃疡病或真正溃疡病型） ，分布于除地中海盆地和美国之外的大部分柑桔种植区；菌系（ ，假溃疡病型） ，分布于阿根延和乌拉圭；菌系（ ，墨西哥来檬型） ，分布于巴西和巴拉圭；菌 系（ ）分布于墨西哥；菌系（ ，柑桔细菌性叶斑病）分布于美国佛罗里达州。 亚洲型的菌系毒力最强，分布最广，侵染许多芸香科的寄主。菌系虽然也侵染柑桔属的寄主， 但在阿根廷、乌拉圭和巴拉圭主要侵染柠檬，可能与降低致病力的菌系有关。在巴西，菌系主要侵 染来檬（犆犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犪） 。 犃 寄主范围 可侵染芸香科野生和栽培种，主要为害芸香科的柑桔属（犆 犻 狋 狉 狌 狊） 、枳属（犘狅 狀 犮 犻 狉 狌 狊 ）和金桔属 （犉狅 狉 狋 狌 狀 犲 犾 犾 犪 ） 。经济上造成损失最大的是柑桔、甜橙、酸橙、来檬和柚，自然侵染仅发生在柑桔 属植物上（包括杂交品种和载培品种） ，也发生在枸桔（犘狅 狀 犻 狉 狌 狊狋 狉 犻 犳 狅 犾 犻 犪 狋） 、金桔（犉狅 狉 狋 狌 狀 犲 犾 犾 犪犿犪 狉 犵犪 狉 犻 狋） 、 犛 犲 狏 犲 狉 犻 狀 犻 犪犫 狌狓 犻 犳 狅 犾 犻 犪和菲律宾木桔（犛狑犻 狀犵 犾 犲 犪犵 犾 狌 狋 犻 狀 狅 狊 犪）上，芸香科其他的寄主还包括 、 和 亚科的一些植物，还报道了一种非芸香科寄主榔色木（犔犪 狀 狊 犻 狌犿 犱 狅犿犲 狊 狋 犻 犮 狌犿，楝科） 。菌系与菌系有相同的寄主范围，但是感染某些寄主并不严重，和菌系仅 侵染来檬（犆 犻 狋 狉 狌 狊犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犪） 。巴西有报道说酸草（犜狉 犻 犮 犺 犪 犮 犺 狀 犲犻 狀 狊 狌 犾 犪 狉 犻 狊）也是柑桔溃疡病的寄主。 犃 传播与扩散 柑桔溃疡病菌主要通过植物的气孔和伤口侵入植株。带病苗木、接穗和果实等柑桔材料的调运是 犛犖犜 其进行远距离传播的主要途径，田间主要通过风雨、虫害传播，有时带菌土壤也可以传病。 犃 典型症状 犃 叶片 发病初期在叶片背面出现黄色或暗黄色针尖大小的油渍状斑点，逐渐扩大，同时叶片正背两面均逐 渐隆起，呈近圆形、米黄色病斑。以后病部表皮开裂，呈海绵状，隆起更显著，木栓化，表面粗糙、灰白色 或灰褐色。病斑中心凹陷，周围有黄色或黄绿色晕环，有些品种在紧靠晕环处常有褐色的釉光边缘。到 后期，病斑中央成火山口状开裂。病斑大小随品种而异，甜橙、脐橙和柚上的病斑较大，枸桔、桔和柠檬 上的病斑较小，见图 和 。 犃 枝条 病斑近圆形，灰褐色，表面粗糙、突起、无黄色晕环，多个病斑常连成片，不规则。干燥条件下，溃疡 病斑海绵状、木栓化、隆起、表面破裂；潮湿时溃疡迅速扩大，表面完整，边缘油状。病斑发生在枝稍部位 不会产生黄色晕圈。嫩枝上产生坏死扁平病斑，有时具有油渍状的边缘，无黄色晕圈。 犃 果实 病斑与叶片上症状相似，但火山口状开裂更显著，木栓化程度更高，坚硬粗糙，一般无黄色晕圈，病部 只限于果皮，不发展到果肉，见图.和.。果实生育前期发生的病斑多隆起，中、后期发生的则较扁 平。幼病果有树脂状分泌物、发病严重时引起早期落果。 （犪） 柑橘背面 （犫） 柠檬正面 图犃 叶片上症状 图犃 致病性测试（左：无菌水；右：柑桔溃疡病菌） 犛犖犜 （犪） 柚子 （犫） 柠檬 图犃 果实上症状 图犃 果实上症状（酸橙） 犃 形态特征 革兰氏阴性，短杆状，两端钝圆，大小为 ，极生单鞭毛，有荚膜， 无芽孢。培养基上菌落呈圆形，全缘，蜜黄色，有光泽，表面光滑、微隆起，粘稠状，见图 。 图犃 菌落形态特征（犖犃上 培养 犺） 犃 生理生化特征 能使明胶液化，水解酪蛋白，在的 溶液中生长，不使石蕊牛乳胨化，不产生硫化氢，分解淀 粉，水解七叶树素，甲基红试验为阴性，过氧化氢反应为阳性，氧化酶反应为阴性，尿素分解试验为阴性， 不能降解硝酸盐、吲哚产物，可以分解阿拉伯糖、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、海藻糖产酸。病菌最适温度为 犛犖犜 ，最低为 ，最高为 ，致死温度为 ，最适 为 。 犃 犡 犮 犮及其近似种的区别 及其近似种的区别见表 。 表犃 犡 犮 犮及其近似种的区别 英文名（ ）（ ）（ ） 中文名柑橘溃疡病菌柑橘溃疡病菌柑橘斑点病菌 犡犮 犪犿狆 犲 狊 狋 狉 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻菌系菌系（来檬菌系）菌系 犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 犻 犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犻 犾 犡犪狓 狅 狀 狅 狆 狅 犱 犻 狊 犮 犻 狋 狉 狌犿犲 犾 狅 拉丁名犡犮 犻 狋 狉 犻 犮 犻 狋 狉 犻 犡犳狌 狊 犮 犪 狀 狊 犪 狌 狉 犪 狀 狋 犻 犳 狅 犾 犻 犻 犡犪 犾 犳犪 犾 犳犪 犲 犮 犻 狋 狉 狌犿犲 犾 狅 狀 犻 狊 地理分布亚洲、非洲和美洲 中、南美洲（墨西哥、巴西、阿 根廷、乌