（农业昆虫与害虫防治专业论文）社会性昆虫抗菌肽基因的分子进化研究.pdf

浙江大学博一i j 学位论文 摘要 摘要 社会性昆虫在上亿年的进化过程中，形成了许多行之有效的分子进化机制， 为我们研究分子进化提供了一个良好的模式系统。我们选取三种白蚁( 黑翅土白 蚁o d o n t o t e r m e sf o r m o s a n u s ( s h i r a k i ) 、黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 和 黑胸散白蚁r e t i c u l i t e r m e sc h i n e n s i ss n y d e r ) 和一种蜜蜂( 中华蜜蜂a p e sc e r a n a f a b r i c i u s ) 为实验材料。根据已知的抗菌肽c d n a 基因设计引物，通过反转录 p c r 的方法从构建的c d n a 文库中扩增获得抗菌肽c d n a 基因，并运用各种生 物信息学软件进行遗传进化分析。本研究得到的结果和结论如下： ( 1 ) 黑翅土白蚁t e r m i c i n 家族基因共计含5 6 个不同的c d n a 基因，编码 4 6 个不同的抗菌肽；黄翅大白蚁t e r m i c i n 家族基因共计含5 4 个不同的c d n a 基 因，编码3 7 个不同的抗菌肽；黑胸散白蚁t e r m i c i n 家族基因共计含3 8 个不同的 c d n a 基因，编码2 1 个不同的抗菌肽。 ( 2 ) 黑翅土白蚁和黄翅大白蚁t e r m i c i n 前体基因d n d s 值大于1 ，表明两种 白蚁t e r m i c i n 基因采取正选择的进化方式，两种白蚁受到的环境选择压力为正选 择压力。黑胸散白蚁前体基因d n d s 值小于1 ，表明黑胸散白蚁t e r m i c i n 基因采 取负选择的进化方式，黑胸散白蚁受到的环境选择压力为负选择压力。黑翅土白 蚁和黄翅大白蚁t e r m i c i n 前体基因成熟肽区d n d s 值大于前体基因d n d s 的值， 表明t e r m i c i n 前体基因面临的环境选择压力主要体现在成熟肽区。 ( 3 ) 中华蜜蜂总计含8 7 个不同的抗菌肽基因和2 6 个不同的抗菌肽。其中 d e f e n s i n 家族基因含2 9 个不同的c d n a 基因，编码7 个d e f e n s i n 肽；a b a e c i n 家族基因含1 1 个不同的c d n a 基因，编码2 个a b a e c i n 肽；a p i d a e c i n 家族基因 含1 3 个不同的c d n a 基因，编码4 个a p i d a e c i n 肽；h y m e n o p t a e c i n 家族基因含 3 4 个不同的c d n a 基因，编码1 3 个h y m e n o p t a e c i n 肽。 ( 4 ) 通过与意大利蜜蜂a p i sm e l l i f e ml 的比较分析发现，中华蜜蜂比意大 利蜜蜂含更丰富的抗菌肽基因( 8 7 ：1 6 ) 和抗菌肽( 2 6 ：1 1 ) ，尤其是具有更丰 富的h y m e n o p t a e c i n 基因( 3 4 ：2 ) 和更多数量的h y m e n o p t a e c i n 肽( 1 3 ：1 ) 。这 可能是因为长期的家养驯化使意大利蜜蜂基因退化的缘故。 v l l 浙江人学博上学位论文 摘要 ( 5 ) 系统发育分析表明，几种社会性昆虫的抗菌肽基因均为同源基因。根 据基因的“自私性”法则，我们预测上述社会性昆虫的抗菌肽基因家族可能存在 一些在长期的进化过程将被淘汰的假基因或不必要基因。 关键词：黑翅土白蚁黄翅大白蚁黑胸散白蚁中华蜜蜂抗菌肽基因分子 进化正选择负选择退化 浙江入学博十学位论文 a b s t r a c t a b s t r a c t s o c i a li n s e c t sh a v eb e e n i n ge x s i s t e do nt h ee a r t hf o rm o r et h a n10 0m i l l i o ny e a r s ， w h i c hp r o v i d ea ne x c e l l e n tm o d e lf o ru st os t u d yt h em o l e c u l a re v o l u t i o n w ec h o s e f o u r s p e c i e s o fs o c i a l i n s e c t a s m a t e r i a l s ，i n c l u d i n g t h r e et e r m i t e s p e c i e s ( o d o n t o t e r m e sf o r m o s a n u s ( s h i r a k i ) ，m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h ta n dr e t i c u l i t e r m e s c h i n e n s & s n y d e r ) a n do n eh o n e y b e es p e c i e s ( a p i sc e r a n af a b r i c i u s ) w ed e s i g n e d p r i m e r sa c c o r d i n gt ot h er e p o r t e da n t i m i c r o b i a lp e p t i d ec d n ag e n e s ，a n da m p l i f i e d t h ec d n ag e n e sf r o mt h ec o n s t r u c t e dc d n al i b r a r i e su s i n gr e v e r s et r a n s c r i p tp c r ( r t - p c r ) ，a n dt h e na n a l y z e dt h e s es e q u e n c e sd a t au s i n gb i o i n f o r m a t i c ss o f t w a r e s t h er e s u l t sa n dc o n c l u s i o n sa r es u m m a r i z e da sf o l l o w s ： ( 1 ) t o t a l l ydf o r m o s a n u sh a s5 6d i f f e r e n tt e r m i c i nc d n ag e n e se n c o d i n g4 6 d i f f e r e n tt e r m i c i np e p t i d e s m b a r n e y ih a s5 4d i f f e r e n t t e r m i c i ne d n ag e n e s e n c o d i n g3 7d i f f e r e n tt e r m i c i np e p t i d e s ，a n dr c h i n e n s i sh a s3 8d i f f e r e n tt e r m i c i n c d n a g e n e se n c o d i n g2 1d i f f e r e n tt e r m i c i np e p t i d e s ( 2 ) t h ev a l u e so fd n d so ft h et e r m i c i np r e c u r s o rg e n e sa r e 1i ndf o r m o s a n u s a n dm b a r n e y i i n d i c a t i n gt h a tt h et e r m i c i ng e n e su n d e r g op o s i t i v es e l e c t i o ni nt h e s e t w ot e r m t es p e c i e s ，a n dt h em i c r o e n v i r o n m e n t a lp r e s s u r eo ft h e s et w ok i n d so f t e r m i t e sa r ep o s i t i v em i c r o e n v i r o n m e n t a lp r e s s u r e t h ev a l u eo fd n d si nr c h i n e n s & i s 9 9 ) ，分别为第4 号位的蛋氨酸( m e t m ) 、第5 、6 号位的谷氨酰胺 ( g i n q ) 、第1 0 号的天冬酰胺( a s n n ) 、第1 2 号位的精氨酸( a r g r ) 、第2 5 位的谷氨酰胺( g i n q ) 、第2 8 号位的异亮氨酸( i l e s ) 、第3 0 号位的精氨酸 ( a r g r ) 、第3 2 号位的丙氨酸( a l a a ) 、第3 3 号位的苯丙氨酸( p h e f ) 和第 3 4 号位的天冬酰胺( a s n - n ) 。 浙江大学博上学位论文黑翅十白蚁抗菌肽t e r m i c i n 某的分子进化 表3 1 2 黑翅土白蚁t e r m i e i n 成熟肽正选择位点检测( ：p 9 5 ；：p 9 9 ) t a b l e3 1 2d e t e c t i o n o fp o s i t i o ns e l e c t i o ns i t e so ft h em a t u r ep e p t i d e so fd f o r m o s a n u s t e r m i c i n 3 2 1 0 黑翅土白蚁和其它白蚁t e r m & & 基因系统进化 从黑翅土白蚁的t e r m i c i n 序列中选取不同类型的编码o f l 、o f 9 、。o f 3 2 、o f f 3 7 和o f 4 5 的基因序列与已知其它白蚁t e r m & i n 的不同基因序列做系统发育分析。 成熟肽基因序列、前体基因序列及前体基因和u t r 序列的系统发育树的构建， 均采用m e g a 4 的n j 法( 具体操作见2 2 8 2 ) ，分析结果表图3 5 ( a ，b ，c ) 。 图3 5 ( a ，b ，c ) 表明，黑翅土白蚁和d r u b r i c e p s 的t e r m i c i n 基因序列在 三个系统发育树中均能较好地聚合在一起，而其它大部分白蚁物种的t e r m i c i n 在三个系统发育树中均不能聚合在一起，表明前二者的t e r m i c i n 肽极有可能为同 系物，其对应的t e r m i c i n 基因为同源基因，而其余白蚁物种的t e r m i c i n 基因为非 同源基因。 3 9 浙江大学博 ：学位论文 黑翅士白蚁抗菌肤t e r m i c i n 苯闶的分了迸化 0 0 5 图3 5 a 黑翅土白蚁与其它白蚁t e r m i c i n 成熟肽基因系统发育树。注：建树方法采用n j 法， 系统自检1 0 0 0 次，图左下为标尺。建树采用的基因序列见表3 。1 3 。 f i g 3 5 ap h y i o g e n e t i ct r e e so fd f o r m o s a n u sa n do t h e rt e r m i t e s t e r m i c nm a t u r eg e n e s n o t e s ：c o n s t r u c t i n gt h et r e ew i t hn jm e t h o d ( 10 0 0r e p l i c a t i o n s ) ，s c a l eb a ri s i nn u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n sp e rs i t e t h es e l e c t e ds e q u e n c e sa r eg i v e ni nt h et a b l e3 1 3 浙江人学溥上学位论文黑翅十白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基冈的分子进化 b o 0 2 图3 5 b 黑翅土白蚁与其它白蚁t e r m i c i n 前体基因系统发育树注：建树方法采用n j 法， 系统自检1 0 0 0 次，图左下为标尺。建树采用的基因序列见表3 1 3 。 f i g 3 5 bp h y i o g e n e t i ct r e e so fnf o r m o s a n u sa n do t h e rt e r m i t e s t e r m i c np r e c u r s o rg e n e s n o t e s ：c o n s t r u c t i n gt h et r e ew i t hn jm e t h o d ( 10 0 0r e p l i c a t i o n s ) ，s c a l eb a ri s i nn u c l e o t i d e s u b s t i t u t i o n sp e rs i t e t h es e l e c t e ds e q u e n c e sa r eg i v e ni nt h et a b l e3 13 4 1 浙江人学博十学位论文黑翅士白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基冈的分了进化 o 0 2 图3 5 c 黑翅土白蚁与其它白蚁t e r m i c i n 前体基因和3 ，u t r 序列系统发育树。注：建树方 法采用n j 法，系统自检1 0 0 0 次，图左下为标尺。建树采用的基因序列见表3 1 3 。 f i g 3 5 cp h y l o g e n e t i ct r e e so fo f o r m o s a n u sa n do t h e rt e r m i t e s t e r m i c np r e c u r s o rg e n e s a n d3 u t rs e q u e n c e s n o t e s ：c o n s t r u c t i n gt h et r e ew i t hn jm e t h o d ( 10 0 0r e p l i c a t i o n s ) ，s c a l eb a r i si nn u c l e o t i d es u b s t i t u t i o n sp e rs i t e t h es e l e c t e ds e q u e n c e sa r eg i v e ni nt h et a b l e3 1 3 4 2 浙江大学博上学位论文黑翅十白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基因的分子进化 表3 1 3 建树采用的序列名称及序列号 f i g 3 1 3n a m e sa n dg e n b a n k so ft h es e q u e n c e sw h i c hu s e dt oc o n s t r u c tt h ep h y l o g e n e t i c t r e e s 3 3 讨论 我们从黑翅土白蚁体内克隆并确定了5 6 个不同t e r m i c i n 的e d n a 序列( 含 不同的前体基因序列) ，这5 6 个不同的e d n a 序列与已知报道的白蚁t e r m i c i n 序列具有很高的相似性，共计编码4 6 个不同的t e r m i c i n 肽，并且种内的t e r m i c i n 序列具更高的同源性。 在文库筛选过程中，送测尽量多的阳性克隆，且尽量避免相同的克隆重复测 序，因此我们的结果基本上能保证将黑翅土白蚁体内所有的t e r m i c i n 基因全部 克隆并正确鉴定。一个物种的一个抗菌肽家族含4 6 个不同的成熟肽，这比从其 它1 3 种白蚁报道的2 1 个不同的t e r m i e i n 的两倍都要多得多，这可能因为实验 方法不同，或黑翅土白蚁比报道的其它白蚁面临更大环境选择压力的缘故。我们 的实验结果表明，处于复杂微生物环境压力下的社会性昆虫白蚁，将产生种类丰 富的抗菌肽物质，以对付各种病原微生物的侵染。 黑翅土白蚁t e r m i c i n 肽对应的各阳性克隆数占总阳性克隆数的比例大小不 一表明，各抗菌肽组份在白蚁t e r m i c i n 肽家族中的所占的比例各不相同，从而 可以推断各组份在白蚁体液免疫系统中的地位也各不一样。o f 3 2 为黑翅土白蚁 4 3 浙江大学博j 二学位论文黑翅十白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基冈的分了进化 t e r m i c i n 肽的主要成分，在白蚁体液免疫系统中应该发挥重要作用。含量较多的 o f 7 和o f l 3 起次要作用，而其它大部分的t e r m i c i n 成分很有可能是做为上述三 个抗菌肽成分的补充，或对上述三个抗菌肽成分起协同作用。 系统发育分析表明，黑翅土白蚁的所有t e r m i c i n 肽为同系物，编码它们的 基因为同源基因。以黑翅土白蚁t e r m i c i n 肽中最主要的成分0 1 3 2 作参照，大部 分组份至少存在一个氨基酸非保守性突变( u n c o n s e r v a t i v em u t a t i o n ) ，表明各 抗菌肽组份所起的作用，甚至作用方式很有可能存在着不同，但是由于彼此间氨 基酸序列的高度保守性及其结构上的高度相似性，决定这些抗菌肽组份虽然在黑 翅土白蚁t e r m i c i n 家族中的地位不同，但它们的所起的作用方式应大同小异。 0 f 3 4 、0 1 3 5 、0 1 3 9 和o f 4 3 与o t 3 2 相比仅存在相同性质的氨基酸的替代，即氨 基酸保守性突变( c o n s e r a t i v em u t a t i o n ) ，这些抗菌肽成分在黑翅土白蚁t e r m i c i n 成分中所起的作用很有可能与0 1 3 2 相同。如以其它抗菌肽组份为参照，完全有 可能两个抗菌肽组份的氨基酸序列仅存在保守性的突变，推测它们在白蚁体液免 疫系统中起着极为相似的作用。一些含量极少且与其它含量较多的在功能上又极 为相似的t e r m i c i n 基因，可能将在长期的进化过程中逐渐被淘汰掉。 对判断基因是否为正选择的重要指标d n d s 的值分析表明，黑翅土白蚁 t e r m i c i n 前体基因采取正选择的进化方式，t e r m i c i n 基因受到的环境选择压力为 正选择压力。黑翅土白蚁喜爱潮湿环境，并且主要取食潮湿腐烂的富含各种微生 物的纤维素类物质，还具有另一重要特性，即巢内培养真菌作为另一重要食物来 源。来源于环境复杂病原微生物的强环境环境选择压力促使黑翅土白蚁t e r m i c i n 基因产生更多的非同义突变从而形成新的抗菌肽物质。 浙江大学搏上学位论文黄翅大白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基p 司的分了进化 第4 章黄翅大白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基因的分子进化 黄翅大白蚁m a c r o t e r m e sb a r n e y il i g h t 属等翅目i s o p t e r a 白蚁科t e r m i t i d a e 大白蚁属m a c r o t e r m e s ，是等翅目中最为进化的种类。黄翅大白蚁主要分布在四 川、贵州、云南、湖南、湖北、江西、安徽、江苏、浙江、福建、广东、广西、 海南、台湾和香港等地。 黄翅大白蚁属高等土栖类白蚁，是危害堤坝和农林作物的重要白蚁种类之 一。黄翅大白蚁属培菌类大白蚁种类，除去巢群最初阶段以及过分衰老行将消亡 阶段的蚁巢内没有菌圃外，在其它各个时期内都含有数量很多的菌圃。菌圃主要 为白蚁粪便堆集或由工蚁用木材、叶片或干草嚼碎加入唾液制成，菌圃内含丰富 的真菌种类，可为白蚁提供丰富食物来源。黄翅大白蚁菌圃种类相对黑翅土白蚁， 数量要少，其形状成不规则的块状，菌圃孔为长形，且菌圃上生长的白球菌的个 体比黑翅土白蚁的大，但数量少。黄翅大白蚁生物学特性与黑翅土白蚁相似，但 取食危害对象不如黑翅土白蚁广泛，主要危害堤坝和农林作物。 4 1 实验方法 。 根据报道的白蚁t e r m i c i n 的c d n a 序列的保守性，设计特异性5 引物( 含 起始密码子a t g ) p 1 ：a t ga a ga c tc t c g c t a t cc t g ，p c r 程序为9 4 c ， 2 m i n ；4 0 x ( 9 4 。c ，2 0 s ；5 3 。c ，3 0 s ；7 2 c ，3 0 s ) ，7 2 。c ，1 0 m i n ，3 引物为建库试剂盒 自带的3 c d s 引物( 含p o l y t ) 。目的条带的回收、转化、连接及i p t g 和x g a l 蓝白斑筛选见第2 章实验材料与方法。白色菌斑经m 1 3 载体引物p c r 检测后， 摇菌送检测序。网上b l a s t 比对分析，对测序结果分类整理。 4 2 实验结果 4 2 1 测序结果统计 共计送测1 1 5 个筛选克隆，测序结果为9 7 个阳性克隆，1 8 个假阳性，共计 编码3 7 个不同的抗菌肽。统计结果见表4 1 。 表4 1 结果表明，送测样品总共含8 4 3 5 的阳性克隆，其中编码抗菌肽m b l8 的克隆最多，占总阳性克隆数的2 3 7 1 ，其次为m b 3 、m b l 3 、m b 3 1 、m b 2 8 和 浙江人学博十学位论文黄翅大白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基闪的分了进化 m b 2 7 对应的克隆，分别占1 0 3 1 、9 2 8 、7 2 2 、6 1 9 和5 1 5 ，其余肽对 应的阳性克隆数均在3 及其以下，阳性克隆数为1 的抗菌肽有2 7 个，占抗菌肽 总数的7 2 9 7 ，即2 3 以上的抗菌肽对应的基因仅检测到一次表达。 我们根据m r n a 翻译形成蛋白，推测m b l8 为该白蚁受到病原物侵染后， 存在于白蚁体内的主要抗菌肽成分，其次为m b 3 、m b l 3 、m b 3 1 、m b 2 8 和m b 2 7 ， 而其它对应的基因表达次数仅为1 到2 次的肽，由于在白蚁体内的含量极低，很 可能在白蚁体内无法检测到。 浙江人学博士学位论文 黄翅人白蚁抗菌肽t e r m i c i n 皋凶的分子进化 表4 1 黄翅大白蚁t e r m i c i n 阳性克隆数及在总克隆数中所占的比例 t a b l e4 1n u m b e r so fp o s i t i v ec l o n e sa n dt h er e l a t i v er a t i o st ot h et o t a ln u m b e r so fc l o n e so f m b a r n e y i 4 7 浙江人学博l 二学位论文 黄翅人白蚁抗菌肽t e r m i c i n 基冈的分子进化 4 2 2 根据测序结果推导的成熟肽氨基酸序列 根据核苷酸序列，利用蛋白质在线翻译网站( h t t p ：e x p a s y o r g t o o l s d n a h t m l ) 和已知报道的白蚁t e r m i c i n 氨基酸序列，推导出黄翅大白蚁t e r m i c i n 前体基因 编码的氨基酸序列。成熟肽氨基酸序列经c l u s t a l x 生物分析软件比对，比对结果 再由g e n e d o c 编辑处理，按照比对结果对成熟肽进行编号。再根据信号肽在线 预测网站s i g n a l p 3 0 ( h t t p ：w w w c b s d t u d k s e r v i c e s s i g n a l p ) ，对上述翻译形成 的氨基酸序列进行信号肽及成熟肽氨基酸序列的预测。成熟肽氨基酸序列经 c l u s t a l x 生物分析软件比对，按照比对结果对成熟肽进行编号，结果见表4 2 。 表4 2 结果表明，黄翅大白蚁t e r m i c i n 的m r n a 序列翻译形成的大部分 t e r m i c i n 成熟肽( 3 2 个) 含3 7 个氨基酸残基，占少数的m b l 2 、m b l 7 和m b 2 1 含4 9 个氨基酸残基，m b 3 5 含4 4 个氨基酸残基。除m b 3 6 和m b 3 7 的c 末端酰 胺化外，其余所有成熟肽c 末端并不酰胺化，m b 3 6 和m b 3 7 最终在白蚁体内形 成只含3 6 个氨基酸残基的成熟肽，最后的一个苷氨酸残基在成熟肽形成过程中 被自动切除掉。 4 8 浙江大学博上学位论文 黄翅大 蚁抗菌肽t e r m i c i n 基凶的分子进化 表4 2 黄翅大白蚁t e r m i e i n 抗真菌肽编号及氨基酸序列 t a b l e4 2n u m b e r so f t h ep e p t i d e sa n da m i n oa c i ds e q u e n c e so f m b a r n e v it e r m i c i n 编号成熟肽氨基酸序列 m b l m b 2 m b 3 m b 4 m b 5 m b 6 m b 7 m b 8 m b 9 m b l 0 m b l l m b l 2 m b l 3 m b l 4 m b l 5 m b l 6 m b l 7 m b l 8 m b l 9 m b 2 0 m b 2 1 m b 2 2 m b 2 3 m b 2 4 m b 2 5 m b 2 6 m b 2 7 m b 2 8 m b 2 9 m b 3 0 m b 3 1 m b 3 2 m b 3 3 m b 3 4 m b 3 5 m b 3 6 d c d l d e c w d n c e e e h g r y f r r a y r d g s v c k c v f n d e r d c d i d e c w d d c e e e h g r y f r r a y c d g s v c k c v f n d e r a c n l q q c a y c r a k h g r y f r r a y c e e s l c r c v f n n g r a c n l q q c m 7 c r a k r g n r f r r a y c e e s i c r c v f n n g h a c s l q q c m 7 c r a k h g r y f r r a y c e e s l c r c v f n n g r a c n l q q c w a y c r a k h g r y f rra y c a e s l c r c v f n n g r a c n l q q c w a f c r a k h g r y f r r a y r e e s l c r c v f n n g r a c n l q q c 、 ，a y c r a k h g r y f r r a y c e e s v c k c a f n n g r a c n l q q c r a y c r a k h g r y f r r a y c o g s v c k c a f n n g r a c n l q q c w a n c r a q p g r y f rra y c o g s v c v c v f n n g r a c n l q q c w a n c r a q h g r y f r r a y c q g s v w v c v f n n g r a c y m q q c ，a n c r a q h g r y f r r a y c q g s i c r c a f n n g r w s c g t q f v i j s q a c y m q q c a n c r a q h g r y f r r a y c o g s i c r c a f n n g r a c y t q q c ，a n c r a q h g r y f r r a y c q g s i c r c a f n n g r a c y m r q c w a d c r a q h g r y f r r a y c o g s i c r c a f n n g r a c y m q q c 、m n c r a q h g r y f r r a y c o g s v c r c a f n n g r a c y m r q c w a n c q a q h g r y f r r a y c q g s v c k c a f n n g r s s c g t q f v l j s q a c y m r q c w a n c q a q h g r y f r r a y c q g s v c k c a f n n g r a c y m r q c w a n c q a q h g r y f r r a y c o g s v c k c a f d n g r a c y m r q c w a n c q a q h g r y f rra y c o g s v c k c a f n d g r a c y m r q c w a n c q a q p g r y f r r a y c q g s v c k c a f n n g r s s c g t q f v l t s q a w y m r q c r a n c q a q p g r y f r r a y c o g s v c k c a f n n g r a c y m r q c w a n c q a o p g r y f r r a y c o g s v c k c a f n n g r a c y m r q c a n c l a q p g r y f r r a y c o g s v c k c a f n n g r a c y m r q c w a n c q a q h g r y f r r a y c q g s v c t c a l n n g r d c n m h e c w a y c q a k h g r y f r r a h c e g s i c r c v s n d g r d c n m h e c ，a y c o a k h g r y f rra y c e g s l c r c v s n n g r d c n m h e c ，a y c o a k h g r y f r r a y c e g p l c r c v s n n g r d c n m h e c ，a y c o a k h g r y f r r a y c g g p i c r c v 洲g r d c d m h e c ，a y c o a k h g r y f rra y c e g p l c r c v s n n g r d c n m r e c w a y c o a k h g r y f r r a y c e g p l c r c v s n n g r d c n m h e c ，a y c q a k h g r y f r r a y c e g s l c r c a s n n g r a c y m r q c ，a n c q a k h g r y f r r a y c e g p i c r c v s n n g r a r y m r q c w a n c q a k h g r y f rra y c e g p l c r c v s n n g r a c y m q r c w a n c q a q y g r y f r r a y c e g s s c v c v f n n g t k v v l r s k g c e f q l t c w a t c q a o h q i y f r r a f c d g p t c k c v y v t g g 4 9 浙江人学博十学位论立黄翘人白蚁抗菌肚l i r m w i 月皋目日勺n t 进化 4 2 3 黄翅大白蚁t e r m i c i n 成熟肽氨基酸序列比对 经c l u s t a l x 比对后的成熟肽氧基酸序列再由g e n e d o c 编辑处理，其氧基 酸序列比对结果见圈41 。 acal g r y f r r acgc c g = 围4 1 黄翅大白蚁t e r m i c i n 成熟肚氨基酸序列比对 f i g4 1a l i g n m e n lo fa m i n oa c i ds e q u e n c e so f t h e m a t u r ep e p t i d e so f m b a r n e y i t e r m i c i n 图41 表明，黄翘大白蚁t e r m i c i n 成熟肤氨基酸序列高度相似。相邻成熟肽 之间仅含2 与爪不同的氧基酸。第7 号位的半胱氧酸( c y s c ) 、第8 号位的色氧 酸( x r p - w ) 、第1 1 号位的半胱氧酸( c y s c ) 第1 8 至2 0 号位的酷氨酸( t v r - y ) ， 苯丙氧酸( p h e - f ) ，精氨酸( a r g - r ) 、精氨酸( a r g - r ) 和丙氨酸( a l a a ) 和第 ”盯”们”卵”竹们”蚰卵”扎竹” 浙江大学博上学位论文 黄翅火白蚁抗菌肽t e r m i c i n 摹| 夭l 的分子进化 3 1 号位的半胱氨酸( c y s c ) ( 共计9 个位点，图4 1 中黑色部分) ，为黄翅大白 蚁t e r m i c i n 保守氨基酸残基，在所有的成熟肽氨基酸序列中保持不变，其余所有 位置的氨基酸残基均存在不同程度的变异。黄翅大白蚁的半胱氨酸的分布呈典型 的d e f e n s i n 分布型，分子内可形成2 3 对二硫键，二硫键的形成在维持蛋白的 结构及保持其生物活性方面起着重要的作用。 4 2 4 黄翅大白蚁t e r m i c i n 成熟肽氨基酸序列替代 以出现次数最多的m b l 8 做参照，分析黄翅大白蚁t e r m i c i n 家族氨基酸替代 情况，结果见表4 3 。 表4 3 结果表明，与黄翅大白蚁t e r m i c i n 肽中最为常见的m b l8 相比，大部 分氨基酸的替代主要发生在极性氨基酸或非极性氨基酸与酸性氨基酸或碱性氨 基酸之间的替代，极性与极性，极性与非极性，非极性与非极性之间的替代也较 多，碱性与酸性氨基酸的替代较少，仅出现两次，即m b l 和m b 2 的第5 号的天冬 酰胺( a s p d ) 替代碱性氨基酸精氨酸( a r g r ) ，在所有黄翅大白蚁t e r m i c i n 肽 的氨基酸替代中，并没发现酸性氨基酸之间的相互替代。m b l 7 的前3 7 个氨基 酸残基与m 1 8 的氨基酸序列一致，但比m 1 8 多出1 2 个氨基酸。m b l 2 、m b 2 1 和m b 3 5 的前3 7 个氨基酸与m b l8 高度相似，但都比m b l8 多出7 1 2 个基酸， 且多出的氨基酸残基部分也存在一定程度的变异。m b 3 6 和m b 3 7 与m b l 8 相比， 差异最大，存在1 7 个氨基酸位置的替代，主要存在于极性与非极性，以及极性 或非极性与碱性氨基酸的之间的替代。m b l 和m b 2 与m b l 8 分别存在1 5 个位置 氨基酸位置的替代，且主要存在于极性或非极性氨基酸与酸性氨基酸之间的替 代，分别为9 个和1 0 个。 浙江大学博上学位论文黄翅大 j 蚁抗菌肽t e r m i c i n 基阅的分予进化 表4 3 黄翅大白蚁t e r m i c i n 成熟肽氨基酸替代分析 t a l b e4 3a n a l y s i so fs u b s t i t u t i o no fa m i n oa c i d so ft h em a u t r ep e p t i d e so f 胍b a r n 卵i t e r m i c i n 编号极极非非极非碱碱极非酸极月 碱酸碱总计 m b l 3 24 一 m b 2 3 24 m b 33 1 02 8 3 2 m b 43 1 02 8 3 2 m b 53 1 02 8 3 2 m b 63 1 02 8 3 2 m b 732 8 3 2 m b 83 1 0 - m b 93 7 1 0 一 m b l 033 2 m b ll3 2 93 2 m b l 242 8 m b l 342 8 m b l 442 8 m b l 5 2 8 m b l 6 一一 m b l 7 一一 m b l 8 一一 m b l 9 一一 m b 2 0 m b 2 1 一一 m b 2 22 - m b 2 3 m b 2 4 m b 2 5 3 3 m b 2 63 1 1 02 8 3 2 m b 2 73 1 02 8 3 2 m b 2 83 1 02 8 3 2 m b 2 93 1 0 2 8 3 2 m b 3 0 1 1 02 8 3 2 m b 3 13 1 02 8 3 2 m b 3 23 1 02 8 m b 3 3 2 8 3 2 m b 3 4 2 8 3 2 m b 3 5 3 2 4 4 4 4 2 5 4 1 0 4 4 4 4 1 2 3 3 3 3 2 7 3 3 2 5 2 7 乃3 2 7 3 3 2 7 3 3 3 3 2 7 3 3 2 7 3 3 2 8 3 0 1 5 3 0 3 7 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 3 0 5 3 0 5 3 0 5 3 0 5 3 0 5 3 0 3 0 5 3 0 3 0 3 0 、| 3 | 6 t 9 | 、2 | 13 14 3 5 3 6 、f 3 6 f 9 、0 1 2 13 14 3 5 3 6 2 6 2 6 2 6 2 6 2 5 2 6 2 5 兕6 1 0 3 5 1 6 陀5 3 5 、| 6 f 2 5 l 6 2 5 1 6 2 5 、f 3 6 2 5 1 6 2 5 1 6 2 5 2 5 2 5 2 5 m b 3 66 10 3 3 24 16 2 3 2 7 一 3 2 5 1 2 2 4 2 551 5 1 2 2 5 5 5 1 1 2 1 4 2 5 5 门2 门4 2 5 5 1 2 1 4 2 5 5 1 2 1 4 5 门2 门4 2 4 5 1 2 1 4 5 1 2 1 4 5 1 2 门5 3 0 5 1 2 3 0 5 1 2 5 1 2 5 1 2 1 2 5 门2 3 4 1 5 1 5 1 5 ，2 3 1 5 3 0 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 1 4 2 1 4 s | 6 | 、s f 3 0 3 7 5 1 1 7 3 7 1 l 1 3 5 2 坦8 6 7 7 5 5 5 4 3 一 一2 2 2 眩他b b m 7 9 9 浙学博- 学位论i 黄越 口蚁抗茁肽t e r m l c l n 攥w 的分于进化 注：表格中数宇除最后一栏袁示氨基酸替代总数外。其余表示发生氪基酸替代的氩基酸残基 在其成熟肤氪基酸序列中所处的位点。 4 2 5 黄翅大白蚁常见t e r m i e i n 前体信号肽预测 抗菌肢的完整c d n a 序列常由5 端非编码区( 5 u t r ) ，从起始密码子开始 到终止密码子的前体基因序列和3 非编码区( 3 u t r ) 组成。其中前体基因序列 常由从起始密码于开始的编码2 0 3 0 个氨基酸序列的信号肤区( p r e r e g i o n 或 s i g n a l r e g i o n ) ，位于信号肽之后的间隔肽区( p r o r e g i o n ，常编码1 0 个以下的小 肽) ，和位于间隔肽之后的成熟肽区( m a t u r e r e g i o n ) 组成。我们利用s i g n a l 30 分析网站对黄翅大白蚁常见的t e r m i c i n 前体序列进行分析，其信号肤预测结果见 图42 。 p 0 ；l o 图 2 黄翅大白蚁常见t e r m i e i n 前体信号肚预测 f i g 4 , 2p m d i e t i o no fs i g n a lp e p t i d eo f t h en o r m a l t e r m i c i np r e c u r s o r o f m b