分析化学高效液相色谱-HPLC.ppt

第8章高效液相色谱法HPLCHighPerformanceLiquidChromatography,特点：高压、高效、高速高沸点、热不稳定有机及生化试样的高效分离分析方法。,8.1高效液相色谱仪四大部分组成：溶剂输送系统（贮液器，高压泵）进样系统（进样阀等）分离系统（色谱柱等）检测记录系统（检测器，记录仪等）,1.高压输液泵主要部件之一，压力：150350105Pa为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（Rb+K+NH4+Na+H+Li+二价阳离子：Ba2+Pb2+Sr2+Ca2+Cd2+Cu2+Zn2+Mg2+强碱性阴离子交换树脂,保留值大小顺序:PO43-SO42-C2O42-I-HSO4-NO3-CN-NO2-Cl-HCOO-OH-F-CH3COO-,流动相H2O、H2O+乙醇、H2O+pH缓冲剂应用无机离子,有机和生物酸碱。如氨基酸、核酸、蛋白质等,4.尺寸排阻色谱法sizeexclusionchromatographySEC凝胶过滤色谱:水为流动相gelfiltrationchromatgraphyGFC凝胶渗透色谱:非水流动相gelpermeationchromatographyGPC1959年Porath和Flodin发明分离原理:试样分子的尺寸和形状不同来实现分离,GPC流动相:水、四氢呋喃应用:聚合物的分级生物聚合体（蛋白质，核酸，低聚糖,多肽）的分离,8.3色谱分离方法的选择,了解样品的有关性质样品的相对分子质量的大小在水中和有机溶剂中的溶解度、极性和稳定程度化学结构熟悉各种色谱方法的主要特点及其应用范围,1.流动相种类与极性,液相色谱的流动相又称为：淋洗液，洗脱剂它可显著改变组分分离状况选择流动相在液相色谱中特别重要,按组成可分为：单组分和多组分；按极性可分为：极性、弱极性、非极性；按使用方式可分为：固定组成淋洗和梯度淋洗常用溶剂:己烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、水采用二元或多元组合溶剂作为流动相可以灵活调节流动相的极性或增加选择性，以改进分离或调整出峰时间,选择流动相时应注意的几个问题：,（1）尽量使用高纯度试剂作流动相，防止微量杂质长期累积损坏色谱柱和使检测器噪声增加。,（2）避免流动相与固定相发生作用而使柱效下降或损坏柱子。如使固定液溶解流失；酸性溶剂破坏氧化硅固定相等。,（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉淀并在柱中沉积。,（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外检测器时，流动相不应有紫外吸收。,8.4应用实例,方针：要解决一个分析问题，先试反相色谱法C18标准柱，改变流动相调节k（保留行为）和（选择性）,反相色谱法优点：a.色谱柱平衡快，适宜梯度洗脱b.流动相主体为水，甲醇为有机改性剂，价廉易纯化c.tR随溶质的疏水性增加而增大，可预计出峰顺序d.改变基本流动相的pH，添加盐缓冲剂，金属螯和物，手性试剂等，可分离非电离、弱电离、金属离子、手性异构体,多环芳香烃的分析:反相分配色谱法,固定相：十八烷基SiO2,薄壳型流动相：20%CH3OH/H2O100%CH3OH,2%/min流速：1mL/min柱温：50紫外光度检测器（=254nm）,镇痛剂的分析阴离子交换色谱法,固定相：强阴离子交换剂流动相：pH9.2+0.005mol/LNaNO3水溶液流速：1.2mL/min紫外光度检测器,8.4进展柱微型化高柱效高分辨率高选择性快速分离,HighefficiencypCECseparation(500,000plates/m)of14explosivesin7min,Seeref.C.Baliey,C.Yan,Anal.Chem.,1998,70,3275,联用技术,HPLC-AASHPLC-AFSHPLC-ICP-AESHPLC-UV-VisHPLC-ICP-MSHPLC-IR,HPLC联用技术在元素的化学形态分析中的应用,元素的化学形态:元素的生理学毒性大小对环境的污染程度在生命过程中所起的作用如砷化合物毒性大小砷酸As(V)、亚砷酸AS（III)、甲砷酸、二甲砷酸它们对实验大鼠的半数致死量分别为:1.5、5、50、500mg/kg而砷甜菜碱和砷胆碱(AsC)并未发现对大鼠有毒仅仅知道元素的总量是不够的，而需要了解它们的形态。,作业：试从分离的基本原理、基本理论、检测方式以及应用范围等多方面，对液相色谱与气相色谱进行全面比较。,温度：1030；相对湿度：80；最好是恒温、恒湿远离高电磁干扰、高振动设备，有良好的通风设施,8.5HPLC的日常维护与保养,HPLC的日常操作条件：,工作原理：,手柄位在Load位置时，用微量进样针将样品从进样孔注射进入定量环中(定量环充满后，多余样品从放空孔排出)手柄转动至Inject位置时，阀与液相流路接通，由泵输送的流动相冲洗定量环，将样品进入色谱柱中进行分析,1.六通阀进样器的使用及保养,手柄转动要快速：手柄处于Load和Inject之间时，由于暂时堵住了流路，流路中压力骤增，再转到进样位，过高的压力在柱头上引起损坏，应尽快转动阀，不能在中途停留,部分装液法：进样量最多为定量环体积的75要求每次进样体积准确、相同完全装液法：进样量最少为定量环体积的3至5倍将定量环内残留的溶液完全置换样品，达到所要求的精密度及重现性,两种装液方法:,样品必须过滤：用0.45(0.22)m的滤膜过滤防止微粒阻塞进样阀减少对进样阀的磨损进样结束冲洗进样器：用不含盐的稀释剂、水或不含盐的流动相冲洗，在进样阀的Load和Inject位置反复冲洗再用无纤维纸擦净注射器针头的外侧,2.泵的保养,使用流动相尽量要清洁进液处的砂芯过滤头要经常清洗流动相交换时要防止沉淀避免泵内堵塞或有气泡每次分析结束后，要反复冲洗进样口，防止样品的交叉污染,在任何情况下不能碰撞、弯曲或强烈震动色谱柱当色谱柱和色谱仪联结时，阀件或管路一定要清洗干净要注意流动相的脱气避免使用高粘度的溶剂作为流动相进样样品要提纯；严