基因重组及遗传分析.ppt

第五章细菌基因重组及遗传分析,基因重组（generecombination）是指不同来源的遗传物质通过转移和交换而重新组合的过程。高等动植物和许多产生有性孢子的真核微生物的基因重组都是通过有性世代来完成。,在细菌中，提供部分遗传物质或少数基因的一方称为供体（donor），而获得基因的另一方称为受体（recipient）。,第一节转化（Transformation）,转化：是指某一基因型的细胞从周围介质中吸收来自另一基因型细胞的DNA而使受体的基因型和表型发生相应变化的现象。转化现象的发现和转化因子的证实对促进现代分子生物学的诞生和发展产生了巨大的推动作用。,在实验室条件下，通常用CaCl2、cAMP、低温培养、PEG介导及电脉冲等方法转化细菌或其它微生物。细菌转化的过程大体可分为三个阶段：感受态的出现DNA的吸附和进入DNA的整合,感受态的出现,感受态（competence）：是指受体菌细胞最容易接受外源DNA并使之不被DNA酶降解的生理状态。,一、转化过程和机制,细菌细胞在特定时期产生一种称为感受态因子的小分子蛋白（5-10kD）。这种感受态因子可与细胞表面受体蛋白结合，使细胞产生感受态特异蛋白，其中包括细胞壁自溶素。自溶素使细胞表面的DNA结合蛋白及核酸酶裸露出来，使其具有与DNA结合的活性。因此，当细菌表面出现许多DNA结合位点时，就意味着细菌出现了感受态。,4.进入细胞的单链与寄主DNA同源区重组并整合到染色体上,革兰氏阳性菌,1.双链DNA片段在DNA结合蛋白（黑色点）的帮助下吸附到细胞表面并由核酸酶（紫色椭圆）切成缺口,2.由核酸酶降解其中一条单链,3.未被降解的单链与感受态特异蛋白相互作用并进入细胞,DNA的吸附和进入,在流感嗜血菌中，其感受态细胞形成一种结合双链DNA的膜结构，称为转化小体（transformasome）。该小体吸附DNA后，与细胞的内外膜相融合而转入细胞内侧，再将双链变成单链DNA。,转化小体,双链DNA被转化小体摄取,转化的双链DNA（30-50kb）结合到膜受体上,很快进行同源重组使外源DNA整合到染色体上,革兰氏阴性菌,DNA在进入感受态细胞之前，要经过可逆性吸附和不可逆性吸附。可逆吸附的DNA对DNA酶敏感，并可以洗脱下来。随着感受态细胞膜蛋白的参与，可逆性吸附逐步向不可逆吸附转化，不可逆吸附DNA对DNA酶不敏感。,吸附到细胞表面是双链DNA，而不是单链DNA,实验证明：肺炎链球菌的转化因子在100下逐渐失去转化活性(DNA发生变性)。在逐渐冷却过程中活性逐渐恢复(单链DNA复性成双链)。说明完整的DNA双链结构对于转化活性来说是必要的，转化的第一步，需要双链DNA才能结合到细胞表面的结合位点上。,当DNA吸附后，被酶解开成单链DNA，只有单链DNA才能进入细胞内并与受体染色体DNA进行整合。,流感嗜血菌特异性摄取序列：5AAGTGCGGTCA3淋病奈瑟球菌特异性摄取序列：5GCCGTCTCAA3在流感嗜血菌的染色体上有600个拷贝的摄取序列。摄取序列虽然只有10-12bp，但很少随机地出现在其他物种的DNA序列中，因此这些细菌对外源DNA的吸收具有选择性。,为什么有些细菌对摄取的DNA有特异性要求呢？,近年来的研究表明，G-菌和G菌对单链DNA也能进行有效转化，但一般是在较低的pH值下进行的。,外源DNA片段在受体细胞中的命运：外源DNA（红色）转化到受体细胞后，通过同源重组整合到染色体上，否则被降解成核苷酸。,DNA的整合,转化为相同或相近物种之间的同源重组提供了可能性，是自然界中基因交换的一条重要途径，在生物变异和进化中起着重要作用。,转化的效率决定于下列三个内在因素：,受体细胞的感受态，决定转化DNA能否进入细胞受体细胞的限制系统，决定转化DNA在整合前是否被分解供体和受体DNA的同源性，决定转化DNA的整合。由于转化DNA总是与顺序相同或相似的受体DNA配合，所以亲缘关系越近的其同源性也越强，转化效率也越高。,二、人工转化,通过二价阳离子处理，大肠杆菌等部分G-细菌能产生感受态通过制备原生质，大多数细菌特别是某些G+细菌,已知许多细菌包括大肠杆菌均无自然转化的能力，但经人工诱导可使它们形成感受态。如：,1970年Mandel和Higa首先发现DNA在含有高浓度Ca2+的条件下能够被受体细胞摄入和转化，随后的实验证明由Ca2+诱导的人工转化的大肠杆菌中，其转化DNA必须是一种独立DNA复制子。,大肠杆菌的转化,随着研究技术的改进和经验的积累，人们已经建立了用Ca2+、Mg2+等诱导转化的标准程序，能对大肠杆菌菌株C600、JMl01、JMl09、DH5a等进行有效的转化。,先将大肠杆菌培养至OD600=0.51接着用50-100mmolLCaCl2处理制备成感受态细胞然后将DNA与感受态细胞混合在冰浴中反应20-40min进行42热击可增加DNA的吸收（107个转化子/ug质粒DNA）,最经典的转化方法是：,由于异源的质粒DNA分子能够进入大肠杆菌细胞，所以大肠杆菌摄取DNA是非选择性的。,PEG介导的转化,不能自然形成感受态的G+细菌如枯草芽孢杆菌和放线菌，可通过聚乙二醇(polyethyleneglycol，PEG，一般用PEG6000)的作用实现转化。这类细菌必须首先用细胞壁降解酶完全除去它们的肽聚糖层，然后使其维持在等渗的培养基中，在PEG存在下，质粒或噬菌体DNA可被高效地导入原生质体。,电脉冲法（电穿孔法）,在许多细菌和真核系统中，它们既无自然的感受态呈现也不能用上述的方法建立感受态。因此人们发展了一种新的将核酸分子导入细胞的方法，最突出的是电穿孔(electroporation)法和基因枪(biolistic)转化法。,电穿孔法：是用高压脉冲电流击破细胞膜或将细胞膜击成小孔，使各种大分子(包括DNA)能通过这些小孔进入细胞，所以又称电转化。,电场强度、电脉冲的长度和DNA浓度,基因枪(biolistic)转化,基因枪转化法首先由Sanford报道，该方法是将包裹有DNA的钨颗粒像子弹一样用高压射进细胞并使DNA留在细胞内，特别是留在细胞器中。用这种方法首次成功地将DNA导入酵母线粒体并引起线粒体遗传变化。基因枪转化现在被广泛地应用于植物的转化中,三、建立转化方法的策略,被转化对象（转化受体）转化DNA的构建（目的）转化方法选择,四、转化应用,在转化中，如果转化因子的两个基因是连锁的，那么它们可以同时被转化，也称为共转化，连锁的两个基因距离越近，其共转化频率越高，反之则低。利用共转化率和连锁的二基因间的距离的反比关系可进行基因定位的工作。,1.连锁检测,2.遗传图谱的绘制,trp2+his2+tyr1+（供体）trp2-his2-tyr1-（受体）的转化类型,trp2-his2重组率=2600+107+3660+418100%=34%11940+1180+2600+107+3660+418trp2-tyr1重组率=2600+1180+3660+685100%=40%11940+107+2600+1180+3660+685his2-tyr1重组率=418+1180+685+107100%=13%11940+3660+418+1180+685+107,3.基因中断,4.插入基因,第二节接合作用（conjugation）,接合作用：是指在供体细胞和受体细胞直接接触后，质粒从供体细胞向受体细胞转移的过程，也称细菌杂交。,一、接合现象的发现与证实,Lederberg和Tatum（1946年）建立了用大肠杆菌K12的两个营养缺陷型菌株在基本培养基上是否生长，来检验细菌杂交或重组存在的方法。在此以前，没有人证实细菌杂交现象。细菌杂交有别于典型的有性杂交，故称为细菌接合作用。,A菌株,B菌株,混合培养后在基本培养基中出现的原养型菌落是否是杂交的结果？必须要排除下列几种解释：一是细菌细胞并没有接合，而是交换了DNA(转化作用)二是细胞并未接合，而是通过培养基交换了养料(互养)三是细菌细胞并未接合而是亲本发生了回复突变,当时Lederberg和Tatum已经证明，当把A菌株的培养液经过灭菌，再加入到B菌株的培养液中，没有原养型菌落，这说明上述实验并非转化的结果。1950年，Davis通过他的U形管试验进一步支持了Lederberg和Tatum的结论。,1.转化作用的排除,营养缺陷型细胞通过培养基交换养料而生长的现象亦称为互养。,2.互养的排除,在A-B+T1s和A+B-T1r的杂交中，将基因型A-B+T1s和A+B-T1r两种细菌在基本培养基上混合培养，接触较短的一段时间以后，喷上噬菌体T1，把A-B+T1s细菌杀死。经培养以后仍有原养型菌落出现，这说明原养型菌落的出现并非由于互养。,因为大肠杆菌的突变率一般都10-8，若两个基因同时回复突变，则其可能性只有10-16（10-810-8），这种几率在平板上是很难检测到的，所以混合培养能出现10-510-6频率的菌落一定是重组的结果。,3.回复突变的排除,4.遗传物质的单向转移,正交实验,（A）Strs（B）Strr,用链霉素将A菌株杀死,重组体的数目变化不大,(A)Strr(B)Strs,将B菌株杀死,一个重组体也没有出现,反交实验,（A）met-bio-（Strr或Strs）（B）thr-leu-thi-（Strs或Strr）,Hayse（1952）用正反杂交实验证明，细菌重组的发生只是染色体单方向的转移，而且染色体的转移往往不完全。,把A菌株认为是供体，而B菌株是受体A菌株作为遗传物质的供体，当链霉素对它进行灭活以后，并未影响它传递遗传物质的能力。B菌株作为遗传物质的受体，一旦被链霉素杀死以后，必然不能出现重组体。,供体菌株又称为雄性细胞，受体菌株又称为雌性细胞,StrrA突变型（不育变种）,置冰箱1年后供体的A菌株StrrB菌株Strs,可育的StrsA菌株,共培养，一起繁殖,不能得到杂交子,StrrA菌株,B菌株Strs,恢复了StrrA突变型的可育性,F质粒的发现(Hayes),大肠杆菌的供体或雄性细胞(如A菌株)记为F+，带有一个性因子或致育因子F(fertilityfactor)，而另一个不带性因子F的受体或雌性细胞(如B菌株)叫做F-；杂交F+F-是可育的，杂交F-F-是不育的；F因子可以传递，从F+到F-细菌，但必须通过细胞接触F因子能够自发丧失，一旦丧失就不能再恢复，除非从另一个F+细胞再把它传递过来。,分析结果：,F因子是染色体外的一种遗传结构，也就是质粒(plasmid)。,F+是一种遗传性状F因子的存在使细菌成为F+F因子的丧失使细菌成为F-F+细菌分裂仍得到F+细胞,二、F质粒的结构及其在细胞中的存在状态,F质粒的遗传结构,F质粒的基因组由三个主要区段组成：转移区、复制区、插入区。,长度为33kb，由23个基因组成，构成一个tra操纵子(traoperon)。traABCEFGHKLQUVW与性菌毛的形成有关traYZMIGD等与F因子的转移有关traG、traN影响杂交对的配对形成与否traI、traM决定DNA转移起始traI编码解旋酶I(helicase)traD控制DNA转移；traY、traZ编码的核酸内切酶能在转移起始区oriT上切开一个缺口。,（1）转移区(transferregion),复制区负责F质粒的自我复制F质粒自主复制区为oriV（Vegetativeoriginofreplication），在oriV中包含有复制起点。F质粒的复制是按型方式进行复制，它是一种严紧型质粒。F质粒的拷贝数能被精确地控制，一个寄主细胞约有12个F质粒。rep（Freplicativeprotein）编码一组与F质粒复制相关的蛋白质。inc（incompatibility）基因产物使细胞具有不相容性。,（2）复制区（replicationregion）,F质粒插入区包含4个插入顺序：2个IS31个IS21个Tn1000（）它们与F质粒的整合、切除、易位有关,（3）插入区（insertionregion）,2.F质粒在细胞内的存在形式,根据大肠杆菌细胞内有无F质粒及F质粒在细胞内的存在状态可将细胞分为4种类型：F-、F+、Hfr、F。F-：是细胞内不含F质粒；F+：是细胞内含有F质粒且独立染色体外；Hfr菌株(highfrequencyrecombinationstrain)：高频重组菌株：是F质粒整合到宿主的染色体上，随着宿主染色体的复制而复制；F是指携带了宿主的一部分染色体的F质粒。,三、F质粒与接合作用,1.F+F-杂交有F质粒的细胞在形态学上可以与F-明显区别。除了共有的大量表面菌毛以外，F+还有少量（通常在细胞对数生长期中只有13根）性菌毛。纤细的蛋白质性菌毛有的长数毫米，直径约为8nm。性菌毛在细菌的接合过程中起着十分重要的作用。,2.HfrF-杂交,Hfr菌株是怎样形成的呢?F质粒有两种方式整合到染色体上：同源重组、质粒和染色体共有插入序列和转座子。大肠杆菌染色体基因组有7个IS1、13个IS2及6个IS3；F质粒有1个IS2和2个IS3。,3.FF-杂交,F质粒在脱离Hfr细胞的染色体时也会发生差错，从而形成带有细菌染色体基因的F质粒。而F因子又可通过交换融合到细菌染色体的原来位置上，回复到原来的Hfr状态。,由于在FF-接合使用中能专一性地向F-转移F质粒携带的供体基因，因而通过F因子的转移而使受体菌改变其遗传性状，这种现象也被称为F因子转导。,四、中断杂交试验和基因定位,中断杂交：就是将两个菌株（例如Hfra+strsF-astrr）在培养液中进行通风培养，每隔一定时间取样，把菌液放入组织捣碎器里搅拌以中断杂交，经过稀释接种到鉴别培养基上，待形成菌落后鉴定它们的基因型。,1957年Wollman和Jacob首次进行中断杂交实验：供体菌：HfrHstrsthr+leu+azistonslac+gal+受体菌：F-strrthrleu-azirtonrlac-gal-,0azitonlacgalF,Peptide-inducedtransferofEnterococcusfaecalisplasmidpCF10.(A)PeptidepheromonecCF10(triangles)isexpressedfromthechromosomeofbothplasmid-containingdonorcellsandplasmid-freerecipientcells.Inhibitorpeptide(stars)isexpressedfrompCF10andsecretedintothemediumtopreventpheromonefromthedonorcellfrominducingitself,probablythroughcompetitivebindingtothepheromonebindingproteinPrgZ.(B)PheromonefromanearbyrecipientcellisdetectedbyPrgZ.PrgZimportsthepeptidepheromoneusingthechromosomallyencodedOpp(Oligopeptidepermease)system.(C)ImportedcCF10inducesexpressionoftransfergenes,includingthecellsurfaceadhesinPrgB.(D)PrgBmediatesaggregationofthedonorandrecipientcells.Amatingchannelisthenformedandsingle-strandedpCF10istransferredtothedonorcellviaarollingcirclemechanism.AfterpCF10hasestablisheditselfintherecipientcell,theinhibitorpeptideandanothermechanismofnegativecontrol,PrgY,isexpressedtopreventself-inductionbyendogenouscCF10.,第三节转导(transduction),转导：是利用噬菌体为媒介，将供体菌的部分DNA转移到受体菌内的现象。因为绝大多数细菌都有噬菌体，所以转导作用较普遍。另外，转导DNA位于噬菌体蛋白外壳内，不易被外界的DNA水解酶所破坏，所以比较稳定。,局限性转导：被转导的DNA片段仅仅是那些靠近染色体上溶源化位点的基因,转导,普遍性转导：任何供体的染色体都可以转移至受体细胞,1952年Lederberg和他的学生Zinder把鼠伤寒沙门菌的一个突变菌株LT22(trp-)和另一个突变菌株LT2(his-)在基本培养基上进行混合培养，结果在107细胞中得到大约100个原养型菌落。,一、转导现象的发现,U形管实验,可过滤因子并不由于DNA酶的处理而失活；可过滤因子和从溶源性的LT22菌株得来的噬菌体(称为P22)具有相同的大小和质量；可过滤因子加热后失活，用抗P22血清处理后也失活；把P22与LT2和LT22菌株分别混合培养，在基本培养基上不出现原养型菌落。结果证实了可过滤因子是温和噬菌体P22。这就是最早发现的转导现象。,通过一系列的实验，证实可过滤因子具有下列一些特性：,转导过程中有三个组成部分，即供体、噬菌体和受体。这种导致基因重组的方式不同于转化，转化需要供体DNA和受体细胞接触，而转导则是以噬菌体为媒介将供体遗传物质传给受体，无需DNA和受体细胞接触。转导可分为普遍性转导和局限性转导，普遍性转导又可分为完全转导和流产转导。,二、普遍性转导,1.完全转导,P1供体收集子代噬菌体,菌苔计数噬菌体（完全培养基）,受体（缺陷型大肠杆菌）,选出重组子（转导子）,（基本培养基）,侵染裂解侵染,野生型,转导频率=转导子数100%=转导子数100%侵染受体的P1颗粒数噬菌斑数+转导子数,2.流产转导,3.普遍性转导在遗传学和分子生物学研究中的应用,(1)共转导：普遍性转导的重要应用之一是通过测定共转导的频率进行基因定位，所谓共转导(cotransduction)是指两个处在一个转导片段上的基因一起整合进受体染色体中。被共转导的两个基因之间的距离不能超过转导噬菌体所能包装的DNA长度，而且越是紧密连锁的基因其共转导频率也越高。,F为共转导频率，d为基因间距离，L为转导片段长度（这里指噬菌体基因组长度，用分钟表示）,F=(1d/L)3d=L(13F),以thr+leu+为供体，以thr-leu-为受体的P1噬菌体转导实验中，得到1%的thr+leu+转导子，计算thr和leu之间的遗传图距。（P1噬菌体基因组约为大肠杆菌染色体长度的2.4%）d=2.4(130.01)=2.4(1-0.215)=1.883,(2)三点杂交法：P1噬菌体所进行的共转导被广泛应用于大肠杆菌的基因定位中。1955年Lennox用P1噬菌体转导寄主大肠杆菌染色体，研究基因连锁关系时发现，thr和leu有时能、有时不能与第三个基因ara共转导。,他用P1噬菌体感染供体(thr+leu+ara+)，用所得到的噬菌体裂解液去感染受体菌(thr-leu-ara-)，得到的结果。,实验1可知：ara基因与leu基因靠得较近，而与thr基因相距较远，排列顺序应是thr-ara-leu或thr-leu-ara。如果是前一种情况，则thr+leu+转导子应该大多数含有ara+基因；如果是后一种形式，则thr+leu+转导子应该很少含有是ara+，或者根本没有。而由实验2可知，thr+leu+转导子同时又是ara+的占85，所以上述3个基因的排列顺序是第1种。,三、局限性转导(specializedtransduction),局限性转导：是指以噬菌体为媒介，只能将供体菌特定的一个或几个基因转移到受体菌中的转导现象。,导致局限性转导的一般都是温和噬菌体，它们在供体菌染色体上具有特定的整合位点。在某些条件下，当这种整合状的原噬菌体脱离寄主染色体时，偶尔会将整合位点两端相邻的基因错误地切离下来，并组装到噬菌体颗粒中。当这种噬菌体感染另一细菌时，就将原寄主的基因转移到另一细菌中。,1,高频转导的原理,不正常环出形成特殊性转导颗粒,这种缺陷噬菌体亦是转导噬菌体，它具有感染能力，能整合到寄主染色体相同的位点上形成稳定的转导子。,所得转导子的频率约为10-6，称为低频转导。,当携带有gal基因的缺陷噬菌体和正常的噬菌体在同一细胞时，正常噬菌体整合到寄主的染色体上后，产生两个杂合(细菌/噬菌体)att位点，dgal缺陷噬菌体就可以整合到该位点上。,高频转导子的形成,杂基因子,重组性转导,再次整合导致溶源性转导,正常噬菌体帮助dgal缺陷噬菌体整合和繁殖，因此被称为助手噬菌体（helperphage）。这种转导子不稳定，因为原噬菌体很容易被诱导切离下来。在这种切离的裂解物中，有一半是正常噬菌体，另一半为dgal缺陷噬菌体。如果用这种裂解物去转导另一个Gal-菌株，其转化频率理论上可达50%，所以也称之为高频转导。,CRISPR结构及作用机理,CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeat)为规律成簇间隔短回文重复，是一类广泛分布于细菌和古菌基因组中的重复结构。CRISPR通过与一系列相关蛋白、前导序列一起，为原核生物提供对抗噬菌体等外源基因的获得性免疫能力。,这种结构最早于1987年在大肠杆菌(Escherichiacoli)K12的iap基因侧翼序列中被发现，后来，科学家利用这个小片段找到了一种操作简单、可对多种生物的基因组进行遗传改造的工具CRISPRCas系统。后续的遗传学试验和生物化学试验也证实，这些CRISPR序列与很多病毒或者质粒的DNA序列是互补的，很有可能是生物体抵御病毒等外来人侵者的一套特异性防御机制，就像是另外一套适应性免疫反应系统。,CRISPR系统基本结构,CRISPR系统由前导序列（leadersequence，LS）、CRISPR基因座以及一系列Cas（CRISPR-associated）蛋白组成。,Leader序列：Leader序列前导序列由300500bp碱基组成，位于CRISPR的5端，与第一个重复序列直接相连，是一段在物种内相对保守的AT富集的区域。有研究表明前导序列是新插入序列的识别位点，也有研究指出，它能够作为启动子，启动CRISPR基因座的转录。,CRISPR基因座：CRISPR基因座由简短稳定的同向重复序列(directrepect，DR)和长度相近的非重复的间隔序列(spacer)间隔排列而成，称为R-S结构。其中重复序列的片段长度在2148b，且含有57bp的回文序列，通常能形成稳定的茎环结构，间隔序列的长度在2672bp，可能来源于噬菌体、质粒等外源DNA序列。,Cas基因：cas基因是存在于CRISPR位点附近的一系列基因，cas基因簇通常由410个保守基因组成，它表达出的cas蛋白对CRISPR防御机制的实现不可或缺。cas基因根据其保守程度可分为核心cas基因、亚型特异性cas基因和重复序列相关未知蛋白(repeata