气相色谱检测牛乳中六六六、滴滴涕残留方法研究.pdf

98 食品安全导刊 2015年3月 T echnology 科技 分析与检测 六六六、滴滴涕属于有机氯农药 中的两类，常见的各有 4 种异构体， 分 别 为 -666、-666、-666、 -666 及 p,p-DDE、o,p-DDT、 p,p-DDD、p,p-DDT。都属于广谱 杀虫剂，具有胃毒、触杀和熏蒸三中 作用方式。效力强而持久，属高残留 农药品种，其中以 -666 为比较重要 的异构体，是杀虫剂的活性成分，俗 称林丹。它们在防治蝗虫、稻螟虫、 小麦吸浆虫等农业害虫和蚊、蝇、臭 虫等卫生害虫以及防治疟疾发挥过比 较重要的作用。但由于该类农药具有 半衰期长,不易分解和亲脂性等特点， 近年来害虫抗药性不断增强，残留污 染严重 1，并通过食物链进入人体在 人体脂肪内长期蓄积，扰乱人体的荷 尔蒙分泌，2001 年的流行病学杂 志提到，科学家通过抽查 24 名 16 到 28 岁墨西哥男子的血样，首次证实了 人体内 DDT 水平升高会导致精子数目 减少。除此以外，新生儿的早产和初 生时体重的增加也和DDT有某种联系， 已有的医学研究还表明了它对人类的 肝脏功能和形态有影响，并有明显的 致癌性能。2 我国政府已于 1983 年禁止使用此 两种农药，但由于其半衰期长和不易 分解的特点，可能在环境中还有残留， 并通过各种方式进入生物体内，GB 2763-2012 食品中农药最大残留限量 中明确规定牛乳中六六六、滴滴涕的 限量值为 0.02mg/kg。目前食品中有 机氯农药残留一般用气相色谱电子捕 获检测器法检测。牛乳由于其基质较 复杂造成前处理过程较难，本文研究 了牛乳中六六六、滴滴涕的气相色谱 检测方法，并通过加标回收率、精密 度等指标验证了其科学有效性。 1 实验部分 1.1 仪器与试剂 气相色谱仪：岛津 GC-2010；电 子天平；旋转蒸发仪；固相萃取装置； 氮吹仪。 丙酮、石油醚（30-60）、乙酸 乙酯、环己烷、氯化钠、无水硫酸钠。 1.2 样品处理 1.2.1 提取：称取 20g（精确到 0.01g）牛乳于 200mL 具塞三角瓶中， 加入 40mL 丙酮，振摇 30min 后，加入 6g 氯化钠，充分混匀。再加入 30mL 石 油醚，振摇 30min。静置分层后，将有 机相全部转移至 100mL 具塞三角瓶中 经无水硫酸钠干燥，并量取 35mL 于旋 转蒸发瓶中，旋转蒸发浓缩至 1mL， 加入 2mL 乙酸乙酯 - 环己烷（1+1） 溶液再浓缩，如此重复 3 次，浓缩至 约 1mL，用乙酸乙酯 - 环己烷（1+1） 洗涤旋转蒸发瓶数次，将洗涤液合并 至试管中，定容至 10mL，待净化。 1.2.2 净化：采用佛罗里硅土小 柱净化，安装好固相萃取装置，打开 真空泵，设定真空压力为 254mmHg， 每根小柱加 4mL 石油醚，慢慢打开柱 阀让正己烷通过吸附层，赶出气泡、 关上阀门，溶剂浸泡吸附层约 5min 后， 慢慢打开柱阀待石油醚通过小柱，于 吸附剂上层含1毫米溶剂时关闭柱阀。 不得使小柱淋干。转移提取液至小柱 中，打开柱阀，使提取液以大约 2mL/ min 的流速通过吸附剂，不得使小柱淋 干。用 10mL 丙酮 / 石油醚（10/90， v/v）洗脱柱子，打开真空泵调节泵 压至 254mmHg，让溶剂浸泡吸附层约 1min后， 慢慢地打开柱阀， 收集洗脱液。 1.2.3 上机：将收集到的洗脱液 在 50下氮气吹至近干，用石油醚准 确定容至 1mL，上气相色谱测定。 1.3 标准溶液的配制 六 六 六、 滴 滴 涕 混 标 浓 度： 50g/mL 分别吸取0.1、 0.2、 0.4、 0.8、 1.0mL 标准溶液正己烷定容至 100mL 容量瓶 中，得到六六六、滴滴涕标准溶液浓 度分别为0.05、 0.1、 0.2、 0.4、 0.5g/ mL。 1.4 GC 仪器条件 色谱柱：Rtx-5 毛细管柱 30m0.25mm（内径）0.25m； 进样口温度：260； 升温程序：初始柱温 60，保持 1min， 以 30 /min 升 温 至 190 ， 保 持 1mim， 再 以 5 /min 升 温 至 230，保持 10min，再以 10 /min 升温至 250，保持 2min； 载气：氮气（纯度 99.999%）， 线速度 25cm/s； 进样方式：不分流进样；进样量： 1L。 检测器：ECD， 温度：300， 电流： 0.5nA。 2 结果与讨论 气相色谱检测牛乳中六六六、滴滴涕残留方法研 究 李 飞 柴彦兵 张耀广 李兴佳 王玉英 石家庄君乐宝乳业有限公司质量管理中心 摘 要：本文建立了牛乳中六六六、滴滴涕的气相色谱测定方法。样品用丙酮和石油醚提取，旋转蒸发仪浓缩，佛 罗里硅土小柱净化后，用气相色谱仪测定，RTX-5 毛细管柱分离，保留时间定性，外标法定量。标准曲线相关系数在 0.9983-0.9998之间， 方法检出限在0.25-0.75g/kg之间， 平均加标回收率在98.18-107.98%之间， 相对标准偏差在0.28-4.79% 之间，精密度相对标准偏差在 1.09-6.22% 之间。结果表明所建立的方法经济、准确、可靠，适用于牛乳中六六六、滴滴涕 的检测。 关键词：气相色谱 ；牛乳 ；六六六；滴滴涕 Mar 2015 CHINA FOOD SAFETY 99 分析与检测 2.1 提取液的选择 食品中有机氯农药的提取一般采 用正己烷或石油醚，对于含水量较低 的样品可直接采用正己烷或石油醚， 而牛乳中含水量较高，需加入极性溶 剂丙酮组成的混合溶剂提取 3，本试 验采取丙酮：石油醚为 4:3 的混合液 提取，效果良好。 2.2 前处理优化 牛乳中含有大量蛋白质，加入丙 酮提取液后形成乳浊液，本实验加入 氯化钠，利用盐析的原理使水层与有 机层可以有效分离 4，有利于后面净 化步骤。 2.3 净化方法的选择 国标中采取凝胶色谱系统（GPC） 净化 5，而凝胶色谱净化仪器较昂贵， 凝胶柱使用有机溶剂较多， 成本较高， 不适用于一般企业使用，固本实验采 用了固相萃取法进行净化。比较了佛 罗里硅土、中性氧化铝及活性炭小柱 的净化效果， 综合回收率及成本因素， 最终在净化时选取佛罗里硅土小柱。 2.4 色谱柱的选择 本实验采取的是岛津随机配备的 标准 Rtx-5( 固定相为 5% 的苯基十 95% 二甲基聚硅氧烷 ) 熔融弹性石 英毛细管柱，与之类似固定相的还有 DB-5、HP-5 等型号柱子，都适用于农 药残留的检测，六六六、滴滴涕标准 溶液色谱图见上图。 从图中可以看出，8 种异构体能在 26 分钟内有效的分开，峰型尖锐，对 称性好，出峰附近都没干扰峰，各峰 间间隔适宜， 是理想的色谱检测条件。 2.5 标准曲线和检出限（LOD） 取 8 种六六六、滴滴涕的异构体混 合标准系列溶液，按照上述第 1.4 节 所述仪器条件进行分析， 外标法定量。 样 1L，以峰面积 Y 对浓度 X(g/ mL) 进行线性回归，回归方程和相关 系数见表 1。 表 1 回归方程及检出限 浓度（g/mL）0.050.10.20.40.5回归方程 相关系数 （R） 检出限（g/ kg） -666440455835679172378735568924210073Y=9106+9344.10.99900.25 -66622176645123689231416467922136554Y=4106+288940.99920.50 -666399850812356163547831024584011763Y=8106+178610.99950.25 -666403054784631154845030587113610237Y=7106+716200.99890.25 p,p-DDE333337652148135024426512303184568Y=6106+312640.99930.60 o,p-DDT267113511426114368921045672536120Y=5106+419260.99830.50 p,p-DDD19566139456681423116257891914756Y=4106+164530.99870.75 p,p-DDT17945335247869947614123561804550Y=4106-9095.40.99980.50 最低检出限按下面公式进行计算， 详见表 1 CL=3Nd*C/(H*V) CL: 最低检测限（mg/kg）；C: 标 准液的浓度 g/mL；Nd: 基线噪声峰 高；H: 标准液色谱峰高；V: 进样体积 1L。 由表 1 可以得出 8 种六六六、滴 滴涕的异构体在 0.05-0.5g/mL 线 性范围内其峰面积呈线性关系，相关 系数在 0.9983-0.9998 之间，表明线 形良好，符合准确度的要求。检出限 在 0.25-0.75g/kg 之间。 2.6 方法准确度（样品回收率） 为了验证方法的准确度，本论文 对样品进行了标准加标回收实验，做 2 份平行实验，计算平均回收率和标准 偏差。结果见表 2 由表 2 可以得出在空白样品中添 加浓度为 0.05mg/kg 的六六六、滴滴 涕混标，两次平行试验平均回收率在 100 食品安全导刊 2015年3月 T echnology 科技 分析与检测 表 2 加标回收率结果 本 底 浓 度（mg/ kg） 理 论 加 标 浓 度（mg/ kg） 检 测 浓 度（mg/ kg） 回收率（%）平均回收率（%） RSD（%） -666ND0.05 0.05330106.59 106.110.90 0.05282105.63 -666ND0.05 0.05351107.01 106.870.28 0.05336106.73 -666ND0.05 0.0496099.20 99.040.34 0.0494398.87 -666ND0.05 0.05087101.74 103.042.50 0.05216104.33 p,p-DDEND0.05 0.05087101.74 103.583.55 0.05271105.402 o,p-DDTND0.05 0.0489797.94 98.180.51 0.0492298.43 p,p-DDDND0.05 0.05118102.37 104.884.79 0.05369107.38 p,p-DDTND0.05 0.05308106.17 107.983.35 0.05489109.78 表 3 标准样品的方法精密度 平行样12345平均值RSD% -666 0.010690.010730.010970.011070.011340.010962.42 -666 0.011230.010590.010780.011190.010990.0109562.48 -666 0.010890.010290.010840.011210.010830.0108123.06 -666 0.01120.011120.01130.0110.011270.0111781.09 p,p-DDE 0.010640.009960.010190.010450.009830.0102143.28 o,p-DDT 0.009920.009020.01050.010570.009930.0099886.22 p,p-DDD 0.011290.01110.011290.010590.011010.0110562.60 p,p-DDT 0.011320.011180.010930.011020.01050.010992.84 98.18-107.98% 之 间，RSD 在 0.28- 4.79% 之间，其回收率及精密度均符 合标准要求。 2.7 方法精密度 精密度是使用特定的分析程序， 在受控条件下重复分析均一样品所得 的测定值之间的一致程度，检验分析 方法的精密度时，通常以标准溶液、 实际样品和样品加标 3 种方法分析样 品。本实验采用加标样品做精密度试 验。结果见表 3 由 表 3 可 以 得 出： 以 浓 度 为 0.11mg/kg的加标样品连续进样5次， 所得进样液浓度（仪器读数）的平均 值 在 0.009988-0.011178 之 间，RSD 值在 1.09-6.22% 之间，精密度符合 标准要求。 3 结论 本文研究了牛乳中六六六、滴滴 涕的残留气相色谱测定方法。根据牛 乳的特点采用丙酮加石油醚混合液作 为提取液，旋转蒸发浓缩，佛罗里硅 土小柱净化。通过加标回收率验证了 方法的准确性，重复性实验验证了方 法的精密度，结果表明：标准曲线相 关系数在 0.9983-0.9998 之间，方法 检出限在 0.25-0.75g/kg 之间，平 均加标回收率在 98.18-107.98 之间， 相对标准偏差在 0.28-4.79% 之间， 精密度相对标准偏差在 1.09-6.22% 之间。回收率、相对标准偏差和精密 度都符合相关要求，选取固相萃取装 置节省了成本，可作为企业实验室检 测牛乳中六六六、滴滴涕的方法。 参考文献： 1 阎正，张亚莉，冯天铸等。毛 细管气相色谱法测定 5 种中草药中有 机氯农药的残留量。分析化学研究简 报，2003，31（1）：95-9