（作物遗传育种专业论文）种质超干燥贮藏的生理生化特性及差异基因表达的研究.pdf

捕要种质超干燥贮藏的生理生化特性及差异基因表达的研究作物遗传育种硕士研究生：吴晓亮指导教师：陶澜副教授；卢新雄研究员摘要目前，低温种质库虽然是保存种质资源的最佳途径，但由丁低温种质库建殴通常投资大、技术要求高，运转费用也较昂贵，因此对于欠发达地区和一般种质资源保存希望找到一种住常温条件f 也能得到中期保存的新技术。超干燥技术能提高种子的贮藏寿命这已经得到了国内外研究者大量实验结果的支持：然而目前对种子超干燥贮藏的最适含水萤及作用机理研究仍有分歧特别是从分子角度来研究种子超干燥的机理，目前尚未见报道。本文以豌豆水稻，玉米作为研究对象，从种子的生理生化特性热稳定蛋白及r n a 转录水平上研究超干技术对种子贮藏寿命的影响及其作用机理，为种质资源常温保存提供理论和实践依据。结果丧明：l当豌豆种子干燥后，进行发芽实验，发现豌豆种子含水量降低到5 以f 时，种子活力指数和根干重与对 ! 相比在o 0 5 水平上差异显著。种子超干贮藏后对种子中的s o d 、p o d 和c a t酶活性进行测定，结果发现，豌豆种子中的s o d 酶活性与种子活力和发芽率高低关系不明显，而p o d 和c a t 活性与种子的发芽率高低及活力大小号明显的正相关，特别是c a t 活性表现得更明显。当种子老化6 个月后测定种子中的丙_ 二醛含量，适度超干的豌豆种子中( 8 和5 ) 的丙二醛的含最明显低于其它含水量种子，且电导率也低于其它含水量种子，表明种子中的膜保持较好当对种子中的热稳定蚩白测定时发现，豌豆种子超干过程中没有产生新的热稳定蛋白但适度超干后种子中的热稳定蛋白的含量明显增加，在老化6 个月后适度超干的种子中的热稳定蛋白的含量仍保持较高的水平，高于其它含水量。表明热稳定蛋白含量的高低与种子抗老化能力的强弱相关。2通过对贮藏在不同气候区8 年水稻种子的生活力和活力指数的测定结果表明，在同一地区常温贮藏条件下籼稻桂早2 号和粳稻幸实种子之间的种子贮藏含水量存在差异，其含水量水平粳稻幸实高于籼稻桂早2 号，如在北京地区，籼稻桂早2 号最适种子含水餐为5 5 一6 筛，而粳稻幸实为6 5 一7 ，0 。在南昌地区，籼稻桂早2 号最适种子含水量为4 瓣左右而粳稻幸实为5 5 一6 o 。该结果也表明，水稻种子最适含水量水平与贮藏地区年平均温度和大于零度积温呈负相关关系即无论粳稻幸实和籼稻桂早2 号，在年平均温度和大于零度积温较高的南昌地区，其水稻种子最适含水量水平都高于年平均温度和大于零度积温较低的北京地区。研究发现，耐超干籼稻桂早2 号种子中有一条蛋白分子量3 9 4 k d 的特异性蛋白条带，而不耐超干粳稻幸实却没有这条带，而当种子发芽为零豹种子，该特异性热稳定蛋自西南大学硕士学位论文条消失。在分子量为4 1 6 k d 处在籼稻桂早2 号和粳稻幸实种子之间的热稳定蛋白电泳图谱分析中，两者之间也存在差异当粳稻幸实种子发芽率降至零时该条热稳定蛋白带也丢失。因此可以推测一方面，分子量3 9 4 k d 的特异性蛋白可能与种子的耐超干燥特性有关，另一方面分子量3 9 4 k d 和4 1 6 k d 这两类蛋白与种子活力丧也可能有关。通过m a l d l - t o f - m s 分析这两个蛋白的肽序列进行m a s c o t 分析，结果表明，第一个蛋白( 3 9 4 k d ) 为蛋白激酶，第二个蛋白( 4 1 6 k d ) 为一个未知蛋白。3采用c d n a a f l p 技术对不同含水量玉米种子筹异表达显示分析共用了3 6 对引物获得了1 7 条差异条带进行克隆，其中有3 个在5 5 9 5 含水量种子中表达，2 个在95 含水量种子中表达，2 个在8 5 含水量种子中表达。4 个在7 5 含水量种子中表达3 个在6 5 含水量中表达，2 个在5 5 种子中表达，1 个在4 5 含水量中表达，对其中7 个克隆的条筹异条带进行了g e n e b a n k 中的同源性比较显示，其中3 个编码的蛋白为蚩向激酶，2 个编码的蛋白为一种反转录因子蛋白，2 个编码的蛋白为感受器和细胞色素类蛋白。这些编码的蛋白在种子老化的过程中起到保护的作川。通过n o r t h e r n 杂交，结果表明d 1 和d 7 两个差异基冈片段是种子在脱水超干后产生的。关键词：种子超干燥生理生化c 聊i i f a - a f l p| i摘要s t u d i e so nt h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lm e c h a n i s ma n dd i f f e r e n t i a le x p r e s s i o no fg e n e so fu l t r a d r i e ds e e d sc a n d i d a t e ：w ux i a o l i a n ga d v i s o r s a p r o f t a ol a n ；a r e s ：l ux i n x i o n ga b s t r a c ta tp r e s e n t ，t h eg e n e b a n ki st h eo p t i m u mt oc o n s e r v eg e r m p l a s mr e s o u r c e ，b u ti tn e e d e dm u c hf u n dt ob u i l di t ，a n di tn e e d e dt e c h n i q u et os a f e g u a r di t s oan e wt e c h n o l o g yw o u l db ef o u n dt oc o n s e r v eg e r m p l a s mr e s o u r c ei np o o ra r e a m a n yr e s u l t sh a ds h o w e dt h a tu l t r a - d r yt e c h n o l o g yc o u l di n c r e a s e ds t o r a g e dl i f ew i t hu l t r a - d r ys e e d sa tr o o mt e m p e r a t u r e ，b u ti th a sm a n yd i f f e r e n t si no p t i m u mm o i s t u r ec o n t e n ta n dm e c h a n i s m ，e s p e c i a li th a dn o tb e e nf o u n dt or e s e a r c hm e c h a n i s mw i t hm o l e c u l a rm e t h o d s w o r k i n go ns e e d so fp e a ( p e s u ms a t i v u ml ) , r i c e ( o r y z as a t i v al ) a n dm a i z e ( z e am a yl 、t h ee f f b c to fl o n g e v i t yw a sa n a l y z e d t h r o u g ht h et e s t i n go f t h ep h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c am e c h a n i s m h e a t - s t a b l ep r o t e i na n dr e v e r s e dl e v e l o fr n as oa st op r o v i d es c i e n t i f i ca n dt h e o r e t i c a lb a s i sf o rc o n s e r v i n gg e r m p l a s mr e s o u r c e t h er s e a r c hr e s o i t ss h o w e da sf o l l o w i n g ：it h eg e r m i n a t i o nt e s tw a sd o n ea f t e ru l t r a d r i n go fp e as e e d s ，w h e nm o i s t u r ec o n t e n t so fp e aw a sl o w e dt o5 ，d r yw e i g h to fr o o ta n dv i g o ri n d e xo fs e e d sc o m p a r e dw i t hc kh a v es i g n i f i c a n t l yd i f f e r e n c ea to0 5l e v e l t h e s es h o w e dt h a tt h ep e as e e d sw e r en o ts u i t e dt ou l t r a - d r ys t o r a g e a f t e ru l t r a d r ys e e d sw e r ec o n s e r v e d ，s o d ，c a ta n dp o do fs e e d sw e r et e s t e d ，t h er e s u l t ss h o w e da c t i v i t i e so fs o dd i dn o to b v i o u sc o r r e l a t e dw i t ht h eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g ea n dv i g o ri n d e x ，b u ta c t i v i t i e so fp o da n dc a tp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dw i t ht h eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g ea n dv i g o ri n d e x e s p e c l l yt h ea c t i v i t i e so f c a t t h ec o n t e n to f m a l o n d i a l d e h y d e ( m d a ) o f s e e d sa f t e ra g e d6m o n t h sw e r e t e s t e d ，a n dt h er e s u l t ss h o w e d t h a t t h ec o n t e n t so f m d ao f m o i s t u r ec o n t e n t s o f s e e d s f 8 a n d5 ) w e r eo b v i o u sl o w e rt h a nt h eo t h e r s ，a n dt h ec h a n g e so fe l e c t r i c a lc o n d u c t i v i t yo fp e aa l s og o tt h es a m er e s u l t s 。s ot h e yi n d i c a t e dt h a tv e l u mo fs e e d sw e r ek e p tp r e f e r a b l y n e wh e a t s t a b l ep r o t e i nw a sn o tf o a n di nt h eu l t r a - d r i e ds e e d s ，b u tc o n t e n t so f h e a t s t a b l ep r o t e i n si n c r e a s e di ns e e d sw i t hm o i s t u r ec o n t e n to f 5 a n d8 , a n dt h ec o n t e n to f t h e ms t i l lh i g h e rt h e no t h e r sl e v e l sw h e nt h e yw e r ea g e df o r6m o n t h s 2 s e e dg e r m i n a t i o np a r a m e t e r sa n dv i g o ri n d e xo fd i f f e r e n tk i n d so fr i c es e e d ss t o r e df o re i g h ty e a r sa tr o o mt e m p e r a t u r ew e r ei n v e s t i g a t e d r e s u l t ss h o w e dt h a tt h eo p t i m u mm o i s t u r ec o n t e n to fl n d i c ar i c es e e d ss t o r e di nb e i j i n gw e r e5 5 一6 o ，b u tf o rj a p o n i c ar i c es e e d sw e r e6 5 - 7 o t h eo p t i m u mm o i s t u r ec o n t e n tw e r e4 5 o rs o 5 5 - 6 o f o ri n d i c ar i c es e e d sa n dj a p o n i c ar i c es e e d ss t o r e di nn a n c h a n g i ti n d i c a t e dt h a tt h el e v e lo f t h eo p t i m u mm o i s t u r ec o n t e n to f j a p o n i c ar i c es e e d su i西南大学硕士学位论文w a sh i g h o rt h a ni n d i c ar i c es e e d ss t o r e da tr o o mt e m p e r a t u r ei nt h es a m ea f f e a b u tt h el e v e lo ft h eo p t i m u mm o i s t u r ec o n t e n tw i l ld e c r e a s ew i t ht h ei n c r e a s eo fa v e r a g et e m p e r a t u r ea n da b o v ez e r oa c c u m u l a t et e m p e r a t u r ei nt h es t o r a g ea r e a 1 t h er e s u l to fs d s p a g ee l e c t r o p h o r e s i ss h o w e dt h a t3 9 4 k dh e a t s t a b l ep r o t e i na p p e a r e do n l yi ns e e d so fl n d i c ar i c et o l e r a n tu l t r a - d r y i n g ，b u tn o ta p p e a ri ns e e d so f j a p o n i c ar i c e ，t h eh e a t s t a b l ep r o t e i nd i s a p p e a r e dw h e nt h eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g eo fi n d i c ar i c es e e d sw a sz e r o ；4 1 6 k dh e a t s t a b l ep r o t e i nw a sa l s od i f i e r e n tb e t w e e nt h et w ok i n d sc u l t i v a r s ，t h eh e a t s t a b l ep r o t e i nd i s a p p e a r e dw h e nt h eg e r m i n a t i o np e r c e n t a g eo fj a p o n i c ar i c es e e d sw a sz e r o t h e s er e s u l t ss u g g e s t e dt h a tt h et w ok i n d so fh e a t s t a b l ep r o t e i n sm i g h tb er e l a t e dt 0d e h y d r a t i o nt o l e r a n c ea n dv i g o rl o s to fs e e d s t h et w op r o t e i n sw e r et e s t e dw i t hm a l d l t o f m s ，a n da n a l y s e dw i t hm a s c o t ，t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ep r o t e i n ( 3 9 4 k d ) w a sap r o t e i nk i u a s ea n dt h ep r o t e i n ( 4 1 6 k d )w a sah y p o t h e s i sp r o t e i n3 t h em e t h o de d n a - a f l pw a su s e dt os t u d yd i f f e r e n t i a lg e n e so fd i f f e r e n tm o i s t u r ec o n t e n t so fm a i z es e e d s ，t o t a l l y3 6p r i m e rc o m b i n a t i o n sw e r eu s e dt oi s o l a t ed i f f e r e n tc d n af r a g m e n t s ，17m a i nd i f f e r e n t i a lf r a g m e n t sw e r eo b t a i n e da n dc l o n e d ，3f r a g m e n t sw e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h5 - 5 一9 5 2f r a g m e n t sw e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h9 5 2f r a g m e n t sw e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h8 5 ，4f r a g m e n t sw e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h7 5 ，3f r a g m e n t s w e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h6 5 2f r a g m e n t sw e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h5 5 2 f r a g m e n t sw e r ee x p r e s s e di nm o i s t u r ec o n t e n t sw i t h4 5 a tl a s t7f r a g m e n t sw e r es e q u e n c e da n dc o m p a r e dw i t hb l a s ts o f t w a r e t h er e s u l t sw e r ea sf o l l o w ：t h r e ep r o t e i n sw e r ep r o t e i nk i n a s e l i k e ，t w op r o t e i n sw e r et a m s e t r i p t i o nf a c t o r s ，t w op r o t e i n sw e r er e c e p t o rl i k ep r o t e i nk i n a s ea n dc y t o c h r o m eb t h e s ep r o t e i n sp r o t e c t e da g e i n go fs e e d si nc o n s e r v a t i o n t h er e s u l t so fn o r t h e r nb l o to f d ia n d d w e t ed i f f e r e n t i a l g e n e f r a g m e n t s t h a t t h e y w e r e p r o d u c e da i d e r d e h y d r a t i o no f t h em a i z es e e d s k e y w o r d s ：s e e du i t r a d r yp h y s i o i o g ya n d1 3 i o c h e m i c a lm e c h a n is mc d n a a f l p独创性声明学位论文题目：盘厦超王龌墼整数生堡垒焦挂性丞羞是基西塞垫鳗噩究本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得西南大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。学位论文作者：星日轧缸签字日期：“年朋2 卵学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密，口保密期限至年月止) 。学位论文作者签名：昊眈花签字日期：o 年p 月z y 日学位论文作者毕业后去向：工作单位：通讯地址：导师签名：陶2 阚签字日期：6 f 年朋5 日电话：f)邮编：文献综述第一章文献综述引言随着社会的发展，人们对其赖以生存的地球越来越关注。人类的活动已使生物资源、大气、_ 十地等各种资源遭到严重的污染和破坏，而生物资源的破坏列各项之首。目前全世界共收集保存农业植物种质资源约6 1 0 万份，其中9 0 是以种子的形式保存在1 3 0 0 多个种质库中。但由于低温种质库造价离，运转费用高，在不发达国家还无力建造这种现代化的种质库，我国除国家种质库能得到国家重视和经费支持外，许多省市的中期库都有运转经费斟难问题。如何持久保存这些资源已成为种质保存工作者的头等人事。于是研究人员通过降低种子含水量的办法来探讨种子贮藏的途径，希望减少低温库的运转费用而达到保存种子种质的效果，于是向f a o 1 b p g r 申请专项资助，随后便选定英国r e a d i n g 大学和中国科学院植物研究所协同开展超干种子贮藏保存种质的研究。进入九十年代末，全世界掀起了种子超干贮藏研究的热潮。种子超干贮藏( u l t r a - d r ys t o r a g e ) 亦称超低含水量贮藏( u l t r a l o wm o i s t u r ec o n t e n ts t o r a g e ) ，是将种子水分降至5 以下( 一般认为5 是种子安全含水量下限) ，密封后在室温条件一f 贮藏，即通过降低种子水分以代替降低贮藏温度，达到相同的贮藏效果的一种方法。种子超干贮藏是目前种子贮藏研究领域的一个新的研究课题，这项技术正应用丁二现代化基因库的建立中口i 。种质超干保存技术研究目的在于通过降低种子含水量使种质在室温密闭贮藏条件下，其贮藏寿命能达到1 2 0 年中期保存目的，而不需要投巨资来兴建低温种质库。目前该项研究已经从许多方面证实种子超干贮藏的可行性，特别是种子生理方面的人量研究，但从分子萤白质水平上研究的较少，本文献就这两个方面的研究进展作一简要概述。1 1 种子种质超干保存研究现状传统的经验普遍认为，在种子贮藏中控制温度比控制水分来得容易且可靠和安全，因而种子贮藏都趋向低温或超低温的方向发展。国际植物遗传资源委员会曾推荐5 左右的含水量和1 8 c 低温贮藏条件作为种质资源长期保存的理想条件。近年来，随着种子生物学各个领域的发展，尤其是种子脱水技术的发展，逐渐发现5 这一含水量f 限是可以逾越的，采川不同的干燥方法，将种子含水量降到5 以下，这就称为种子超干燥。许多报道指出，通过超干燥使种子含水量降到5 以f ，种子活力并没有受影响，反而使种子贮藏寿命大大提高”1 。1 1 1 种子超千能提高其贮藏稳定性e l l i s 等p 研究发现将芝麻种子含水量从5 降至2 其寿命提高了4 0 倍如果将贮藏温度从2 0 。c 降低到2 0 ( 2 ，其寿命的提高也只提高4 0 倍。他们并用染色体畸变率加以验证和分析。随后在芥菜、甘蓝型油菜、莴苣、栗、大麦等作物的研究中也证实超干种子的耐贮藏性大大提高。对短寿命种子榆树和杜仲h ”超干并老化处理，结果表明超干种f 的耐贮性也得到提高，张施君 6 1 在对芥兰种子研究中也发现超干处理可以提高其贮藏性，张海英等p 1 在对番茄超干种子研究中发现4 6 和2 4 的含水量具有同等的贮存效果。研究发现油料种子可忍耐西南大学硬士学位论文极度的脱水，当油菜种子含水量降低到1 5 以下，仍保持种子活力；蛋白类种子如大豆种子的耐干性能力在品种间存在很大差异，而淀粉类种子的耐超干能力在种问差异也很大，如商粱、小麦耐脱水能力较强，而水稻、玉米种子耐脱水能力差。超干能提高种子的贮藏稳定性但这并不意味着含水量越低越女严l ，在研究过程中发现，当种子含水量降低到某一定值时，种子活力r 降。过度超干则对种子寿命无益，甚至促使其劣变，研究表明【9 i 当种子含水量降低到某一定值时种子活力f 降，过度超干对种子寿命无更大的箍处。甚至会加速种子劣变。这些研究表明超干存在一个最适含水跫，但不同作物的种子的最适含水量不同。如e l l i s 等研究认为，油菜为2 8 、芥菜为3 8 、花生为2 0 等。但目前种子的最适超干含水鼍还未确定，主要是最适含水量与贮藏温度之间的关系存在分歧。如v e r t u c c i i 认为超干种子在低温下贮藏可能会加速种子老化，种子最适含水量随着贮藏温度的降低而增高。而e l l i s 等认为种子在相对湿度1 0 11 f 达到平衡时的含水量为晟适含水量它适合丁种子在室温内的贮藏，而且它不随贮藏温度的降低而增j n ( 至少在3 5 ( 2 6 5 。c 范围内) 。对于这些分歧目前仍无定论，对于不同的作物有不同的最佳含水量，阳此在研究过程中不能用同标准去衡量。1 1 2 超干处理对种子内水分的影响种子内水分按其存在状态可分为自由水，束缚水和中间类型，其中与细胞组分紧密结合而不能自由移动，不易蒸发散失的水称为束缚水【1 “。与细胞组分之间吸附力较弱，可以自由移动的水，称为自由水。水分由于亲水和疏水的相互作用，可以影响人分子如核酸及蛋白质的结构排列，其中自由水可以直接参与各种代谢活动，因此种子内水分存在的状况及各种状态水分之间的比例与种f 本身固有特性有着直接的关系，当种子中自由水束缚水比值高时，细胞原生质量溶胶状态，抗逆性弱，反之细胞原生质呈凝胶状态则抗逆性强。曾广文”“对红花种子进行超干发现，自由水，束缚水的比例随含水量下降而降低，在超干状态下种孑中大部分束缚水仍然保持着，这就为超干种子保持较高活力提供了有利的内部环境条件，程红炎i “1 类型的种子( 淀粉类，油料类及对水分敏感的品种) 进行水分热力学分析表明，对干燥较敏感的榆树和大豆种子束缚束缚水的能力比耐干性强的油菜芝麻等种子低，较易失去等温线第一吸附区域的强吸附水，即不耐干燥的种子比耐干的种子较易失去关键性的束缚水，继而引起大分子构象的变化。另外在水稻种子中发现吸湿同干处理可以提高种子的热力学k 和k 值，增加种子对等温线上第一吸附区域水分的束缚能力，说明种子对束缚水的保持能力越大，其超干贮藏的效果越好。1 i 3 超干处理引起细胞质玻璃化在研究中发现f 1 “，随着水分的降低，种子细胞的胞质将进入一种玻璃化状态，所谓玻璃化状态是指一种无定形的亚稳定状态，它类似固体易脆材料具有极高的粘滞性但仍保持液体状态时分子的无序性物理状态则种子内的化学反应被限制到极点，使种子呼吸作用降2史献综述低到最低水平，活性也被很好的保持，即具有耐脱水性。o l i v i e r i ”i 对耐脱水的菜豆种子胚在不同含水量下的玻璃化转变及热力学行为作研究，发现随着含水量的降低，玻璃化转变温度升高且变化速度也升高，但对极低含水量没有发现热力学行为。因而极度脱水则种子胚就受剑脱水伤害。c r o w e 等1 18 j 认为玻璃态的形成可能是干植物或干动物系统抵御脱水伤害。保持静止和提高贮藏稳定性的一个有代表性的策略。在干燥过程中形成的玻璃态可以达到高度粘滞性却没有人昔的分子重排，因此它限制了脱水后细胞结构的主要变化，因此冷冻或干燥的植物组织在贮藏温度低于玻璃化去玻璃化温度( t g ) 时可以在相当艮的时间内存活。在适当的含水量和温度f 碳水化合物分子量越高，其t g 越高，且实现玻璃化转变的含水量范围越广。细胞内的玻璃化在种子和花粉等植物组织中已经被发现，朱成i ”i 采用筹示量热扫描法( d s c ) 分析不同发育时期水稻胚在同一含水量f 玻璃化转变温度的变化，结果表明在发育1 4 天之后的发育过程中，水稻胚经干燥后玻璃化行为与玻璃化转变温度均没有变化，进一步说明种子耐脱水性的获得与玻璃化形成有密切的关系。但最近的研究越来越清楚的表明，脱水植物组织中的玻璃化组分并不如模式玻璃化系统中一样采用同一途径，而是多种不同组合的糖类和亲合性溶质的混合物。i 14 超干处理对种子生物膜的影响细胞代谢活性伴随着种子活力的f 降而降低，在调控代谢的各因子中，代谢组分的空间分隔以及代谢复合物的止确组合是1 常重要的，而膜对丁细胞内的区域化具有极其重要的作用，一旦膜系统受到损伤将引起细胞器发生畸变与解体，各种大分子酶遭到破坏并导致代谢异常，加速种子生活力利活力丧失。种子活力下- 降过程中胞内大量电解质外渗是生物膜受害的一个重要标志。豌豆、水稻、玉米等老化种子丧失其活力时，其浸出液的电导率增加，花生和水稻种子经人：老化处理( 3 8，1 0 0 ) 后；其活力f 降：花生种胚和水稻种子的电解质及讣渗量明显增多：花生胚组织的可溶性蛋白和糖的渗漏增加。而高活力种子吸水时，无机物的渗漏是短斩的，膜的完整性可被修复。在低活力种子中这种修复机制可能是缺乏的或者是低效的，无机物的渗漏会持续更长的时间，高活力大豆种子吸胀过程中溶液电导率增加缓慢：至吸胀后期基本保持稳定。低活力种子吸胀的前6 小时，溶液的电导率增加较快，此后则减熳；至吸胀后期仍早增加趋势。无活力种子吸胀前1 2 小时，电导率增加迅速，且增加幅度较大，吸胀1 6 小时达高峰，此后保持稳定。如对超干种子直接浸种会引起胞内大量物质外渗，而经过严格回水处理后胞内电解质的外渗量降低，与对照相比无明显差异，表明回水对超干种子膜的物理修复有很好的效果，超干本身不会对膜产生伤害。经过一定时间贮藏后，超干种子胞内电解质的外渗量明显低于未超千种子，表明在贮藏过程中的超干种子膜比未超干种子保持的完善。因此认为膜伤害构成了种子劣变的土要事件| 2 0 】。西南大学硕士学位论文1 1 5超干处理对种子内自由基的影响在种子劣变机理的学说中，自由基学说越来越引起人们的注意。在正常生理状态下，自由基的产生和消除处于平衡状态，只有当种子处于不利的物理和化学因素f ，产生的自由基得不到消除，或内源性自由基的产生和消除失去平衡时，自由基对机体常常会造成损伤。超干处理使种子内自由基水平增高，而回水处理和吸胀过程中自由基可以得到明显有效的清除。丙一醛是种子在贮藏过程中随着劣变的发生而逐渐积累的有毒的脂质过氧化物，其含量常用以表示种子中脂质过氧化程度：挥发性醛类物质释放是种子脂质经过各种途径氧化的综合结果，可以反映脂质过氧化导致的劣变程度。超千种子在贮藏过程中的丙二醛和挥发性醛类物质释放量都低于末超干的种子。这是超干种子耐贮藏性得到很大改善的反映。超干贮藏过程中种子脂质过氧化程度的减弱，与大分于水膜失去导致自由基毒害加剧的传统说法相矛盾，其机理可能是在脱水过程中，特异蛋白质以及可溶性糖等物质代替水保护了大分子，使其免受自由基伤害。1 2 种子耐脱水性的机理研究进展很多植物组织在脱水后仍可以存活，但所能忍受的程度不同。近年来的研究1 2 , 4 4 嘬明止常型种子中不同类别种子的耐脱水性有不同的差别，油料种子比淀粉类，蛋白质类种子更能忍耐脱水，究其原因还不太清楚因此搞清楚种子耐脱水性的获得及不同类别种子耐脱水性的差异的原因，将有利于种质资源的保存。种子耐脱水性机理一直是种子生理学家研究的重要内容，以r 就是近几年在这方面的最新进展。1 2 i 可溶性糖与种子耐脱水性关系a s g h a r1 2 5 1 在进行种子脱水性研究中发现，细胞对脱水的反应，是由于许多植物组织会积累亲和性的溶质，但大多数亲和性溶质不能够保护组织抵抗进一步的脱水而糖则能在低于0 3 9 h 2 0 g 干重时起保护作用。汪晓锋口“进行超干种子回湿时，在2 0 p e g 溶液中分别添加葡萄糖和蔗糖后，种子膜流动性得以保持，而添加蔗糖效果更好，这也表明糖类在种子耐脱水性中起到某种程度上的保护作用。糖对脱水耐性有关的直接证据来自转基因植物1 2 “，将编码海澡糖合成酶的基因导入到烟草中，烟草内海藻糖的含量明显高于对照，经同等条件干燥及复水后，对照幼苗严重损伤死亡，而转基因幼苗则完全恢复紧张度并开始生长。一般认为高水平的还原糖( 葡萄糖，果糖。半乳糖等) 与种子衰老，贮藏，脱水伤害有关它们可自动氧化产生氢氧根离子，对组织造成伤害，同时还可以与蛋白质或核酸分子中的氨基酸结合，使核酸，蛋白质降解和酶失活，而高浓度的蔗糖、棉子糖、水苏糖等非还原性糖与种子的耐脱水性密切相关 2 8 - 3 2 1 。玉米和其他禾谷种胚中棉子糖的积累和脱水耐性形成正相关，大豆种子发育过程中脱水耐性的获得和水苏糖的积累有关，花生胚轴在获得耐脱水性的同时蔗糖，水苏糖等非还原性糖含量增加，还原性糖含量下降，还原糖，非还原糖比值降4文献综述低。有的种子内虽棉子糖类寡糖含量很少，但种子内存在其它非还原性糖如半乳耱环多醇系列，如乔麦种子中主要是荞麦醇，在脱水过程中，它们与寡糖的保护作用相似。在干燥时，由于水分子的缺乏，交换性溶质首先停止与蛋白水合而糖作为水分子的替代品来满足蛋白质极性基团的氢键需求，这样就维持了蛋白质原有的折叠和活性防l r 了其变性和聚集，因而可以使蚩白质的二级结构得到保持p “。大多数硕性种子组织中，明显缺乏蔗糖、棉籽糖或水苏糖，表现出脱水敏感，如将止常人豆种子和i 欧洲白栎种子的可溶性糖组分，含昔比较，发现这两类种子在发育后期均可暴积等量的蔗糖唯一区别只是白栎种子中缺乏水苏糖。对于顽性种子，虽然也发现了蔗糖和寡糖的积累，但进一步研究表明，糖作为替代水和形成玻璃化的作用只有在种子含水最低时才发生，而在此含水量水平时，顽性种子已经受脱水损伤致死，这也是顽性种子不耐脱水的主要原因。糖对种子脱水耐性的作州主要表现在以f j l 个方面1 4 “：1 ) 水分替代。当脱水的细胞失水时，糖羟基可作为水的替代物，分布在膜。酶和蛋白及其它大分子中，如二糖可以墩代水分子，与膜脂的极性头端结合，充当了膜脂极性头端2 问的寸片避免了膜脂的叠加与堆积t从而稳定了膜结构。2 ) 维持蛋白质的稳定性。研究发现在水分胁迫时，海藻糖的羟基可与蛋白质的极性基团以氢键形式结合来代替水，从而防止蛋白质在脱水过程中变性：3 ) 促进细胞质玻璃化。可溶性糖可促进细胞内溶物的玻璃化，寡糖不仅提高细胞质的玻璃化的转变温度( t g ) ，而且抑制了种子脱水期间蔗糖的结品，使种子或胚轴在较高温度范围内进入玻璃化状态，从而避免脱水对细胞的伤害。i2 2 抗氧化系统与种子耐脱水性关系一般种子在贮藏过程中，随着贮藏时间的增长，种子内部物质不断变化活力不断f 降，寿命不断降低，而种子老化劣变的原因很多，其中非常重要的一点是细胞完整性的丧失”。自由基，过氧化物和膜脂过氧化代谢产物的产生，自由基和过氧化物具有很强的毒害作用t可以启动膜脂中不饱和脂肪酸的过氧化作用，产生0 2 ，使细胞膜受n 损, ne 4 “”。在正常水分状况下，生物体内自由水的产生和清除之间处于动态平衡当组织缺水时，细胞中电子传递受阻，自由基生成增加，平衡被打破，自由基超过一定值，就会对机体造成活性氧自由基伤害，蛋白质、核酸、类脂分子即遭到氧化破坏同时它还能启动膜脂过氧化作用，导致膜的损伤或破坏，膜透性增大，屯导率增加。超干处理使种子内自由基水平增高，而回水处理和吸胀过程中白由基可以得到明显的有效地清除【4 ”，丙二醛是种子贮藏过程中种子发生劣变后产生的有毒的脂质过氧化产物，对种子有一定的伤害，与种子活力成负相关。研究表明p w 超干种子在贮藏过程中的丙二醛( m d a )及挥发性醛类物质释放低于朱超干种子。由于在贮藏过程中，种子自身又发生进一步氧化产生m d a ，而m d a 义能反过来抑制细胞保护酶的活性及降低抗氧化物的含量如此恶脞性连鼯南大学硕士学位论文锁反应。直到细胞全面崩溃。现在一般认为酶促保护系统主要包括：超氧化物歧化酶( s o d ) ，过氧化氢酶( c a t ) ，过氧化物酶( p o d ) 抗坏血酸过氧化物酶( a p ) 等。这些酶都是种子自身抵制活性氧，清除自由基的酶促系统。一系列的研究发现超干种子贮藏一定时间后这些酶活性仍然保持很高的活力与低温保存的种子无明显的差异，而不同超干种子相同条件下贮藏的未超干种子酶活性则人人丧火 5 1 - 5 2j 。i 2 3l e a 蛋白与种子耐脱水性的关系在种子获得脱水耐性的胚成熟后删，蛋白质和m r n a 的合成模式发生变化，特征性地积累一类特殊的m r n a 和相关的蛋白质1 5 3 - 5 5 】，d u r e 等首先在胚胎发育后期的棉花子叶中分离到一组丰富的m r n a ，命名为l e a m r n a ，其翻译产物为l e a 蛋白，主要存在丁细胞质，也存在于细胞核、核f ：和常染色质中。多年的研究已经表明小分子量的热稳定蛋白与植物耐脱水性密切相关，它主要包括l e a 蛋白和h s p s 等，它们积累的过程与细胞耐脱水性的获得相一致，因此它们被认为在耐脱水过程中扮演着重要的角色 5 8 - 5 9 l ，傅家瑞州等在研究花生脱水性过程中发现，耐脱水性的6 5 d a p 胚轴比4 0 d a p 胚轴寒冷明显提高。从亚细胞水平来看，l e a 蛋自主要定位在细胞质中，经0 1 m m o l 几a b a 处理的成熟玉米子粒中大部分的种子脱水索定位在靠近莩尖和根尖细胞的细胞质中，但其它组织包括糊粉层，盾片薄壁组织，盾片表皮，维管束原和胚叶细胞的细胞质和核中也存在脱水素蛋白在玉米胚的盾片薄壁组织细胞中，常染色质和细胞骨架元件也可能是脱水素定位的场所1 6 ”。目前对l e a 蛋白了解的比较清楚1 “- 6 9 】，一般认为其分子量较小，约1 0 - 3 0 k d ，它们共同的特征是富含甘氨酸赖氨酸等亲水氨基酸，疏水氮基酸含量很少，具有很高的亲水性和热稳定性，其中脱水蛋白是l e a 蛋白中- - n 免役学上独特的蛋白质家族。l e a 蛋白的共同结构特征是由偏性氨基酸组分形成的高度亲水性的多肽。大多数l e a 蛋白缺乏半胱氮酸和赂氨酸残基，但富含赖氨酸和甘氨酸。它具有高度的亲水性，因此在细胞中的分布可能不具有专一性，具有偏性氦基酸的组成，且在细胞中的浓度较高，很大程度上可能不具有酶活性p 4 1 。l e a 蛋白与耐脱水性的相关性在许多正常型种子如玉米、花生、小麦等上都得到了证实。转基因实验直接证明了l e a 蛋白的作用将大麦l e a 基因h v a l 转入水稻h v a l 蛋白在转基因水稻中表达同时与水分亏缺和盐份胁迫的抗性能力真接相关p 。关丁l e a 蛋白的确切功能还不清楚，根据他们的氨基酸顺序和预测的蛋白质结构，可以推测l e a 蛋白具有以下特点 7 “7 2 i ：( 1 ) 具有较高的水合能力，能维持细胞的最小水分需要：( 2 )起分子伴侣和亲水性溶质的作用，在水分胁迫时稳定和保护蛋白质的结构及功能。( 3 ) 鳌合细胞脱水过程中浓缩的离子；( 4 ) 代替水保护膜的结构。i 2 4 小分子热激蛋白及其它类型的热稳定蛋白与种子耐脱水性的关系大量研究表明，种子耐脱水性的形成与热稳定蛋白的积累有关，黄上志等i ，”发现花生种子蛋白的热稳定性的高低与耐干性呈正相关。花生种子在发育过程中表达的另一类热稳定蛋6文献综述白( 一种蛋白质抑制剂) 可保护蛋白质免受脱水伤害【7 4 j 。目前人们研究发现1 7 5 - 7 9 i ，一种热激蛋白在种子发育过程中可能通过保护和修复脱水后同水过程中的大分子结构，帮助脱水耐性的形成。这类小分子量的热激蛋白( h s p ) 一般分子鼋在( 1 5 k d 2 7 k d ) 之间，植物热激蛋白是一组非常保守的蛋白质家族，它们主要起分子伴侣，热防御和稳定细胞结构等功能。这些热激蛋白具有以f 特点：( 1 ) 不同的物种有同源性很高的h s p ，但同一物种的不同h s p 没有同源性。( 2 ) 热激反虑时h s p 的合成迅速增加而原有的蛋白质合成! i l i j 减少。( 3 ) 交叉耐受性，一种应激刺激诱导细胞产生的h s p 不仅使细胞对该刺激的耐受性增加，也增加了该细胞对应激刺激的耐受性。(