（作物遗传育种专业论文）甘蓝型油菜显性核不育基因的AFLP标记及品种（系）的SSR指纹图谱研究.pdf

捅要 油菜是我国主要的油料作物，选育高产优质油菜是育种的主要目标，而杂种优势利用是提高 油菜产量的主要途径。1 9 8 5 年李树林等在甘监型油菜显性雄性核不育利用研究中，首次报道了其 不育性是受二对显性基因控制，其中一对基因对另一对基因具有显性上位作用，并在此基础上提 出了显性核不育两系制种模式和三系制种模式，从而使显性核不育的杂种优势利用成为可能。 显性细胞核雄性不育具有败育彻底，不受环境影响，育性容易转育，生长发育正常等特点， 在油菜杂种优势利用和群体轮回改良方面具有重要的意义。实现显性核不育三系法制种，纯合两 型系的选育是基础，通过杂合两型系中的不育株与恢复系杂交，鉴定后代的育性分离情况，可以 选育出纯合两型系。为了更好地利用显性核不育杂种优势，提高育种效率，有必要结合分子标记 技术，开展分子标记辅助选择育种研究，同时结合亲本材料遗传距离分析，了解亲本材料间的亲 缘关系，为亲本材料在杂种优势中的利用提供分子水平的依据。 本研究利用甘蓝型油菜显性细胞核雄性不育材料杂台两型系7 0 0 5 6 a b ( 基因型为m s m s r f r f m s m s r f r f ) 和恢复系9 5 4 8 开展了纯台两型系的选育工作，并以7 0 0 5 6 a b 的兄妹交群体为材料， 利用b s a 法和a f l p 技术，筛选与不育基因紧密连锁的分子标记；此外分析了1 6 个品种( 系) 的遗传多样性。取得的主要实验结果如下： 1 利用杂合两型系7 0 0 5 6 a b 中的不育株7 0 0 5 6 a ( m s r n s r f r f ) 和恢复系9 5 4 8 组配杂交组合， 鉴定f 1 代为全可育，在f l 代套袋自交的6 1 个单株中，有3 5 个单株在f 2 代发生了育性分离， 2 6 个单株后代没有分离，为全可育，推断恢复系的基因犁为m s m s r f r f 。在育性分离的3 5 个f 2 代株系中，选择株系1 3 4 中2 6 个可育单株套袋自交，其中有1 9 个单株在f 3 出现育性分离，7 个单株的后代表现为全可育，符合对纯台两型系选育的预期设想。 2 在兄妹交群体( 7 0 0 5 6 a 7 0 0 5 6 b ) 中运用b s a 法构建了可育池a 和不育池b ，通过对 a f l p 酶切连接方法以及产物稀释倍数等条件的优化，发现将酶切和连接的步骤分开进行，会更 加有利于酶的活性，电泳检测结果条带清晰整齐；而酶切连接同时进行，同一个样品在不同的稀 释倍数下山现了不应有的主带差异，影响了实验结果的判断。得到的a f l p 优化程序是：双酶切 在3 7 水浴处理5 h r 后转到6 5 处理4 5 m i n ，加入连接体系2 2 过夜后7 0 处理1 0 m i n ，酶切 连接产物稀释1 0 倍作为预扩增的模板，预扩增产物用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测斤稀释3 0 倍作为 选择性扩增产物的模板，用聚丙烯酰胺凝胶电泳检测产物，银染显带。 3 在可育池a 和不育池b 中筛选了2 5 6 对e c o ri 和m s ei 引物组合以及2 2 4 对p s ti 和m s e i 引物组合，找到一个与不育基因紧密连锁的标记p g m l 4 1 3 0 ，在8 8 个单株中该标记与不育基 冈之间的交换率仅为1 1 。将该标记片段回收测序后，属于油菜基因组序列的实际长度为1 0 8 b p 。 4 利用s s r 技术构建了1 6 个品种f 系、的指纹图谱，结果表明通过2 3 个引物组合能将大部 分材料区分开。聚类分析表明1 6 个品种( 系) 在遗传距离o 5 6 处可以分为四类，其中本课题组选 育的品种( 系) 分别聚为两类。表明它们亲缘关系还比较近，有必要选用遗传背景更为广泛的材 料用于杂种优势的利用。 关键词：甘蓝型油菜，显性核不育基因，杂合两型系，a f l p 标记，s s r 指纹图谱 a b s t r a c t r a p e s e e di so n eo ft h em a j o ro i l s e c dc r o p si nc h i n a b r e e d e r ss t i l lf a c et h ec o m l l l o na n dm a i ng o a l o fi m p r o v i n gt h ep r o d u c t i o nl e v e lo fr a p e s e e d l ie ta l ( 1 9 8 5 ) h a dp r o p o s e df o rt h ef i r s tt i m et h a tt h e s t e r i l i t yo fd o m i n a n tg e n i em a l es t e r i l i t y ( g m s ) f o l l o w e dad i g e n i cm o d eo fi n h e r i t a n c ew i t he p i s t a t i c i n t e r a c t i o n ，a n de s t a b l i s h e dt w o - l i n es y s t e ma n dt h r e e - l i n es y s t e ma sg m sb r e e d i n gm o d e l s t h i s h y p o t h e s i sa n dm o d e l sm a d eh e t e r o s i su t i l i z a t i o no fg m s t ob eap r i m a r ys t r a t e g yi nb r a s s i c an a p u sl b r e e d i n g t h ed o m i n a n tg m si sa ne x c e l l e n ts y s t e mi nh y b r i db r e e d i n gf o ri t ss t a b l ea n dc o m p l e t es t e r i l i t y , i m p e r v i o u st oe n v i r o n m e n t ，v i g o m u s l yg r o w t ha n de a s y t ot r a n s f o r ms t e r i l ea n df e r t i l eg e n e s i n t h r e e - l i n es y s t e m ，h o m o z y g o u sg m st w o - t y p el i n ei saf o u n d a t i o nm a t e r i a ls e l e c t e df r o mh y b r i do f r e s t o r e ra n ds t e r i l ep l a n to fh e t e r o z y g o u st w o - t y p el i n e t h es e l e c t i o nd e p e n d so na n a l y z i n go f s e g r e g a t i o nr a t eb e t w e e nf e r t i l ea n ds t e r i l eh y b r i d s t om a k et h i ss y s t e ma w i d e ru s e , i ti sn e c e s s a r yt o d e v e l o pm o l e c u l a rm a k e r so fi t ss t e r i l eg e n e sa n da n a l y z et h ed i v e r s i t yo fp a r e n t a ll i n e st om a k et h e m o s to p t i m i z e sh y b r i d s t h ep r e s e n ts t u d yi n c l u d e s ( 1 ) b r e e d i n go fa h o m o z y g o u sg m st w o - t y p el i n ef r o m 且n a p u s h e t e r o z y g o u st w o - t y p el i n e7 0 0 5 6 a ba n dar e s t o r e rl i n e9 5 4 8 ；( 2 ) d e v e l o p i n ga 砌( a m p l i f i e d f r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) m o l e c u l a r m a r k e r so fm a l es t e r i l i t yg e n eb a s e do i l7 0 0 5 6 a b s i b m a t i n gp o p u l a t i o nb yb s a ( b u l k e ds e g r e g a n ta n a l y s i s ) m e t i l o d ；( 3 ) a n a l y z i n gt h es s rf m g e f p r i n t o fp a r e n t a ll i n e si n c l u d i n gr e s t o r e r9 5 4 8i no r d e rt og a i nt h eg e n e t i cd i s t a n c ed a t af o rb r e e d i n gp m g r a m m a i nr e s u l t so f t h ep r e s e n ts t u d i e sa r ea sf o l l o w i n g ： 1 t h eg e n o t y p eo fr e s t o r e rl i n ew a si d e n t i f i e da sm s m s r 瞬f a f t e rc r o s s e ds t e r i l ep l a n to fh e t e r o z y g o n s t w o - t y p e7 0 0 5 6 a bw i t hr e s t o r e r9 5 4 8a n di n v e s t i g a t e dt h es t e r i l i t yo ff 1 ，f 2a n df 3p o p u l a t i o n s t h e i n v e s t i g a t i o nr e s u l t ss h o w e dt h a tf 1p l a n t sw e r e1 0 0 f e r t i l e ，f 2p o p u l a t i o n sw e r et e s t e dt of i tt h e s e g r e g a t i o nr a t eo f1 ：1b y 。2t e s t , a n df 3p o p u l a t i o nh a dt h ei d e a lf e r t i l i t ys e g r e g a t i o n t h e s e r e s u l t sw o u l dl e a dt os u c c e s s f u ls e l e c t i o no fh o m o z y g o u sg m st w o - t y p el i n ei nt h en e a rf u t u r e 2 f e r t i l eb u l k ( a ) a n ds t e r i l eb u l k w e r ec o n s t r u c t e di nt h es i b m a t i n gp o p u l a t i o n7 0 0 5 6 a b ( 7 0 0 5 6 a 7 0 0 5 6 b ) b yb s a m e t h o da n dw e r eu s e di nt h ef o u o w i n go p t i m i z a t i o n t h ep r o t o c o lo f a f l pm o l e c u l a rm a r k e ra p p r o a c hw a so p t i m i z e di nr e s t r i c t i o ne n d o n u c l e a s e sd i g e s t i o n ，l i g a t i o na n d d i l u t i o no ft e m p l a t e s t h et w o _ s t e pm e t h o d ，i e s e p a r a t i n l n gt h ed i g e s t i o na n dl i g a t i o ns t e p s ，w a s e o n f l r m e dt ob eb e t t e rf o rt h ed i g e s t i o na c t i v i t yo fr e s t r i c t i o ne n z y m e sa n dr e s u l t i nl e g i b l ea n d r e p e a t a b l eb a n d s t h et e m p l a t ed i l u t i o nw a sn o ta ni m p o r t a n tp a r a m e t e ri nt w o - s t e pm e t h o da n dh a d l i t t l ei n f l u e n c et oa m p l i f i c a t i o nr e s u l t s w h e r e a si no n e - s t e pm e t h o d ，m a i nd i f f e r e n t i a lf r a g m e n t s a p p e a r e di nt h es a m es a m p l eo n l yw i t hd i f f e r e n td i l u t i o ng r a d e so f t e m p l a t e s ，w h i c hm i s l e dt h ep r i m e r s c r e e n i n gr e s u l t a no p t i m i z e da f l pp r o t o c o lw e r et h e nc o n f i r m e da sf o l l o w i n g ：g e n o m i cd n aw e r ei n c u b a t e d f o r5h ra t3 7 c w i t hr e s t r i c t i o ne n z y m e s t h e nt r a n s f e r r e dt o6 5 b a t hf o r4 5 m i n ；a f t e rl o h ro f t i l i g a t i o na t2 2 * ( 2 ，t h e yw e r et r e a t e da t7 0 ( 2 f o rl o m i na n dd i l u t e dl o - f o l du s e da st e m p l a t e sf o rt h e p r e a m p l i f i c a t i o nr e a c t i o n n e x t t h ep r e a m p l i f i e dp r o d u c t sw e r ct h e nd i l u t e d3 0 - f o l du s e d t e m p l a t e s f o rs e c o n da m p l i f i c a t i o n s e c o n da m p l i f i c a t i o nr e a c t i o np r o d u c t sw e r ea n a l y z e do np o l y a e r y l a m i d e g e lf o l l o w e db ys i l v e rd y i n g 3 u s i n gt h eo p t i m i z e da f l pp r o t o c o lm e n t i o n e da b o v e , 2 5 6a n d2 2 4p a i l so fe c o ri - m s ci a n d p s t1 - m s e1e n m b i n e dp r i m e r s ，r e s p e c t i v e l y , w e r es c r e e n e di nb u l kaa n db u l kb p r i m e rp a i r s p 9 m 1 4w a sf o u n dt ob ea p o l y m o r p h i cp r i m e rp a i r t h em a r k e rp 9 m 1 4 - 1 3 0w a sp r o v e dt ob et i g h t l y l i n kt ot h es t e r i l eg e n ew i t ht h er e c o m b i n a t i o n v a l u eo f1 1 a m o n g8 8i n d i v i d u a lp l a n t si n v e s t i g a t e d t h em a r k e rf r a g m e n tw a sc l o n e da n ds e q u e n c e d t h ef r a g m e n to f1 0 8 b pb d o n g e dt ot h er a p e s e e d g e n o m e 4 1 6c u l t i v a r s ( 1 i n e s ) u s e di no u rb r e e d i n gp r o g r a mw e r ea n a l y z e db ys s a n da ns s rf i n g e r p r i n t m a pw a s o b t a i n e du s i n g2 1p o l y m o r p h i cp r i m e r s t h e s el i n e sc o u l db ed i s t i n g u i s h e db yc o m b i n i n g2 t o3p r i m e r so n l y a l lt h e s e1 6l i n e sc o u l db ec l u s t e r e di n t o4g r o u p si nt h eg e n e t i c sd i s t a n c eo f0 5 6 b yu p g m am e t h o d m o s to fo u ri n b r e dl i n e sw e r ec l u s t e r e di n t oo n eg r o u p t h e i rc l o s eg e n e t i c d i s t a n c es u g g e s t su st od e v e l o pm o r el i n e sw i t hw i d e r b a e k g r o u n d k e yw o r d s ：o i l s e e dr a p c d o m i n a n tg e n i em a l ei t e r i l i t yg e n e ，h e t e r o z y g o u st w o - t y p el i n e ，a f l pm a r k e r , s s rf m g e r p r i n t 中国农业科学院 硕士学位论文评阅人、答辩委员会名单表 论文题目 甘蓝型油菜显性核不育基因的a f l p 标记及品种( 系) 的s s r 指纹图 谱研究 作物遗 论文作者 程勇 专业 研究方向油菜遗传育种 传育种 指导教师李云昌培养单位 油料作物研究所 硕( 博) 姓名 职称 导师 单位专业签名 硕导口 评 王守才教授中国农大作物遗传育种 博导 硕导口 阅 揭雨成研究员麻类作物研究所 作物遗传育种 博导 人硕导口 博导口 答 辩 周新安 硕导口 主 博导 油料作物研究所作物遗传育种 席 硕导口 李再云 华中农业大学作物遗传育种 博导 硕导口 余泗滨华中农业大学作物遗传育种 博导 答 硕导 刘贵华 油料作物研究所作物遗传育种 博导口 辩 硕导 姜慧芳油料作物研究所作物遗传育种 委 博导口 口 硕导口 贝 博导口 硕导口 博导口 硕导口 博导口 会议记录( 秘书)雷永 论文答辩时间地点 2 0 0 5 年6 月2 7 号在油料作物研究所答辩 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论 文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国 农业科学院或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工 作的同志对本研究所作的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示 了谢意。 研究生签名： 祭碧 2 0 0 5 年6 月2 0 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即： 中国农业科学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和 借阅，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同 意中国农业科学院可以用不同方式在不同媒体上发表、传播学位论文的 全部或部分内容。 研究生签名： 尔蓼 u 2 0 0 5 年6 月2 0 日 导师签名：二巷亥篙 2 。5 年6 月2 0 曰 第一章文献综述 油菜是重要的油料作物，是食用植物油和植物蛋白的最主要来源，也是潜在的仅次于豆粕的 大宗饲用蛋白源。我国是世界上最大的油菜生产国，2 0 0 0 年以来种植面积已突破1 1 亿亩，面积 和总产均占世界的三分之一。开展油菜杂种优势利用研究。把品质育种与杂种优势利用结合起来， 选育高产优质油菜品种是我国目前油菜育种的主攻方向，在杂种优势利用途径中细胞核雄性不育 的利用是士要途径之一。 二十世纪八十年代以来，d n a 分子标记技术迅猛发展，在作物遗传育种中得到广泛的应用， 主要表现在遗传图谱构建、遗传多样性评价与种子鉴定、基因定位和分子标记辅助选择等方面。 甘蓝型油菜的细胞核雄性不育分子标记结合传统育种手段，将加快油菜杂种优势利用和遗传改良 进程，加速分子标记辅助育种走向实用阶段。 1 、甘蓝型油菜细胞核雄性不育性的研究进展 1 1 细胞核雄性不育材料的来源 甘蓝型油菜细胞核雄性不育是一种由细胞核内染色体基因控制的雄性不育类型。油菜的核不 育材料的来源是十分广泛的，自1 9 4 0 年盛永俊太郎在甘蓝型油菜里发现“n o r i n ”核不育材料以 来，国内外学者己发现一人批的核不育材料，如1 9 7 2 年我国四川宜宾地区农科所发现的宜3 a ， 1 9 7 3 年江西宜春地区农科所的川7 a ，1 9 8 0 年李树林的紫9 a 、潘涛( 1 9 8 8 ) 的$ 4 5 a ，侯国佐等 ( 1 9 9 0 ) 的1 1 7 a ，前阿德m a t h i a s ( 1 9 8 5 ) 的j a n p o l 核不育等等。 根据获得核不育材料的途径，李树林( 1 9 9 5 ) 将其分为五种：自然突变、人工理化诱变、品 种间杂交、型间杂交、甘蓝型油菜白交等，其中自然突变和人= 理化诱变都是获得核不育材料的 主要途径。近年黄帮全等( 2 0 0 0 ) 通过甘蓝型油菜与诸葛菜的属间杂交获得一个低芥酸的雄性不 育材料$ 9 0 - 8 - 7 ，其不育性至少受一对隐性基闻控制。 1 2 细胞核雄性不育的遗传分类 甘蓝型油菜核不育型主要由基因突变而来的，根据产生突变的性质不同，可分为显性核不育 和隐性核不育。 1 2 1 显性细胞核雄性不育 显性核不育性是由核内显性基因控制的。根据控制不育性的基因数量可将其分为单基因显性 核不育和双基因显性核不育。 ( 1 ) 单基因显性核不育不育株的基因型有两种：m s m s 和m s m s ，目前报道只有j a n p o l a b 属丁此类，由于没有相应的恢复基因，在杂交种利用上没有多大价值。 ( 2 ) 双基因显性核不育不育株的基因型有两种：m s m s r f r f 和m s m s r f r f ，其育性是由两对 中国农业科学院顿+ 学位论文第一章文献综述 显性基因m s 和r f 互作控制的，其中m s 是显性不育基因，r f 是显性上位抑制基因，它能抑制显 性不育基因m s 的表达，从而使育性恢复可育。宜3 a 、川7 a 、李树林等( 1 9 8 5 、1 9 8 6 ) 选育的 2 3 a 和2 0 4 a 以及胡胜武等( 1 9 9 9 ) 在甘蓝型油菜中发现的不育材料s h a a n g m s 均属于此类。用 不育株和可育株交配的后代中可能出现的育性表现有：全不育、全可育或育性分离为1 ：1 、5 ：3 、 3 ：1 三种，其中育性分离稳定在1 ：1 的核不育系称为两型系，m s m s f f 计m s m s r f x f 为纯合两型 系，m s m s f f r f x m s m s r f r f 为杂合两型系两型系兄妹交后代也呈1 ：1 分离。 纯合不育株m s m s r f r f 与双隐性纯合体m s m s f f r f 的测交中，后代表现为全不育，但不能通过 回交保持，所以般隐性纯合体m s m s r f r f 称为i 艋保系；基因型为r f r f 的可育株由丁上位抑制基 因酣能抑制不育性的表达，恢复育性，从而能作为恢复系。这样不育株和可育株交配的后代中 出现全不育和全可育的表现型，可以实现三系化制种。 1 2 2 隐性细胞核雄性不育 根据不育基因的数目，可以分为单基因隐性核不育、烈基闻隐性核不育和多基因隐性核不育 三种。 ( 1 ) 单基因隐性核不育：不育株的基冈型为m s l l s ，n o r i n a b 和罗鸿源等( 1 9 9 2 ) 选育的 $ 4 4 5 a 即属丁此类。 ( 2 ) 双基因隐性核不育：不育性是由两对隐性基因控制的，不育株的基因型为双隐性纯合 体s l s l s 2 s 2 ，其对应的可育基因为s 1 和s 2 ，当两对恢复基因中任何一个存在时( s 1 或s 2 ) ，育 性就能恢复。1 1 7 a 和$ 4 5 a 不育系即属丁此类。 ( 3 ) 多基因隐性核不育：陈风祥等( 1 9 9 3 ，1 9 9 8 ) 报道的核不育材料9 0 1 2 a b ，其育性是由2 对隐性重叠不育基因和1 对隐性上位抑制基因互作控制的，当隐性上位基因纯合时，对隐性不育 基冈起上位抑制作用，其不育株的基因型为：m s i m s l m s 2 m s 2 r f l 时和m s l m s l m s 2 m s 2 r f f f ，根据 此类核不育的遗传学原理，陈风样等( 1 9 9 8 ) 提出了纯合两用系( m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f x m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f m s l m s l m s 2 m s 2 r f l ) 、完全保持系( m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f ) 、恢复系( m s l m s l 或一一m s 2 m s 2 一一) 三系杂种利用模式。王华等( 2 0 0 1 ) 选育的生态犁核不育材料h 9 0 s ，其不 育性受三对独立遗传的重叠隐性基因a 1 、a 2 、a 3 共同控制，二= 对基因同时为隐性即表现不育。 1 3 细胞核雄性不育杂种优势的利用 油菜杂种优势强，增产效果显著，且杂种制种技术易于掌握，制种产量高而稳定，因而受到 广泛重视。1 9 7 2 年傅廷栋发现p o lc m s 以来，我国油菜杂种优势的研究取得许多重要成果。 细胞核雄性不育系杂种是油菜杂种优势利用的重要途径，具有不育株不育性彻底，不受环境 影响，育性容易转育，生艮发育正常等特点，在杂种优势利用方面目前已经提出了一些可行实用 的遗传模式，并在生产上推广利用。 李树林等( 1 9 8 5 ) 根据双基因显性核不育遗传规律提出了显性核不育油菜三系制种模式，其 制种模式为图1 1 所示。周熙荣等( 2 0 0 3 ) 根据三系配套制种模式，首次报道了甘蓝型油菜双低 显性核不育杂交种核杂3 号的选育过程，核朵3 号在上海市区域试验中，平均比对照品种汇油5 0 2 中国农业科学院硕十学位论文第一章文献综述 增产2 2 9 ，表现出显著的产量优势。 两系制种模式需要拔除两型系里5 0 的可育株，工作量较大，而三系制种模式中用纯合两型 系与双隐性纯合的保持系杂交可以获得全不育系，将制各杂交种时大面积拨除5 0 的可育株过程 提前到繁育不育系世代，从而克服以上麻烦，提高制种效率。 厂 5 0 5 0 啊f e r t i 育l e 5050篡ste育rile上二 全不育 1 0 0 s t e r i l e + 潘涛( 1 9 8 8 ) 和侯国佐( 1 9 9 0 ) 在对隐性核不育材料$ 4 5 a 和1 1 7 a 的遗传规律进行了研究后均提 出了两系法制种模式，其制种模式为图1 2 所示。 5 0 可育5 0 不育 5 0 f e r t i l e5 0 s t e r i l e 恢复系 佗s t o r e rl i n e s 1 s 1 一一_ 一s 2 s 2 f 1 全可育 f 11 0 0 f e r t i l e 图1 , 2 双隐性基因核不育两系制种模式 f i g1 2 t w o - l i n e ”s y s t e mm o d e lo fd o u b l e - r e c e s s i v eg m s 3 ! i 昔1墨 厂墨 岫 咖 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 由于隐性核不育材料$ 4 5 a 和1 1 7 a 不育性稳定，恢复源广，易于选配优势组合，得到了一 定的应用，目前如双高杂交油菜川油1 3 号、川油1 4 号、黔油1 0 号，低芥酸杂交油菜蜀杂一号、 蜀杂五号、油研五号、贵杂二号及双低杂交油菜蜀杂6 号、油研七号、油研八号均属于此类，但 隐性核不育两型系在制种时必须及时彻底的拨除母本行中5 0 的可育株。 陈风祥等( 1 9 9 8 ) 在发现三隐性核不育材料后，提出三系制种模式，三隐性核不育材料具有恢 复源j “，育性稳定，易于转育，在杂交油菜育种方面显示一定的优越性，并报道了利用隐性核不 育材料9 0 1 2 a 选配双低杂交油菜组合过程，所选组合通过安徽省区域试验，较对照增产显著，充 分显示了隐性核不育配组的优越性。其制种模式为图1 3 所示。 两型系 t w o - t y p vl i n e i m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f 可育株不育株 f e r t i l e s t e r i l e 保持系 m a i n t a i n e rl l n e m s l m s l m s 2 m s 2 r f r f 恢复系 m s 幻口e f l i n e m s l m s l j m s 2 m s 2 f 1 全可育 f 11 0 0 也r m e 围1 3 三基因隐性核不育的三系法制种模式 f i 9 1 3 叮h e e l i n e s y s t e m m o d e l o f t r i p l e - m c c s s i v e g m s 杨光圣等( 1 9 9 3 ，1 9 9 6 ) 和李加纳等( 1 9 9 4 ) 总结了细胞质雄性不育和细胞核雄性不育的优点 和缺点，在此基础上提出了植物杂种优势利用的一条新途径：细胞核+ 细胞质雄性不育，并分别 创建了甘蓝型油菜“显性细胞核+ 波里马细胞质雄性不育”三系和“隐性细胞核+ 波里马细胞质雄 性不育”三系，克服了波里马细胞质雄性不育系的微粉和细胞核雄性不育系需拨除可育株的问 题，具有较大的应用潜力。 除了在杂种优势中的利用外，周永明等( 1 9 9 3 ) 利用甘蓝型油菜显性核不育性受2 对互作基 困控制的特性，已将显性核不育基冈转移到不同细胞质来源的基因型中，并利用显性核不育系合 成了供进一步轮回选择的基础群体，扩大了群体的遗传变异，从而为选择提供更多的机会。 2 、分子标记及其在油菜遗传育种中的应用 2 1 主要的分子标记类型 4 llllll+ 三 中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述 d n a 分子标记是d n a 水平上遗传多态性的直接反映，依据对d n a 多态性的检测手段，d n a 标记可分为以f 几类( 方宣钧等，2 0 0 2 ) ： ( 1 ) 基于d n a _ d n a 杂交的分子标记：r f l p ( 2 ) 基于p c r 技术的分子标记：r a p d 、s s r ( 3 ) 基于限制性酶切和p c r 的分子标记：a f l p 2 1 1r f l p ( 限制性片段长度多态性) 通常d n a 上存在大量的限制性内切酶酶切位点，特定的d n a 限制性内切酶组合所产生的 片段是特异的。片段的数目和长度在d n a 分子水平上直接反映了生物的遗传多态性，这种多态 性是由于限制性内切酶酶切位点或位点间d n a 区段发生突变引起的，通过电泳的方法分离和检 测这些片段，从而产生r f l p 。 r f l p 标记的主要特点有：( 1 ) 遍布丁整个基闲组，数量几乎是无限的：( 2 ) 无表型效应， 不受发育阶段及器官特异性限制；( 3 ) 共显性，可区分纯合子和杂合子；( 4 ) 结果稳定、可靠； ( 5 ) d n a 需要量大，检测技术繁杂，难以用丁大规模的育种实践中。 2 1 2s s r ( 简单重复序列) s s r 是一类由儿个碱基组成的基序串联重复而成的d n a 序列，长度一般较短，广泛分布于 基冈组的不同位置，不同遗传材料重复次数不同，导致了s s r 长度的高度变异性，这一变异性正 是s s r 标记产生的基础，s s r 两端序列多是保守的单拷贝序列，可以根据这两端的序列设计一对 特异引物，通过p c r 技术将其间的序列扩增出来，利用电泳分析技术就可获得其长度多态性。 s s r 标记的主要特点有：( 1 ) 数量丰富，广泛分布整个基因组；( 2 ) 具有较多的等位性变异； ( 3 ) 共显性标记，可鉴别出杂合子和纯合子；( 4 ) 实验重复性好，结果可靠；( 5 ) 由于创建新 的标记时需知道重复序列两端的序列信息，因此其开发有一定的困难，费用也较高。 2 1 3r a p d ( 随机扩增多态性d n a ) r a p d 标记就是用一个随机引物( 一般8 1 0 个碱基) 非定点的扩增基因组d n a ，然后利用 电泳技术分开扩增片段，遗传材料的基冈组d n a 如果在特定引物结合式域发生d n a 片段插入、 缺失或碱基突变，就有可能导致引物结合位点的分布发生相应的变化，导致扩增产物增加、缺少 或发生分子量变化，其中增加或减少就产生r a p d 标记。 r a p d 标记的土要特点是：( 1 ) 不需d n a 探针，设计引物无需知道序列信息；( 2 ) 显性遗 传，不能鉴别纯合子和杂合子；( 3 ) 技术简便，不涉及分子杂交和放射性自显影等技术：( 4 ) d n a 样品需要量少，引物价格便宜，成本较低；( 5 ) 实验重复性较差结果可靠性较低。 2 1 4 a f l p ( 扩增片段长度多态性) a f l p 标记是选择性扩增基因组d n a 酶切片段所产生的扩增产无多态性，其实质也是显示 5 中国农业科学院硕士学位论文第一章文献综述 限制性内切酶酶切片段的长度多态性，这种多态性是以扩增片段的长度不同被检测出来的，该技 术结合了r f l p 的稳定性和p c r 技术的简便高效性，同时又能克服r 凡j 带型少、信息量小以及 m ”d 技术不稳定的缺点。 a f l p 标记的主要特点有：( 1 ) 由丁a f l p 分析可以采用的限制性内切酶及选择性碱基种类、 数日较多，所以产生的标记数目是无限多的：( 2 ) 一次分析可以同时检测到多个座位，且多态性 极高；( 3 ) 表现显性或共显性；( 4 ) 分辨率高，结果可靠。 2 2 分于标记在甘蓝型油菜遗传育种中的应用 二十世纪八十年代以来，d n a 分子标记研究成为一个非常活跃的领域。我国d n a 标记在作 物育种上应用的研究下作发展也很快，在水稻、小麦、玉米、大豆、油菜等主要作物取得了一系 列的重要进展，鉴定了一批与重要性状紧密连锁的d n a 标记，通过标记辅助选择育成了一批有 价值的种质，并且己开展了标记辅助基因聚合的t 作。 2 2 1 种质资源遗传多样性研究 分子标记技术已经成为评价种质资源遗传多样性的重要手段之一，d i e m 等( 1 9 9 4 ) 用r f l p 标 记研究了8 3 个甘蓝型油菜的遗传多样性，将油菜划分为欧洲冬油菜、欧洲春油菜、中国一日本油 菜三大类群。孟金陵等( 1 9 9 6 ) 对包括4 6 个中国品种、9 个欧洲品种在内的5 9 个甘蓝型油菜品种( 系) 的r f l p 标记进行了分析，把中国甘蓝型油菜划分为6 组，欧洲冬油菜与以上6 组存在着较显著 的遗传距离。武宁丰等f 1 9 9 n 、胡胜武等( 2 0 0 1 ) 、m ac h a o - z h i 等( 2 0 0 3 ) 用r a p d 、i s s r 标记对我 国和欧洲的甘蓝型油菜品种也进行了遗传多样性分析。研究结果表明，要扩大中国甘蓝型油菜的 遗传基础，欧洲冬油菜无疑是一个重要的种质资源。另一方面，用典型的中国甘蓝型油菜与欧洲 冬油菜配制的杂交种，较易产生强大的杂种优势。 杨光圣等仃9 9 8 ) 用m t d n a 为探针，对不同甘蓝型油菜细胞质雄性不育系进行了r f l p 分析， 结果表明p 2 4 a ( o g u c m s ) 与其它c m s 完全不同，为不育系的利用提供了重要的理论依据。 2 2 2 遗传图谱的构建 l a r y 等( 1 9 9 1 ) 通过两个油菜栽培品种“w e s t e r ”和“t o p o s ”杂交产生的f 2 群体，用c d n a 克隆为探针，构建了甘蓝型油菜的第一张分子标记连锁图，包括分布在1 9 个连锁群上的1 2 0 个 座位，覆盖了1 4 1 3 c m 重组单位。此后，f e r r e i r a 等( 1 9 9 4 ) 、u z u n o v a 等( 1 9 9 5 ) 、f o i s s e t 等( 1 9 9 、 s h a r p 等( 1 9 9 5 ) 也分别利用不同的群体和分子标记方法构建了覆盖艮度不同的分子连锁图， l o m b a r d 等( 2 0 0 1 ) 利用3 个d h 群体、4 种遗传标记( 同工酶标记、r f l p 、r a p d 、a f l p ) 对甘 蓝型油菜的遗传连锁图进行了整合，是目前包含位点数最多的图谱，包含了5 4 0 个标记，图距达 2 4 2 9 c m ，位点间的平均距离只有4 5 c m 。国内x u 等( 2 0 0 i ) 、刘春林等( 2 0 0 0 ) j 构建了甘蓝型 油菜的分子标记连锁图，并将一些主要性状的基因定位到不同的连锁群中。陆光远( 2 0 0 3 ) 利用显 性核不育系构建甘蓝型油菜的分子标记并将不育基因定位到第九连锁群上。 6 中国农业科学院硕士学位论文 第一章文献综述 2 2 3 重要性状的分子标记 ( 1 ) 育性基因的分子标记：在细胞质雄性不育中，d e l o u r m e 等( 1 9 9 4 ) 从1 3 8 个随机引物中 筛选出与油菜o g u l mc m s 的恢复基因紧密连锁的4 个r a p d 标记片段，这些标记可以用于恢复基 因的图位克隆和回交选育时用于标记辅助选择。j e a n 等( 1 9 9 7 ) 利用近等基因系n i l s 和b s a 法鉴 定出1 0 个r f l p 标记和1 个r a p d 标记与p 0 1c m s 的育性恢复基因位点连锁，并将恢复基因定 位到第1 8 连锁群上。王俊霞等( 2 0 0 0 ) 采用b s a 法，筛选了8 6 0 个随机引物，找到两个与p o lc m s 育性恢复基因连锁的r a p d 标记，最后成功地将其转化为s c a r 标记，可以用于恢复系分子标记 辅助选择和杂种纯度鉴定。 在细胞核雄性不育中，涂金星等( 1 9 9 7 ) 通过b s a 法对隐性细胞核雄性不育材料$ 4 5 进行了分 子标记，在9 8 0 个随机引物中找到2 个与可育基阑连锁的r a p d 标记，干滟等( 1 9 9 9 ) 、蒋梁材等 ( 2 0 0 0 ) 也分别进行了隐性细胞核雄性不育基因的r a p d 标记。陆光远伫0 0 3 ) 分别利用一个纯合两 型系兄妹交群体和回交分离群体，找到了5 个与不育基因紧密连锁的a f l p 标记和一个与上位抑 制基阕紧密连锁的a f l p 标记，并利用同交群体构建了甘蓝型油菜分子标记遗传图谱，将不育基 冈定位于第十连锁群上，同时探讨了显性细胞核雄