SN∕T 5097-2019 国境口岸蜱传巴贾病毒实时荧光RT-PCR检测方法

中华人民共和国出入境检验检疫行业标准 SN/T 50972019 国境口岸蜱传巴贾病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 Real-time RT-PCR method for detecting Bhanja virus in ticks at frontier ports 2019-09-03 发布2020-03-01 实施 中 华 人 民 共 和 国 海 关 总 署发 布 ICS 11.020 C 62 蜱传巴贾病毒.indd 12019/9/12 14:01:05 蜱传巴贾病毒.indd 22019/9/12 14:01:05 I SN/T 50972019 前 言 本标准按照 GB / T 1.12009 给出的规则起草。 本标准由中华人民共和国海关总署提出并归口。 本标准起草单位：中国检验检疫科学研究院、中华人民共和国广州海关、深圳市检验检疫科学 研究院、中华人民共和国呼和浩特海关。 本标准主要起草人：刘丽娟、曹晓梅、刘星宇、史蕾、杨宇、徐宝梁、郭天宇、张胜、王静。 蜱传巴贾病毒.indd 12019/9/12 14:01:05 蜱传巴贾病毒.indd 22019/9/12 14:01:05 1 SN/T 50972019 国境口岸蜱传巴贾病毒实时荧光 RT-PCR 检测方法 1 范围 本标准规定了国境口岸蜱传巴贾病毒实时荧光 RT-PCR 检测的检测对象、生物安全和 PCR 防污 染要求、仪器、试剂和检验程序。 本标准适用于蜱传巴贾病毒的检测。 2 规范性引用文件 下列文件对于本文件的应用是必不可少的。凡是注日期的引用文件，仅注日期的版本适用于本文 件。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。 GB 19489 实验室 生物安全通用要求 SN / T 1293 国境口岸蜱类监测规程 WS / T 230 临床诊断中聚合酶链反应（PCR）技术的应用 人间传染的病原微生物名录（中华人民共和国卫生部 卫科教发200615 号） 3 术语和定义 下列术语和定义适用于本文件。 3.1 巴贾病毒 Bhanja virus ；BHAV 布尼亚病毒科白蛉病毒属成员，是单股负链节段性 RNA 病毒，有 S、M 和 L 片段。其中，L 片 段编码 RNA 依赖性 RNA 多聚酶，M 片段编码糖蛋白 Gn 和 Gc，S 片段编码核衣壳蛋白和非结构蛋白。 BHAV主要经蜱叮咬传播，导致人、牲畜患病。 在通常情况下，人感染BHAV后可能出现昏睡、呕吐、 脑膜炎和瘫痪等神经系统症状；牲畜感染后可能发生流产和死亡。 4 缩略语 下列缩略语适用于本文件。 bp ：碱基对（base pair） Ct 值：循环阈值（cycle threshold） DEPC ：焦碳酸乙二酯（diethyl pyrocarbonate） FAM ：6- 羧基 - 荧光素（6-carboxy-fluorescein） RNA ：核糖核酸（ribonucleic acid） ROX ：6- 羧基 -x- 罗丹明（6-carboxy-x-rhodamine） RT-PCR ：逆转录聚合酶链反应（reverse transcription polymerase chain reation） 蜱传巴贾病毒.indd 12019/9/12 14:01:05 2 SN/T 50972019 5 检测对象 5.1 国境口岸现场采集的蜱虫样本。 5.2 疑似被蜱虫叮咬且不能排除巴贾病毒感染的人员。 6 生物安全和 PCR 防污染要求 6.1 生物安全要求 按照 GB 19489 和人间感染的病原微生物名录的要求，巴贾病毒相关材料的生物安全要求 如下： 巴贾病毒危害程度分类为第三类； 未经培养的巴贾病毒感染性材料的操作应在生物安全二级（BSL-2）实验室内进行； 巴贾病毒相关的灭活材料和无感染性材料操作可在生物安全一级（BSL-1）实验室内进行； 巴贾病毒感染性材料运输和包装分为 B 类，UN 编号为 UN 3373。 6.2 PCR 防污染要求 PCR 防污染措施按 WS / T 230 的规定执行。 7 仪器 7.1 荧光定量 PCR 仪。 7.2 二级生物安全柜。 7.3 高压灭菌器。 7.4 -70 超低温冰箱。 7.5 台式离心机。 7.6 旋涡振荡器。 8 试剂 8.1 DEPC 水 DEPC 处理过的不含 RNA 酶的水。 8.2 RNA 提取试剂盒 QIAamp Viral RNA Kit，详见试剂盒说明书，内含 AVL、AW1、AW2 和 AVE 等 1） 。a 8.3 一步法荧光 RT-PCR 试剂盒 Ag-Path-IDTM One step RT-PCR Kit2）。b 1） 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 2） 给出这一信息是为了方便本标准的使用者，并不表示对该产品的认可。如果其他等效产品具有相同的效果， 则可使用这些等效产品。 蜱传巴贾病毒.indd 22019/9/12 14:01:05 3 SN/T 50972019 8.4 引物和探针 序列见表 1。 表 1 引物和探针序列 引物 / 探针名称序列（5-3）监测期 FGATGGTTGCATACACTGA 扩增片段为 166 bpRCTTGGCATCATCTTTCCA ProbeFAM- ATCCTTAAGGAGTTCGGTGAGGA -BHQ1 注：探针的 5端标记的是 FAM 荧光报告基团，3端标记的是 BHQ1 荧光淬灭基团。其他等效荧光标记物和 淬灭基团或等效的引物和探针或其他等效的商品化检测试剂盒也可使用。 9 检验程序 9.1 样本采集 9.1.1 蜱虫样本的采集 按照 SN / T 1293 执行。 9.1.2 人血清样本的采集 无菌采集疑似病例发病 3 d 内静脉血 5 mL，室温静置 30 min 使其凝固，1 500 r / min3 000 r / min 离心 10 min，收集血清于 2 mL 无菌螺口塑料管中，用耐低温油性记号笔登记编号，低温送到实验室检测。 如 24 h 内不能送到实验室，应将血清置于 -70 冰箱保存。 9.2 实验室检验 9.2.1 样本处理 9.2.1.1 蜱虫样本 在无菌操作台上，将蜱取出放在无菌的平皿内，用 75% 酒精浸泡 20 min，用无菌滤纸吸干蜱 体表酒精，再用生理盐水漂洗 3 次，用无菌滤纸吸干蜱体表水分后，倒入研磨器中，加入 1 mL PBS 或生理盐水吹洗，弃去液体后加入 1 mL PBS 或生理盐水，反复研磨至组织碎片基本消失，随后将 研磨液吸入 1.5 mL 离心管，预冷 4 的离心机 20 000 r / min 离心 10 min，取上清液即可进行病毒核 酸提取。 9.2.1.2 血清样本 血清样本直接进行分子生物学核酸的提取，如 24 h 不能及时检测应存放在 -70 冰箱。 蜱传巴贾病毒.indd 32019/9/12 14:01:05 4 SN/T 50972019 9.2.2 病毒核酸提取 参照商品化 RNA 核酸提取试剂盒说明书进行，参见附录 A。 9.2.3 实时荧光 RT-PCR 检测 9.2.3.1 引物和探针 引物和探针应用液浓度配制成 10 mol/L，扩增片段大小 166 bp。探针的 5 端和 3 端分别用 FAM 和 BHQ1 标记。 9.2.3.2 阳性对照和空白对照设置 在检测过程中，分别设阳性对照和空白对照。阳性对照为克隆巴贾病毒的部分核苷酸序列（应包 含扩增区域）在体外转录合成的 cDNA ；空白对照用无菌水。 9.2.3.3 反应体系组成 反应体系组成见表 2。 表 2 巴贾病毒实时荧光 RT-PCR 的反应体系 单位为微升（L） 成 分体 积 DEPC 水4.5 2RT-PCR 缓冲液12.5 10 mol / L 上游引物1 10 mol / L 下游引物1 10 mol / L 探针0.5 酶混合物0.5 模板 RNA/ 阴性对照 / 阳性对照5 注：巴贾病毒实时荧光 RT-PCR 的反应总体系为 25L。 9.2.3.4 反应条件 一步法实时荧光 RT-PCR 检测扩增条件为：45 10 min 1 次；95 10 min 1 次；95 15 s， 60 45 s，共 40 个循环。每个循环结束时采集荧光信号。选择 FAM 通道于 60退火时收集荧光信号； 设置 ROX 通道为参比通道。不同实验室可根据所使用的试剂和仪器参考上述反应条件作适当调整。 9.2.4 检验结果判断及报告 9.2.4.1 阈值确定 阈值确定的方法对所有的样本都是统一的，一般是以实时荧光 PCR 反应的前 3 15 个循环的荧 光信号作为荧光本底信号，以本底信号标准差的 10 倍作为荧光阈值，以样本扩增产生的荧光信号达 到荧光阈值时所对应的循环数为循环阈值（Ct 值） 。 蜱传巴贾病毒.indd 42019/9/12 14:01:05 5 SN/T 50972019 9.2.4.2 质量控制 反应结果应同时符合以下 2 个条件： 阴性对照物未出现扩增曲线； 阳性对照物 Ct 值 35 并有明显扩增曲线。 9.2.4.3 结果判断及报告 当同时进行的阳性对照和空白对照试验结果正常，本方法检验结果判定及报告如下： 检测样本有明显的荧光扩增曲线，且 Ct 值 35 时，判为阳性，报告“检出巴贾病毒特异性 基因（实时荧光 RT-PCR 法） ” 。 检测样本荧光扩增曲线的 Ct 值介于 35 和 40 之间时，建议重新进行实时荧光 RT-PCR 检测。 若重新检测的 Ct 值仍介于 35 和 40 之间，且曲线有明显的对数增长期，判为阳性，报告“检出巴贾 病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法） ” ，此类样本建议用其他方法进一步验证；否则判为阴性， 报告“未检出巴贾病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法） ” 。 检测样本无荧光扩增现象，判为阴性，报告“未检出巴贾病毒特异性基因（实时荧光 RT-PCR 法） ” 。 蜱传巴贾病毒.indd 52019/9/12 14:01:05 6 SN/T 50972019 附 录 A （资料性附录） RNA 病毒核酸提取 A.1 取蜱样本研磨液或细胞培养液上清 140 L 加入 560 L 裂解液（AVL） ，在旋涡混匀器上振 荡 15 s 混匀，室温静止 10 min。 A.2 加入 560 L 无水乙醇终止反应，在旋涡混匀器上振荡 15 s 混匀。 A.3 裂解后的液体分两次移入管柱，每次 8 000 r / min 离心 1 min，此时病毒 RNA 会吸附在管柱 底部的膜上。 A.4 加入 500 L 洗液（AW1）至管柱上，每次 8 000 r / min 离心 1 min，弃去 AW1。 A.5