蛋白质共价修饰.ppt

高级生物化学2011,第5章蛋白质的共价修饰主讲王保莉,第5章蛋白质的共价修饰ProteinCovalentModification,5.1蛋白质的共价修饰5.2蛋白质的可逆磷酸化作用5.3蛋白激酶5.4蛋白磷酸酶5.5蛋白质可逆磷酸化的生物学意义,高级生物化学2011,蛋白质的翻译后修饰，通常是蛋白质在核糖体由RNA翻译出来之后，受到特定的信号的刺激才发生。共价修饰分为两大类，一类是将小分子、或者小的蛋白质通过共价键与蛋白质特定的氨基酸残基结合，另一类是蛋白质主链可以被特定的酶在特定的位置切断，比如MHC复合物识别的短肽段，就需要先利用蛋白酶体将外源的蛋白质切成短肽。蛋白质的共价修饰已经发了四个诺贝尔奖，第一个是1992年发给磷酸化的发现，第二个是2001年CDK/Cyclin介导的磷酸化在细胞周期的功能，第三个是泛素化调控蛋白质降解(化学奖)，第四个是2002年Caspase介导的蛋白质切割和细胞凋亡。,引言,新生多肽链离开核糖体很少是有功能的，多数都必须经过翻译后修饰才会转变为成熟的蛋白质。原核细胞和真核细胞的蛋白质合成分别以甲酰蛋氨酸（fMet）和甲硫氨酸（Met）起始，而成熟蛋白质N-端没有fMet，很少为Met，因为在肽链合成尚未完成时N-端已被去甲酰基酶和氨肽酶修饰过。分泌蛋白和膜蛋白以及线粒体和叶绿体蛋白均以前体形式合成，N-端的信号序列在分拣运输中已被切除。许多蛋白质要分别经过甲基化、羟基化、糖基化、羧基化、磷酸化、乙酰化、脂酰化和异戊烯基化等共价修饰。本章将重点介绍蛋白质可逆磷酸化作用。,新合成多肽链加工,原核生物和真核生物的一些新生蛋白质都需要经过翻译后修饰的一次或多次加工反应才最终获得具有生物活性的构象。包括：氨基末端和羧基末端的修饰信号序列的切除个别氨基酸的修饰糖类侧链的连接异戊二烯基团的添加辅基的加入蛋白酶的加工二硫键的形成,个别氨基酸的修饰,-羧基谷氨酸三甲基赖氨酸甲基谷氨酸,糖蛋白中常见的糖-肽连接键,以GalNAc和GlcNAc为例GalNAc：乙酰氨基半乳糖GlcNAc：乙酰氨基葡萄糖,辅基的加入,共价连接的辅基是许多原核和真核蛋白质发挥活性所必需的。乙酰CoA羧化酶的生物素和细胞色素c中的血红素基团。乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoAcatboxylase)催化:乙酰CoAATPHCO3-丙二酰CoA+ADPPi生物素酶。,FIGURETheacetyl-CoAcarboxylasereaction.Acetyl-CoAcarboxylasehasthreefunctionalregions:biotincarrierprotein(gray);biotincarboxylase,whichactivatesCO2byattachingittoanitrogeninthebiotinringinanATP-dependentreaction;andtranscarboxylase,whichtransfersactivatedCO2(shadedgreen)frombiotintoacetyl-CoA,producingmalonyl-CoA.,Thelong,flexiblebiotinarmcarriestheactivatedCO2fromthebiotincarboxylaseregiontothetranscarboxylaseactivesite,asshowninthediagramsbelowthereactionarrows.Theactiveenzymeineachstepisshadedblue.,蛋白酶的加工,许多蛋白质的初始合成产物很大，这种无活性的蛋白质前体经蛋白酶的作用，产生较小的有活性的蛋白质。例如：胰岛素、一些病毒蛋白质、胰蛋白酶和胰凝乳蛋白酶,蛋白酶切的酶原激活,胰凝乳蛋白酶原,胰蛋白酶原,胰蛋白酶,肠肽酶,5.1蛋白质的共价修饰,5.1.1蛋白质前体的加工性部分水解5.1.2氨基酸残基的修饰5.1.3蛋白质与脂类共价结合5.1.4泛素化及泛素样修饰5.1.5组蛋白的共价修饰,5.1.1蛋白质前体的加工性部分水解,酶原的激活、前体在分拣运输中发生裂解切去N-端的信号序列。动物细胞内有多种加工性蛋白酶，如弗林蛋白酶（furin）和前激素转换酶PC1、PC2、PC3，能识别前体分子中的双碱性序列-RR-、-KR、-KK-等，从其羧基一侧切断肽链。furin负责细胞中组成型表达的蛋白前体加工PC1、PC2、PC3负责受调控的激素前体的切割加工。前体蛋白转化酶(proproteinconvertases,PC)：切割前体蛋白，促进前体蛋白获得生物活性的一类同源蛋白。,1.Furin蛋白酶（结构特点和特性）,1989年发现，由794个氨基酸组成的I型跨膜蛋白。一种广泛存在的类似枯草杆菌蛋白酶的蛋白质前体转化酶。分泌途径的主要加工酶，定位于高尔基体反面的网状结构部位。底物包括：凝血因子、血清蛋白和生长因子受体（如：IGF受体）。最短的切割识别位点：Arg-X-X-Arg。倾向作用于Arg-X-(Lys/Arg)-Arg位点。Furin活性受EGTA、1-抗胰蛋白酶硅酸盐和聚精氨酸化合物抑制。,I型跨膜蛋白：一次跨膜，多肽链的N端在胞膜外，C端在胞内。,2.胰岛素（insulin),胰岛素在细胞中以前胰岛素原的形式合成，进入ER-Golgi系统中先切去N-端的信号肽，重排二硫键，形成正确折叠的胰岛素原。在分泌小泡中由PC2和PC3切去中间的C肽，产生的A链与B链由两个二硫键相连，再切去B链C-端两个精氨酸，成为成熟的胰岛素。C肽含有指导胰岛素原正确折叠的信息PC2和PC3的加工可能与调控胰岛素分泌有关。,Inbetacells,insulinissynthesizedfromtheproinsulinprecursormoleculebytheactionofproteolyticenzymes,knownasprohormoneconvertases(PC1andPC2),aswellastheexoproteasecarboxypeptidaseE.Thesemodificationsofproinsulinremovethecenterportionofthemolecule(ie,C-peptide),fromtheC-andN-terminalendsofproinsulin.Theremainingpolypeptides(51aminoacidsintotal),theB-andA-chains,areboundtogetherbydisulfidebonds/disulphidebonds.,Insulin:Synthesisandpost-translationalmodification,Effectofinsulinonglucoseuptakeandmetabolism.,Insulinbindstoitsreceptor(1)whichinturnstartsmanyproteinactivationcascades(2).Theseinclude:translocationofGlut-4transportertotheplasmamembraneandinfluxofglucose(3),glycogensynthesis(4),glycolysis(5)andfattyacidsynthesis(6).,脑垂体细胞合成的前阿片促黑皮质素（POMC）在垂体前叶中被加工成-促脂解素（-LPH）和促肾上腺皮质激素（ACTH）；在垂体中间叶则被加工成-促黑素（-MSH）、-LPH、内啡肽和中间叶促皮质样肽（CLIP）。通过组织专一的加工，一个基因编码的前体在不同组织中按严格的比例产生多种不同的生理活性产物，具有重要的生理意义。Pro-opiomelanocortin前阿黑皮素LPH:脂肪酸释放激素(lipotropichormone，lipotropin)CLIP:Corticotropin-likeintermediatepeptideACTH:AdrenocorticotropichormoneMSH:Melanocyte-stimulatinghormoneEndorphin:内啡肽,3.多蛋白前体的水解裂解,垂体前叶,垂体中间叶,在垂体前叶：促黑素-MSH、促脂解素-LPH和促肾上腺皮质激素ACTH。在垂体中间叶：促黑素-MSH、中间叶促皮质样肽CLIP；促脂解素-LPH和内啡肽。,4.蛋白质剪接(proteinsplicing)：外显肽（exteins）和内含肽（inteins）,蛋白质剪接是蛋白质内含肽介导的，一种在蛋白质水平上翻译后的加工过程,它由一系列分子内的剪切-连接反应组成。蛋白质内含肽是一个蛋白质前体中的多肽序列，可以催化自身从蛋白质前体中断裂，使两侧的蛋白质外显肽连接成成熟的蛋白质。,Seriesofreactionscatalyzedbyinteinstosplicethemselvesoutofapolypeptidechain.,1.AttackbytheN-terminalinteinresidue(Ser,Thr,orCys;showninFig.asSer)onitsprecedingcarbonylgroup,yieldingalinear(thio)esterintermediate.线性酯中间物2.Atransesterification酯交换reactioninwhichthe-OHor-SHgroupontheC-exteinsN-terminalresidue(showninFig.asSer)attackstheabove(thio)esterlinkage,therebyyieldingabranchedintermediateinwhichtheN-exteinhasbeentransferredtotheC-extein.分支中间物,3.CleavageoftheamidelinkageconnectingtheinteintotheC-exteinbycyclizationoftheinteinsC-terminalAsnorGln(showninFig.asAsn).通过内含肽C-端AsnorGln的环化打开连接外显肽的酰胺键4.Spontaneous自发rearrangementofthe(thio)esterlinkagebetweentheligatedexteinstoyieldthemorestablepeptidebond.,5.1.2氨基酸残基的修饰,1.乙酰化2.甲基化3.酰胺化4.-羧基化,1.乙酰化,人体内约50%左右的蛋白质末端氨基被乙酰化，以延长其在细胞内的半寿期，是细胞内蛋白质翻译后修饰的一种重要形式。蛋白质乙酰化修饰类型：N端氨基酸修饰：N末端-乙酰化通常是翻译中同时发生的，一般发生在新生肽链大约40个残基长的时候。由NAT(N-乙酰转移酶)催化。赖氨酸氨基乙酰化修饰组蛋白乙酰化修饰位点其他氨基酸的乙酰化修饰丝氨酸和苏氨酸侧链的羟基可以被乙酰化修饰。,AcetylCH3-C(=O)-,在甲基转移酶催化下，在赖氨酸或精氨酸侧链氨基上进行的甲基化。甲基化增加了立体阻力，并且取代了氨基的氢，影响了氢键的形成。甲基化可以调控分子间和分子与目标蛋白的相互作用。肌动蛋白、钙调素、细胞色素c等少数几个蛋白中发现组氨酸的N-3和赖氨酸-氨基可被甲基化。甲基由S-腺苷基蛋氨酸转移至组织蛋白是由组织蛋白甲基转移酶所催化。蛋白质甲基化是其中一种后翻译修饰。,2.甲基化,3.酰胺化,有些蛋白质的羧基端的甘氨酸被酰胺化，以免被羧肽酶降解。反应分为两步；先是甘氨酸羟基化，然后脱去1分子乙醛酸，并产生新的酰胺化羧基端。有些蛋白质N-端谷氨酸残基的氨基可与其-羧基脱水形成焦谷氨酸，以消除N-端氨基。,NH2-CH(R1)-CO-NH-CH2-COOHNH2-CH(R1)-CO-NH-CH(OH)-COOH甘氨酸羟基化NH2-CH(R1)-CO-NH2+CHO-COOH酰胺化羧基端,(RC(=O)-NH-),4.-羧基化,在凝血酶原以及凝血因子、中均发现谷氨酸残基-羧基化。反应由依赖维生素K的羧化酶催化，形成-碳上有两个羧基，能与Ca2+螯合，在凝血中起重要作用。,5.脯氨酰和赖氨酰的羟基化,胶原新生肽链在内质网腔内首先在脯氨酰-4-羟化酶（识别-Gly-x-Pro-）和赖氨酰羟化酶（识别-Gly-x-Lys-）催化下，生成4-羟脯氨酰和-羟赖氨酰Hyl，再由脯氨酰-3-羟化酶（识别-Gly-Pro-Hyp-）把中间的脯氨酰3-羟基化，然后Hyl再糖基化，才能形成三股螺旋前胶原。分泌到胞外后，切去N-端和C-端肽段，变为成熟的原胶原。原胶原自发聚合形成胶原微纤维。羟赖氨酰氧化酶催化Hyl形成醛赖氨酰，两个醛赖氨酰缩合成醇醛，进一步与His和Hyl残基反应形成链间共价交联，成为稳定和强度高的胶原蛋白。,6.ADP-核糖基化,蛋白质的ADP-核糖基化普遍存在于各类生物。哺乳动物核外蛋白质以单ADP-核糖基化为主，ADP-核糖基转移酶从NAD+中把ADP-核糖基转移到Arg、Asn或His的修饰产物白喉酰胺的侧链N原子上。,核内蛋白大多发生多聚ADP-核糖基化：ADP-核糖基聚合酶（poly(ADP-ribose)polymerase,PARP）先将NAD+中的ADP-核糖基转移到Glu侧链羧基上，再不断添加ADP-核糖基，形成含有数百个ADP-核糖且有分枝的多聚ADP-核糖。PARP自己就以这种方式修饰，并参与DNA断裂的修复。白喉毒素、百日咳毒素和霍乱毒素等具有ADP-核糖基转移酶活性，分别把ADP-核糖基转移到白喉酰胺、Cys和Arg残基上。diphthamide白喉酰胺,5.1.3蛋白质与脂类共价结合,1.蛋白质与糖基肌醇磷脂（glycosylphosphatidylinositol,GPI）共价结合2.豆蔻酰化3.棕榈酰化4.C-端异戊烯基化,棕榈酰基通过硫酯键与Cys相连N-肉豆蔻酰基与氨基端的Gly相连与羧基端Cys残基相连的是含15-C和20C的类异戊二烯的法呢基或牻牛儿牻牛儿基糖基磷脂酰肌醇：GPI,GPI锚定蛋白,与脂结合的膜蛋白,外侧,内侧,1.蛋白质与糖基肌醇磷脂（glycosylphosphatidylinositol,GPI）共价结合,某些蛋白质新生肽链的停止转运肽位于C-端，被内质网转肽酶切除后，生成新的C-端在膜中与糖基磷脂酰肌醇GPI的氨基反应，以酰胺键与GPI连接定位于内质网膜内侧，然后运到质膜成为膜锚蛋白。哺乳动物至少有50多种蛋白以此种方式与膜结合，包括水解酶、受体、粘附分子、补体抑制因子和功能不详的表面抗原等。,GPI是由膜中组分PI糖基化再与磷酸乙醇胺结合而成的，合成途径酶缺陷将导致细胞表面GPI结合蛋白缺乏。,2.豆蔻酰化,在N-端豆蔻酰转移酶催化下，有些蛋白质H2N-Gly-x-x-x-Ser/Thr-Lys（Arg）-Lys（Arg）-的N-端氨基酸以酰胺键与一个豆蔻酰基相连，并以此插入脂双层成为一种膜锚蛋白。G蛋白亚基、Src或介导小泡运输的Arf均以这种方式与质膜或小泡膜结合。这种修饰是伴翻译的，不可逆。,Arf:ADP-ribosylationfactorSrc:非受体酪氨酸蛋白激酶家族成员,3.棕榈酰化,棕榈酰基转移酶可将棕榈酰基转移至一些肽链C-端附近的Cys残基上，使之成为膜锚蛋白；经硫酯酶水解切去棕榈酰基重新成为可溶性胞质蛋白。这种细胞定位的改变与其功能调节有密切关系。,4.C-端异戊烯基化,一些C-端为-C-xx-S/M/Q-COOH的肽链，在酶催化下从法尼基焦磷酸上把含3个异戊二烯单位的法尼基转移到Cys残基S原子上，再由水解酶切掉Cys后面的残基，产生的新羧基端又被甲基化，通过法尼基把蛋白质锚定在膜上。,Ras蛋白以这种方式与膜结合，如阻断其法尼基化反应，也就阻断了它与膜的结合，从而逆转Ras转化细胞的功能。C-端为-CC、-CxxL或-CxC的肽链不进行法尼基化而发生牻牛儿牻牛儿基化，在Cys的S原子上连接由4个异戊二烯单位聚合而成的牻牛儿牻牛儿基。疏水尾巴越长，膜锚蛋白与膜的结合越牢固。,5.1.4泛素化及泛素样UBL修饰,泛素(Ub)是一种含76个氨基酸的多肽，存在于除细菌外的许多不同组织和器官中，具有标记待降解蛋白质的功能。与磷酸化修饰过程一样，泛素化修饰过程也是一种可逆的共价修饰过程，它能够调节被修饰蛋白的稳定性、功能活性状态以及细胞内定位等情况。,科学网：蛋白质泛素化研究进展探索蛋白修饰的秘密,泛素蛋白连接机制,蛋白质的SUMO化修饰,SUMO:smalluniquitin-relatedmodifier为类泛素蛋白家族成员，可与多种蛋白质结合发挥相应的功能。参与转录调节、核转运、维持基因组完整性、及信号传导等。,5.1.5组蛋白的共价修饰,磷酸化和去磷酸化乙酰化和去乙酰化甲基化和去甲基化泛素化和去泛素化,组蛋白是染色体的基本单位核小体的蛋白质组成部分，在进化上十分保守。真核生物的染色体上主要含有5种组蛋白，即核心组蛋白H2a、H2b、H3、H4及连接组蛋白H1。核心组蛋白八聚体、蛋白H1和200bp的DNA共同组成了核小体。,组蛋白修饰的结构基础,组蛋白修饰的结构基础,5种组蛋白中，除H1的N端富含疏水氨基酸，C端富含碱性氨基酸之外，其余4种都是N端富含碱性氨基酸(如精氨酸、赖氨酸)，C端富含疏水氨基酸(如缬氨酸、异亮氨酸)。在组蛋白中带有折叠基序(motif)的C端结构域与组蛋白分子间发生相互作用，并与DNA的缠绕有关。N端可同其他调节蛋白和DNA作用，且富含赖氨酸，具有高度精细的可变区。组蛋白N端尾部的1538个氨基酸残基是翻译后修饰的主要位点，调节DNA的生物学功能。,组蛋白修饰、组蛋白密码与表观遗传学,单一组蛋白的修饰往往不能独立地发挥作用，一个或多个组蛋白尾部的不同共价修饰依次发挥作用或组合在一起，形成一个修饰的级联，它们通过协同或拮抗来共同发挥作用这些多样性的修饰以及它们时间和空间上的组合与生物学功能的关系可作为一种重要的表观标志或语言，也被称为“组蛋白密码”(histonecode)。组蛋白修饰与DNA甲基化、染色体重塑和非编码RNA调控等，在基因的DNA序列不发生改变时，使基因的表达发生改变，并且这种改变还能通过有丝分裂和减数分裂进行遗传，这种遗传方式是遗传学的一个分支，被称为“表观遗传学”。组蛋白密码扩展了DNA序列自身包含的遗传信息，构成了重要的表观遗传学标志。,HistoneModificationandRemodelingPlayanEssentialRoleinTranscriptionalActivation,Histonemodificationsonthenucleosomecoreparticle.,Posttranslationalmodificationsitesareindicatedbytheresiduenumbersandthecoloredsymbols,whicharedefinedinthekeyatthelowerleft(acKacetyl-Lys,meRmethyl-Arg,meKmethyl-Lys,PSphospho-Ser,anduKubiquitinatedLys).NotethatH3Lys9canbeeithermethylatedoracetylated.TheN-terminaltailmodificationsareshownononlyoneofthetwocopiesofH3andH4andonlyonemoleculeeachofH2AandH2Bareshown.TheC-terminaltailsofoneH2AandoneH2Barerepresentedbydashedlines.Thegreenarrowsindicatethesitesinintact完整nucleosomesthataresusceptibleto易被trypsincleavage.,Histone-ModifyingEnzymes,thesitesformodificationaremarkedincolor,组蛋白修饰的调节,组蛋白的不同化学修饰之间相互作用，不仅表现为同种组蛋白不同残基的一种修饰能加速或抑制另一修饰的发生，并且在影响其他组蛋白残基的同时，也受到另外组蛋白残基修饰的调节。另一方面，组蛋白上相同氨基酸残基不同修饰之间也会发生协同或者拮抗。同一组蛋白的不同修饰类型之间发生相互影响称顺式作用，不同组蛋白的修饰之间发生的相互影响称反式作用。,1.磷酸化与去磷酸化组蛋白磷酸化在有丝分裂、细胞死亡、DNA损伤修复、DNA复制和重组过程中发挥着直接的作用。例如，组蛋白H3N端的磷酸化可能促进染色质在有丝分裂期间的凝集。组蛋白H1被细胞周期蛋白依赖的激酶磷酸化是其翻译后主要的修饰作用。组蛋白H1的磷酸化能够影响DNA二级结构的改变和染色体凝集状态的改变。另一方面，组蛋白H1的磷酸化需要DNA的复制，并且激活DNA复制的蛋白激酶也促进组蛋白H1的磷酸化。因此，组蛋白H1磷酸化与DNA的复制存在一个协同发生的机制。,组蛋白相同残基修饰之间的调节,2.组蛋白的乙酰化和去乙酰化,组蛋白乙酰化与去乙酰化，分别是由组蛋白乙酰转移酶(HAT)和去乙酰化转移酶(HDAC)催化的。HAT和HDAC催化的乙酰化反应在真核生物基因的表达调控中起着重要作用，这两种酶通过对核心组蛋白进行可逆修饰来调节核心组蛋白的乙酰化水平，从而调控转录的起始与延伸。一般来说，组蛋白的乙酰化促进转录，而去乙酰化则抑制转录。,组蛋白相同残基修饰之间的调节,核心组蛋白N端的末端富含赖氨酸，生理条件下带正电，它可与带负电的DNA或相邻的核小体发生作用，导致核小体构象紧凑及染色质高度折叠。乙酰化使组蛋白与DNA间的作用减弱，导致染色质构象松散，这种构象有利于转录调节因子的接近，从而可以和转录因子结合，促进基因的转录。,HAT催化的组蛋白Lys的乙酰化和脱乙酰化,Legube等提出，调控HAT和HDAC的机制主要分为三类，即调节酶量、调节酶活性、调节与特异性转录因子相互作用.,3.组蛋白的甲基化和去甲基化修饰,组蛋白甲基化由特异的组蛋白甲基转移酶和脱甲基酶协调催化完成，是一个可逆的动态修饰过程。,组蛋白相同残基修饰之间的调节,（1）组蛋白赖氨酸甲基化,组蛋白赖氨酸甲基化发生在H3-K4、H3-K9、H3-K27、H3-K36、H3-K79和H4-K20上，还可发生于H1N端。H3-K9、H3-K27、H4-K20的甲基化与染色体的钝化过程有关，而H4-K9的甲基化可能与大范围的染色质水平的抑制有关。H3-K4、H3-K36、H3-K79位的甲基化与染色体转录激活过程有关，其中H3-K4的单甲基化修饰可以对抗H4-K9甲基化所导致的基因抑制。,（2）组蛋白精氨酸甲基化,组蛋白精氨酸甲基化位点为H3-R2、H3-R4、H3-R17和H3-R26，它们都可以增强转录。组蛋白组蛋白的甲基化修饰主要是由一类含有SET结构域的蛋白来执行的。,HistoneMethylation,SET蛋白是一类包含保守的SET结构域、与组蛋白甲基化密切相关的蛋白质。,4.组蛋白的泛素化与去泛素化修饰,组蛋白泛素化也是可逆转的调控。组蛋白泛素化的动态平衡过程由两个因素决定：细胞内可以利用的游离泛素、组蛋白泛素化或去泛素化酶的活性。组蛋白泛素化需要一系列酶E1、E2、E3的作用，而组蛋白去泛素化则需要肽酶的作用。组蛋白H2A泛素化修饰位点是高度保守的H2AK119位点。除了H2A以外，组蛋白H2B也可以被泛素化修饰。H2B的泛素化位点也定位于C端的赖氨酸残基：哺乳动物的H2BK120位点，芽殖酵母的H2BK123位点。,泛素化形式的H3不多，仅在大鼠睾丸变态的精子细胞中发现。相比而言，组蛋白H3、H1的泛素化形式比H2A、H2B少，目前也还没有发现组蛋白H3、H1的泛素化位点。泛素部分可以通过泛素76位点甘氨酸的肽键水解而去除。目前发现至少有90种去泛素化酶，并且这些酶有序列多样性。去泛素化酶分为两个家族，泛素羧基端水解酶家族(UbC-terminalhydrolase，UCH)和泛素特异性加工蛋白酶家族(Ub-specificprocessingprotease，UBP)。,5.2蛋白质的可逆磷酸化作用概述,5.2.1蛋白质可逆磷酸化作用的特点5.2.2可逆磷酸化作用调节蛋白质活性的机制,蛋白质的磷酸化和去磷酸化作用,蛋白质可逆磷酸化概念,磷酸化反应是泛指把磷酸基团通过酶促反应转移到其他化合物的过程。蛋白质的磷酸化则是指由蛋白激酶催化的把ATP或GTP位的磷酸基转移到底物蛋白质氨基酸残基上的过程，其逆转过程是由蛋白磷酸酶催化的，称为蛋白质的脱磷酸化。,蛋白质可逆磷酸化修饰是调控各种各样生物学功能的通用机制,1955年美国生化学家KrebsE.G.和FischerE.H.发现糖原磷酸化酶的调节机制，并因此获得1992年诺贝尔生理医学奖。受这种方式调控的许多生理生化过程：基因的复制和转录，分子识别和信号转导，蛋白质的合成与降解，物质代谢与跨膜运输，细胞形态建成与肌肉收缩，细胞周期的运转，细胞增殖与分化，肿瘤发生以及包括学习记忆在内的高级神经活动等等。蛋白质的可逆磷酸化是许多信号转导途径实现其生物学功能的枢纽（图5.1）。,5.2.1蛋白质可逆磷酸化作用的特点,磷酸化是目前已知的最主要的调节修饰方式：真核细胞的1/3到1/2处于磷酸化状态。一些蛋白质只有一个磷酸化残基，一些则有几个，少数蛋白质有几十个磷酸化位点。原核细胞通过蛋白质可逆磷酸化进行调控的生理生化过程相对较少。随着生物进化，越是高等生物这种调节方式的使用越普遍，表明蛋白质可逆磷酸化作用具有显著的优势和特殊的重要性。,蛋白质可逆磷酸化特点,（1）专一性强胞外信号经胞内信使控制蛋白激酶和蛋白磷酸酶的活性，通过对特定靶蛋白进行可逆的磷酸化修饰调节细胞生理过程，与别构调节相比显然较少受胞内代谢物的影响，能较专一地对胞外刺激作出准确的应答。,在胞内介导胞外信号时具有专一应答特点。与信号传递有关的蛋白激酶类主要受控于胞内信使，如cAMP，Ca2+，DG（二酰甘油，diacylglycerol）等，这种共价修饰调节方式显然比变构调节较少受胞内代谢产物的影响。,（2）级联放大效应信号转导过程包括一系列连锁反应，前面的反应对下一步的酶进行可逆磷酸化修饰，从而使微弱的原始信号逐级放大，同时级联系统各层次的可调控性增强了对生理生化过程的调控作用。,（3）节省而有效的调节可逆的磷酸化使被修饰的蛋白质激活或被“冻结”，在不改变蛋白质总量的情况下，只需消耗很少的ATP，就能有效地调节活性蛋白质的含量。与重新合成和分解相比，这种方式使细胞得以快速、有效、节省地对外界刺激作出反应。（4）功能上的多样性调节酶活性；导致亚细胞定位改变；从磷蛋白为胚胎发育提供营养到调控细胞的生长发育、分裂分化、基因表达甚至癌变，都有蛋白质可逆磷酸化的参与。,（5）持续的时效蛋白激酶一旦被激活，即通过自身磷酸化等方式把活性维持较长的时间，被它们磷酸化的靶蛋白则可更长久地维持其效应，直至被蛋白磷酸酶脱去磷酸。（6）时空上的精确性每种蛋白质的磷酸化修饰具有自己的细胞周期特异性、发育阶段周期性、种属和组织分布的特异性，从而呈现出特有的时空分布模式。,调节蛋白的丝氨酸、苏氨酸或酪氨酸的磷酸化常发生在共同结构基序中，称共有序列，该序列可被特异的蛋白激酶所识别,B:任意的疏水氨基酸X:任意氨基酸红色：经历了磷酸化的残基Sp,Tp,Yp:已经被磷酸化的残基,糖原合酶的多重调节的磷酸化作用,在易于细胞蛋白激酶磷酸化的糖原合酶的5个区域内，至少有9个独立的磷酸化部位。因此，酶的活性受到不同信号的调节，是一种大范围的精细调节。,Casein酪蛋白,5.2.2可逆磷酸化作用调节蛋白质活性的机制,通过可逆磷酸化向蛋白质大分子中引入或去掉一个或不多几个共价结合的磷酸基，可使其生物学活性发生转变，二者关系可以归纳为以下几种：单一部位磷酸化导致单一功能的变化如肝细胞糖原磷酸化酶中Ser14被磷酸化之后即可从钝化状态变成活化构象，催化糖原的磷酸解。多部位磷酸化导致单一功能的变化，肝细胞中的糖原合酶Ser7和Ser10分别被AMPK和PKA磷酸化而钝化。,多部位磷酸化分别导致不同功能的变化如转录因子STAT1的单体为钝化状态，当被受体结合的JAK将其Tyr701磷酸化后，有了二聚化和核转位的能力，再经MAPK将其Ser727磷酸化，才会充分活化，刺激靶基因的转录。单一部位磷酸化导致多个不同功能的变化如肝细胞中的果糖6-磷酸激酶-2（PFK-2）/果糖2,6-二磷酸酶（FBPase-2），Ser32的磷酸化导致激酶活性的钝化和磷酶酶活性的活化。,单一部位磷酸化导致单一功能的变化-肝细胞糖原磷酸化酶,磷酸化酶a是酶的高活性形式，各亚基上有一个特定的丝氨酸残基被磷酸化。磷酸化酶磷酸酶催化磷酸化酶a脱磷酸变为酶的低活性形式-磷酸化酶b。磷酸化酶b通过磷酸化酶激酶的作用重新转化为磷酸化酶a,糖原磷酸化酶的调节,受控于多级水平的调节。对称性的糖原磷酸化酶a的共价修饰调节：黄色：Ser14的磷酸化暗蓝色：被AMP别构激活部位红色：连接在活性部位的葡萄糖亮蓝色：磷酸吡多醛PLP，结合性辅因子,单一部位磷酸化导致多个不同功能的变化-果糖-2，6-二磷酸是糖酵解和糖异生的调节物,Fructose2,6-BisphosphateIsaPotentRegulatorofGlycolysisandGluconeogenesisThehormonalregulationofglycolysisandgluconeogenesisismediatedbyfructose2,6-bisphosphate,anallostericeffectorfortheenzymesPFK-1andFBPase-1,Roleoffructose2,6-bisphosphateinregulationofglycolysisandgluconeogenesis.,Regulationoffructose2,6-bisphosphatelevel.(a)Thecellularconcentrationoftheregulatorfructose2,6-bisphosphate(F26BP)isdeterminedbytheratesofitssynthesisbyphosphofructokinase-2(PFK-2)andbreakdownbyfructose2,6-bisphosphatase(FBPase-2).,Regulationoffructose2,6-bisphosphatelevel.（b)Bothenzymesarepartofthesamepolypeptidechain,andbothareregulated,inareciprocalfashion彼此相反的方式,byinsulinandglucagon胰高血糖素.,多部位磷酸化分别导致不同功能的变化-信号转导和转录激活子STAT（STATprotein）,Fu等（1992）发现信号转导和转录激活子(signaltransducerandactivatoroftranscription,STAT)已在哺乳动物细胞分离和纯化的STAT蛋白家族成员：STAT1/、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5A、STAT5B及STAT6。参与了许多细胞因子的信号转导，对细胞的生长、分化、炎症和免疫反应等产生重要影响。,STAT蛋白组成,STAT蛋白家族成员具有类似的氨基酸序列，分子量在84-113kD范围内，由750-850个氨基酸组成。STAT2和STAT6大约为850个氨基酸,而STAT1、STAT3、STAT4、STAT5A和STAT5B约有750-790个氨基酸。,STAT的功能区主要包含三部分：（1）SH2结构域（2）DNA结构域（3）转录激活域。,STAT蛋白结构,（1）SH2结构域位于STAT氨基末端第600-700氨基酸残基序列高度保守区，它介导STAT与活化受体的酪氨酸残基相结合,并通过JAK激酶（januskinase,JAK）家族，使STAT磷酸化，然后形成二聚体，即与受体分离，转位入核，结合到靶基因的启动子或增强子序列上，从而调节基因的表达。,STAT蛋白结构,（2）DNA结合域位于STAT氨基末端第400-500氨基酸残基序列，直接决定STAT与DNA的结合。（3）转录激活域位于羧基末端，约40个氨基酸残基组成，STAT1、STAT3、STAT4和STAT5含有一个保守的脯氨酸-蛋氨酸-丝氨酸-脯氨酸序列，其中丝氨酸的磷酸化决定了STAT的转录活性。,在所有STAT的氨基末端，约50个氨基酸残基组成的保守序列参与DNA的结合,并与STAT的磷酸化能力有关；STAT氨基端的第701位氨基酸为酪氨酸磷酸化位点，与STAT的活化有关；位于STAT氨基末端第500-600氨基酸残基序列被称为SH3结构域，其呈现该家族的高度保守性。,STAT蛋白结构,可逆磷酸化作用调节蛋白质活性的分子机制从目前研究的水平可从下述几方面予以说明：,1.磷酸化导致蛋白质整体构象变化,磷酸化位点虽然远离活性部位，导入一个负电基团带来的结构信息经远距离的构象传导使得活性部位的构象发生巨大改变。许多别构酶的磷酸化位点在远离催化部位的N-端或C-端。以肝细胞糖原磷酸化酶为例Glycogenphosphorylase,肝细胞糖原磷酸化酶结构特点,亚基由842个氨基酸组成N-端结构域（1-484位）含有磷酸化位点（Ser14）、AMP和ATP等效应剂结合部位和糖原停靠部位；C-端结构域（485-842）Lys680共价连接一个辅因子磷酸吡哆醛，活性中心Arg569在结构域界面处。钝化状态（GPb）：非磷酸化的二聚体活化形式（GPa）：磷酸化的二聚体，磷酸化的Ser14距活性中心约3.5nm。,GlycogenPhosphorylase,ahomodimericenzymesubjecttoallostericcontrol,exhibitstransitionsbetweenrelaxed(active)andtense(inhibited)conformations.,对GPa和GPb晶体结构进行的解析表明，磷酸化之后的构象变化：(1)GPb的N-端形成两个-螺旋夹一个帽状结构（1-cap-2），位于亚基界面；磷酸化之后Ser14-Pi与另一亚基帽状结构中的Arg43相互作用，将它拉向自己的螺旋，产生一个对别构激活剂AMP高亲和力的结合部位。(2)在GPb中活性部位离分子表面约1.5nm，残基282-286形成的环阻塞了活性中心通道，把Arg569隔在内部；磷酸化导致上述环移开，使活性中心暴露。,肝细胞糖原磷酸化酶磷酸化之后引发了巨大的构象变化,2.磷酸化导致功能部位区域构象发生变化,当磷酸化部位靠近功能部位时，引入的磷酸基团与功能区域某个或某些残基相互作用，导致功能部位构象的改变或调整。例如:PKA催化亚基呈双叶瓣结构，活性中心在两个叶瓣之间的裂隙底部。在催化部位附近的Thr197是其自身磷酸化位点，Thr197-Pi与催化残基Asp166以及相邻的Asp165相互作用，还与上下叶瓣的某些残基（如His87、Lys189）也相互作用，使催化部位呈更为紧凑的结构。,3.磷酸基的位阻效应导致功能丧失,有些蛋白质被磷酸化后构象并未发生明显改变，但由于引入的磷酸基团的位阻效应而丧失其功能。例如：异柠檬酸脱氢酶Ser113磷酸化后活性中心的构象并未变化，但是Ser113-Pi占据了底物异柠檬酸一个羰基的位置，因而丧失活性。,4.磷酸化为其他蛋白质提供了识别标志,含有SH2结构域的下游蛋白可以识别上游蛋白磷酸化的酪氨酸，在下一章中这样的例子很多。SH2（Srchomology2）结构域：特异性结合磷酸化的酪氨酸残基。,SH2（Srchomology2）结构域,最先发现于Src家族蛋白质酪氨酸激酶，由大约100个氨基酸组成，两侧为两个-螺旋，中间是由5个短的-股形成的两个片层，特异性结合磷酸化的酪氨酸残基。SH2结构域识别的特异性取决于靶分子磷酸化酪氨酸残基及其羧基一侧3-5个氨基酸，特别是+3位置必须是疏水性氨基酸残基。靶蛋白上这个酪氨酸如果发生突变就丧失了与SH2结合的能力，而酪氨酸羧基一侧氨基酸的差异使之能与不同的SH2结构域结合，形成了相互作用的个性特色。,SH3（Srchomology3）结构域,最早也发现于Src家族分子中，由50-100个氨基酸组成，结合富含脯氨酸的序列，从而介导蛋白与蛋白相互作用。TheSH3domainhasacharacteristicbeta-barrelfoldwhichconsistsoffiveorsix-strandsarrangedastwotightlypackedanti-parallelsheets.SH3通常识别PxxP模体，近旁如果有Ser或Thr磷酸化可阻断SH3结合。-X-P-p-X-P-,5.3蛋白激酶（proteinkinase),5.3.1蛋白激酶的一般特征5.3.2蛋白激酶的分类5.3.3代表性的蛋白激酶,引言-1蛋白激酶的类型,蛋白激酶是能把磷酸基供体如ATP的-磷酸基团转移到靶蛋白氨基酸受体上的酶类。国际生化与分子生物学学会根据底物蛋白氨基酸残基的性质把蛋白激酶划分成5类：丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶（S/TPK），磷酸基受体是Ser或Thr的侧链羟基；酪氨酸蛋白激酶（PTK），磷酸基受体是Tyr的苯环羟基；组氨酸/赖氨酸/精氨酸蛋白激酶（H/K/RPK），磷酸基受体分别是His的咪唑环、Lys的-氨基和Arg的侧链胍基；半胱氨酸蛋白激酶，磷酸基受体是Cys侧链巯基；天冬氨酸/谷氨酸蛋白激酶，磷酸基受体是其侧链羧基。目前研究得较多的是S/TPK和PTK，其余几类不仅研究得不多，而且与前两类差异甚大。,引言-2最大的基因家族之一,在已经解密的物种基因组中，蛋白激酶家族都是最大的基因家族之一。蛋白激酶家族是人类基因组中第三大基因家族；在果蝇和线虫基因组中是第二大基因家族；在拟南芥和酵母基因组中位居第一。有许多蛋白激酶基因还能从不同的启动子开始转录，或对mRNA前体进行差异剪接，结果形成了更多的亚型，进一步扩大了蛋白激酶的家族。,表5.1不同物种蛋白激酶基因数量的排名比较,5.3.1蛋白激酶的一般特征,1.蛋白激酶催化域：12个保守的亚区S/TPK和PTK是蛋白激酶家族中两个已知的最大的超家族，它们的催化域在结构和进化上有相当大的保守性。典型的蛋白激酶催化域由300个左右氨基酸组成，分为12个保守的亚区（图5.2），其中包含一些不变的或几乎不变的残基和模体，在催化作用和维持活性部位三维结构方面具有重要的作用。,图5.2蛋白激酶结构示意图,12个保守的亚区,2.蛋白激酶自身磷酸化,虽然蛋白激酶有一定的底物专一性，但很少有绝对专一性。一种蛋白激酶有多种底物或一种蛋白质是几种蛋白激酶的底物。几乎所有的蛋白激酶都可进行自身磷酸化（autophosphorylation），即蛋白激酶以自身作为底物。这种作用可以发生在分子间（trans），也可发生在分子内（cis）。自身磷酸化是蛋白激酶调节其活性的普遍而重要的方式。,3.蛋白激酶底物专一性,(1)主要体现在对靶蛋白磷酸化位点附近的氨基酸序列或三维结构特征的选择如PKA的磷酸化位点的序列特征为RRXS/TY，X多为侧链较小的残基，Y则有较大的疏水侧链。(2)蛋白激酶催化结构域之外的部分（或调节亚基）对决定其底物专一性同样重要。例如真核细胞的细胞周期循环由多种蛋白激酶（CDK）和多种不同的细胞周期蛋白（cyclin）进行调控。细胞周期蛋白不仅作为调节亚基对其激酶活性进行调控，还作为靶向亚基把激酶定位到合适的作用位点上。,CDK:cyclin-dependentkinases，周期蛋白依赖性蛋白激酶,4.接应蛋白的作用,蛋白激酶的专一性除由其自身和底物结构特点决定之外，细胞内的一系列接应蛋白对蛋白激酶的亚细胞定位及作用顺序发挥关键的调节作用。其中一类被称为“脚手架”蛋白(ScaffoldProtein)或接头蛋白(Adapter)，通过与一系列蛋白激酶结合和相互作用，调节它们依次激活的顺序。另一类被成为“锚定”蛋白，可同时结合激酶和锚定位点，其作用类似于靶向亚基。,5.3.2蛋白激酶的分类,蛋白激酶家族拥有众多的成员，结构上的相似性表明它们在进化上相关，很可能有共同的原始祖先基因。蛋白激酶分类：信使依赖型和非信使依赖型；按靶蛋白中磷酸化位点氨基酸残基分为5类；（引言）按其在信号转导途径中的作用分成：受体型蛋白激酶和非受体型蛋白激酶。具有PTK和S/TPK双活性，即所谓双重底物专一性的蛋白激酶，如MAPKK（MEK）等。最合逻辑的方法是根据氨基酸序列同源性对蛋白激酶进行分类。,图5.3各类蛋白激酶及其在进化中的关系,图5.4根据已被克隆的89种拟南芥蛋白激酶催化域序列同源性制作的进化树。功能和结构相近的列为一个家族，分枝的长度反映彼此间趋异的程度。,图5.4已克隆的Aradopsisthaliana蛋白激酶的种系发生树,5.3.3代表性的蛋白激酶,PKA（cAMP-dependentproteinkinase）PKG（cGMP-dependentproteinkinase）PKC（proteinkinaseC）PKB（proteinkinaseB）CaMPK（multifunctionalcalmodulin-dependentproteinkinase）；CDPK（Ca2+-dependentproteinkinase或calmodulin-likedomainproteinkinase）；PhK（phosphorylasekinase）PTK（tyrosineproteinkinase）MAPK（mitogen-activatedproteinkinase）TGFR（transforminggrowthfactor-receptor）HK-RR双组分信号转导系统PKR（double-strandedRNA-dependentproteinkinase）AMPK（AMP-activatedproteinkinase）/SNF1（sucrosenonfermenting-1）,5.3.3.1PKA（cAMP-dependentproteinkinase）,蛋白激酶A(proteinkinaseA，PKA)又称依赖cAMP的蛋白激酶A(cyclic-AMPdependentproteinkinaseA)，是一种丝/苏氨酸蛋