1株鹅源H5N1亚型禽流感病毒HA基因的序列分析

第六届理事会第二次会议皿教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 1 株鹅源H 5 N1 亚型禽流感病毒H A基因的序列分析 王伟利 1 ， 周宇2， 赵丽2 ( 1 吉林出入垅检脸检痰局，吉林 长春 1 3 0 0 6 2 ; 刘明3 ，钱爱东2 2吉 林农业大学，吉林 长春 1 3 0 1 1 8 ; 3中国农业科学院哈尔滨兽医研究所善医 生物技术国家重点实 脸室，黑龙江 哈尔 滨 1 5 0 0 0 1 ) 摘要:本研究时 1 株鹅源H 5 N 1 亚型禽流感 基因阳 性克隆鉴定、 序列测定与分析.结果表 编码5 6 8 个羲基 因序列比较分析 病 毒血凝素 ( H A ) 基因 进行扩增、 克隆，然后对毒株的H A 明:所扩增的片 段长1 7 0 7 b p ，包 含了 完整的开 放阅 读框架， 酸二 该毒 株与A / c h ic k e n / J i l in / 9 / 2 0 0 4 . A / g o o s e / G u a n g d o n g / 3 / 9 6 和A / H o n g K o n g / 1 5 6 / 9 7 H A 基 结果表明:核普酸同源率分别为 9 8 .4 % , 9 7 % 和%. 8 % ;氛基酸同源率分别为9 9 . 1 % 9 7 .2 % 和 9 7 %，受体结合位点的氛基酸均相同.该毒株有 7 个潜在糖基化位点;在 H A裂解位点附近有 6 个碱性氛基酸序列插入. 关键词: 鹅;禽流感病毒;血凝素墓因;序列分析 禽流感是A型流感病毒引起的一种禽类 ( 家禽和野禽)感染和域疾病综合征。该病毒 感染鸡、 火鸡、 鸭、 鹤鹑等家禽、 野鸟、 水禽和海鸟等的感染。 禽流感病毒是分节段的负链 单股R N A病毒， 在复制过程中很容易发生基因突变及基因重组， 因而决定了A I V具有众多 血清型和高度变异性，在结构蛋白中血凝素 ( H A )的变异最频繁，己经证明H A蛋白是禽 流感病毒发生变异的主要因素; H A蛋白也是诱导动物机体产生中和抗体的主要免疫原， 是 病毒变异、 毒力和宿主特异性的 主要因 素1 -2 1 。因 此 研究H A糖蛋白 具有重要的 意义。 本研 究对一株鹅源H 5 N 1 亚型禽流感病毒株进行克隆与序列分析， 从分子流行病学角度进一步分 析其来 源及其演化3 -6 1 ，为 政府有关部门 监控禽的 流行与防治 提供科学依据。 1材料与方法 1 . 1病毒毒株 1 株鹅源H S N 1 亚型禽流感毒株， A / G o o s e / J i l i n / l / 2 0 0 4 ( H S N I ) 简称为G由中国农业科 学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室提供数据库的参考毒株 A / g o o s e / G u a n g d o n g / 3 / 9 7 ( H 5 N 1 ) , A / H o n g K o n g / 1 5 6 / 9 7 ( H 5 N l ) , A / c h i c k e n / J i li n / 9 / 2 0 0 4 分别 简 称为G D 3 ( H 5 N 1 ) , H K 1 5 6 ( H 5 N I ) 和J L ( H 5 N 1 ) , G e n e B a n k 登录号分别为A F 3 6 4 3 3 4 , A F 0 4 6 0 8 8 , A Y6 5 3 2 0 0 a 1 . 2载体和菌种 克隆载体p M D 1 8 - T , J M 1 0 9 大肠埃希氏 菌 感受态细胞购自 宝生物工程有限公司。 1 . 3试剂 病毒R N A提取试剂T r iz o l , c D N A反转录试剂禽源反转录酶A M V购自p r o m e g a 公司: E x T a g D N A聚合酶、 限 制性内 切酶H in d H I , X h o I 、 胶纯化回收 试剂盒、 D N A M a r k e r D L 2 0 0 0 等购自 宝生 物工程有限公司; 质粒提取试剂盒 购自 鼎国 生物公司。 1 . 4引物合成 根据禽流感病毒已知的基因序列，设计合成一对引物。 P 1 :5 一 G T C AA GC T T C A AC C A T G G AG A A AA T AG T GC - 3 P 2 : 5 一 C GC CT C GAGT T AAA T GC AAA TT C T G- 3 所设计的上述引物由大连宝生物公司合成。 1 . 5病毒R N A的提取 按病毒R N A提取试剂T r i z o l 说明从禽流感病毒的鸡胚尿囊液中提取病毒R N A . . 1 . 6 H A墓因的R T P C R扩增 根据设计合成的引物 ，采用 c D N A反转录试剂禽源反转录酶A M V ，按说明进行反转 录成c D N A ，然后以c D N A为膜板按以下程序进行P C R扩增:9 4 预变性4 m i n，9 4 变 性4 0 s , 4 9 0C 退火 6 0 s， 7 2 延伸2 m i n，3 0 个循环， 7 2 延伸 1 0 m i n o . 结束后取P C R产 物5 g l ， 在1 % 琼脂糖凝胶上电泳检查结果。 3 7 3- 禽类传染病 1 . 7 H A基因的克隆与鉴定 P C R产物用胶问 收试剂盒回收， 与 p M D 1 8 - T载体连接， 转化J M 1 0 9 大肠埃希氏 菌 感 受态细胞内， 然后取1 0 0 川菌 液涂布于含氨节青霉素的L B 平板上， 3 7 0C 培养1 6 h ; 挑取白 色菌落接种于5 m L含氨节青霉素的L B液体培养基中，3 7 0C 培养 1 6 h ，小量提取质粒。 然 后对重组质粒进行P C R鉴定与酶切鉴定。 1 . 8目的基因的测序 将经过鉴定止确的重组质粒， 送大连宝生物公司进行序列测定。 H A基因序列比较分析 应用分析软件对整个阅读框内的H A基因序列的核普酸和推导的氨基酸序列分析， 以 及与已 l ! 序列比较分析。 2结果 2 . 1 H A基因R T P C R 、克隆后P C R鉴定及酶切鉴定 P C R 产物在1 % 琼脂糖凝胶中电泳检杏, H A . 基因扩增片段大小与预期结果相符约1 .7 k b o 用限制性内切酶 H i n d I I I , X h o I 对阳性质粒进行酶切，结果所切片段大小分别为 1 .7 k b和 2 .6 k b ，与预期结果相符。 2 . 2 H A基因的核昔酸和氨基酸序列测定 本研究毒株扩增的血 凝素( H A ) 基因 全长为1 7 0 7 b p , 编 码5 6 8 个氨基酸。 其中信号 肤 为1 6 个氨基酸， H A 1 , H A 2 分别为3 3 0 个氨基酸和2 2 2氨基酸， 并且含有起始密码子和终 I f: 密码子。所测定的核营酸 ( 图略)及推导的氨基酸序列见图 t o 2 . 3 H A基因的核昔酸和氨基酸序列比 较 将本研究毒株的 H A 基因序列与流感病毒数据库收录的基因序列比较，该毒株与 A / c h i c k e n / J i l i n / 9 / 2 0 0 4 ( H 5 N 1 ) 的H A基因序列比 较，核首酸与氨基酸同源率分别达9 8 .4 % 与 9 9 . 1; 与A / g o o s e / G u a n g d o n g / 3 / 9 6 ( H 5 N 1 ) , A / H o n g K o n g / 1 5 6 / 9 7 ( H 5 N 1 ) 的H A 基因 序列 相比 ， 核苍酸同源率分别为9 7 % 和%. 8 % ，氨基酸同源率分别为9 7 .2 % 和9 7 % 。比较结果表明， 该毒株与) 东与香港株亲缘关系较远，与吉林株亲缘关系较近， 但是均属于欧亚分支。 2 .4 H A基因序列的特征性分析 以人H 3 亚型 流感 病毒的H A基因 氨基酸序列 作为参照7 - 1 0 1 ， 推导并各 功能区的 氨基酸 序列组 .成。该毒株的H A 1 , H A 2 的裂解位点附近有连续6 个碱性氨基酸 ( R R R K K R )的插 入;在H A肤链上有7 个潜在的糖基化位点，分别位于H A 1 上的2 7 , 3 9 , 1 7 0 , 1 8 1 , 3 0 2 位和H A 2 上的1 5 4 位和2 1 3 位;受体结合位点的 氨基酸分别为Y WI H E L Y ， 左侧壁氨基酸 为S G V S S A ,右侧壁为N G Q S G R 。结果见表1 表 I :鹅源毒株与3 株H 5 亚型流感病毒的血凝案蛋白基因的特征性比 较分析 T a b l e l s p e c i f i c i t y c o m p a r i s o n o f H A P r o t e i n o f t h e G a n d o t h e r H S A I V s t r a i n s G GD3 1 1 K】 5 6 J l: G GD3 HKl 5 6 J l: G GD3 HK1 5 6 J L 9 2 0: G GD3 HK1 5 6 J L: G : ME K I V L L L A I V S L V K S D H I C I G Y H A 塑坐辽E Q V D T I ME K N V T V T H A Q D I L E K T H N G K L C D L D:6 1 : . . . . . Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . .N: 6 1 : . . .T . . . . . T. . . . .Q . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . R . . . . . . . . . N:6 1 . . . . . . . . . . . . . . . . Q . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 6 1 : GVK P L I L R D C S VA GWL L G NP MC DE F I NV P E WS YI VE K AS P A NDL C Y P GDF NDYE E L KH L L S: 1 2 2 : . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 1 2 2 : . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. . . . . . . . . . .: 1 2 2 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 1 2 2 : R I N H F E K I Q I I P K S S WS N H E A S S G V S S A C P Y I , G R P S F F R N V V WL I K K N S T Y P T I K R S Y N N T: 1 8 3 : . T . . . . . . . . . . . . . . . . . D. . . . . . . . . H. . S . . . . . . . A. . . : 1 8 3 : . . . . . . . . . . . D. . . . . . . . . . . . . . S . . . . . . ， 二A. . . . . . . . . . . : 1 8 3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . QK S . . . . . . . . . . . . . . . . . : 1 8 3 : N Q E D L L V L WG I H H P N D A A E Q T K L Y Q N P T T Y I S V G T S T L N Q R L V P K I A T R S K V N G Q S G R ME F: 2 4 4 : . ， ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . P . . . . : 2 4 4 : . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . E . . . . P . . . . . . . . . . . : 2 4 4 . . . . . . . ， . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 2 4 4 : F WT I L K P N D A I N F E S N G NF I A P E Y A Y K I V K K G D S A I MK S E L E Y G N C N T K C Q T P MG A I NS S M: 3 0 5 第六届理.会第二次会议盆教学专业委员会2 0 0 6 年会议论文集 GD3 HK1 5 6: .一 . . J L: G 3 6 6 GD3 HK 1 5 6 J L: G 4 2 7 GD3 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 3 0 5 : P F H N I H P L T I G E C P K Y V K S N R L V L A T G L R N S P Q R E R R R K K R G L F G A I A G F I E G G WQ G MV D G: .一二 一:. : : 3 6 6 : 3 6 6 : WY G Y H H S N E Q G S G Y A A D K E S T Q K A I D G V T N K V N S I I D K M N T Q F E A V G R E F N N L E R R I E N L N: HK1 5 6: ; . . . . R . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 4 2 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . N. . . . . . . . . . . . . . : 4 2 7 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . 。 . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . . : 4 2 7 : K K ME D G F L D V WT Y N A E L L V L ME N E R T L D F H D S N V K N L Y D K V R L Q L R D N A K E L G N G C F E F Y H: : . Q : 4 8 8 粥D 儿G48GI HK 1 5 6: : 4 8 8 : K C D N E C ME S V R 丛江Y D Y P Q Y S E E A R L K R E E I S G V K L E S I G T Y Q I L S I Y S T V A S S L A L A I MV: 5 4 9 . M. M . . : 5 4 9 : 5 4 9 K K， I L: G GD3 HK1 5 6 J L: G GD3 HK 1 5 6 J L: : A G L S L WMC S NG S L Q C R I C I - : 5 6 8 . . . . . . . . . . . . . : 5 6 8 . . . 。 . . . : 5 6 8 F i g u r e 1 一: 5 6 8 图 I 鹅源毒株株与参考毒株之间氮基酸的同源性比 较 C o m p a r i s o n o f t h e d e d u c e d a m i n o s e q u e n c e o f H A g e n e o f G a n d r e f e r e n c e 毒株 s t r a i n s 受休结合位点 t h e r e c e p t o r b i n d i n g s i t e 切割位点氨基酸 左恻壁受休结合部位 序列 右侧壁A m i n o a c i d 潜在的糖基化位点 P o t e n t i a l g ly c o s y l a t i o n s i t e s S e q u e n c e o f t h e HG3S GVS S A N G Q S G R S GVS S A N G Q S G R S GVS S A N G Q S G R S GVS S A N G Q S G R YWI HE L Y RE RRRKKR G D3YWI HE L Y RE RRRKKR NS S HK 1 5 6 YWI HE L Y R E RR R KKR NS T NVT NS T NNT NS S NG T NGS NS T NVT N NT NGT NGS NS T NV T NNT NGT NGS NS T NVT NS T NN T NS S NG T NG S NS S Y WI HE L Y RE RRRKKR 3 .2 H A是基因表达产物中最大的糖蛋白， H A蛋白含糖量约占其蛋白质的2 0 %, 化位点的增加或减少对病毒的 抗原性及其他生 物活性有一定影响【 12 -1 3 1 。 例如 糖基 夕法尼亚州流行的低致病力H 5 N 2 与后来大暴发的高致病力毒株H 5 N 2 之间的核昔酸及氨基 酸比较分析表明， 这两者在裂解位点均具有相同的碱性氨基酸序列， 不同的是高致病力毒株 仅在一个糖基化位点失去了一个寡糖链，该寡糖链应位于 H A I 和 H A 2裂解位点附近，它 的缺失可能使蛋白 酶的裂解作用增强。 广东鹅源毒株与香港的人源毒株株对鹅、 人和鸡都具 有致病性9 10 川 ，均缺少一个糖基化位点。 研究 表明， 有无糖基化位点 也是一个影响 病毒毒 力的因素。通过糖基化作用在特异氨基酸信号位点处添加糖链，可以影响H A I 的抗原特异 性和细胞受体的亲和性，糖基化位点的存在可能会提高对细胞受体上的唾液酸残基的亲和 禽类传染病 性， 使病毒以最快的方式侵入宿主细胞及从细胞中释放出来， 加快了病毒的复制过程， 增强 了 病毒的毒力 1 2 1 。 本研究的鹅源毒株有7 个糖基化位点， 对鹅和鸡均有致病性. 可能是增 加糖基的化位点使毒力增强，是否也与当地流行株发生基因重组需要进一步研究。 3 .3 A型禽流感病毒复杂的生态系统存在于禽类，尤其是水禽l a -l s 1 。 1 9 5 20年有 W a l k e r等从加拿大商品鸭中分离到禽流感病毒以 来，到1 9 9 9 年迄今世界上许多国家的 专家从家鸭、 野鸭和鹅中分离到30 多个血清亚型禽流感病毒， 但是大多数水禽禽流感病毒 分离株对鸭、 鹅和鸡无致病性或致病力低。 关于水禽鸭、 鹅流感， 过去普遍认为水禽仅是流 感病毒的携带者， 排毒而不发病， 然而，90 年代中期以 来， 水禽感染高致病性禽流感病毒 高发病率和高死亡率的事实， 打破人们对水禽的传统认识， 水禽不仅是自 然感染发病和死亡 的 禽类， 而且也是 禽流感 病毒的巨 大贮存库， 作为 传染 源可以 横向 传给鸡或火鸡等禽类1 6 1 鉴于水禽在A型流感病毒生态传播环境中的地位， 加强水禽内A I V以 及环境( 特别是水体) 中A I V存在情况的监控，定期进行A I V的流行病学调查，尤其进行分子流行病学调查，对 于预测禽流感的暴发及防制具有重要的现实意义。 参考文献略 鸽源H 5 N 1 亚型禽流感病毒株的血凝素基因的 克隆与序列分析 钱爱东周宇1王伟利2 赵丽 ( 1 . 吉林农业大学1 3 0 1 1 8 ; 2 . 吉林出 入境检验检疫局 1 3 0 0 6 2 ) 摘 要: 本研究对1 株鸽源H 5 N 1 亚型禽流感病毒血凝素( H A ) 墓因进行扩增、 克隆和序列测定. 结果表明， H A 墓因全长1 7 0 7 b p ， 含有一个完整的阅 读框， 起始密码子和终止密码子，编码 5 6 8 个羲基酸。在H A 裂解 位点附近有连续6 个碱性氛墓酸的插入， H A 塞因有7 个糖基化位点;将该墓因序列与已 发表的同一亚型参 考序列比 较发现，该毒株与 / c h i c k e n / J i l i n / 9 / 2 0 0 4 ( H S N 1 ) , A / c h i c k e n / H o n g K o n g / 7 2 8 / 9 7 ( H 5 N 1 ) , A / H o n g K o n g / 1 5 6 / 9 7 ( H 5 N 1 ) 和 / g o o s e / G u a n g d o n g / 1 / 9 6 ( H 5 N 1 ) 的 核普酸的同源率分别达9 8 . 1 %、9 5 . 9 % . 9 6 . 3 % 和 9