（作物遗传育种专业论文）嗜冷纤毛虫euplotes+focardii的适冷atp酶dna的分析鉴定.pdf

嗜冷纤毛虫e u p i o t e sf o c a r d i i 的适冷a t p 酶的分析鉴定 摘要 随着工业生产过程中对生物催化剂的迫切需要，人们长期致力于寻找各种催化酶类。 与有机合成物相比，生物催化剂通常有更好的选择专一性。可更有效地生产目的产物，减 轻环境负担。尽管目前已发现3 0 0 0 多种不同酶类，许多已应用于工业生产，仍不能满足所 有需要，重要原因是许多催化酶不能承受反应条件。因此，极端条件下能够生存的微生物 受到了广泛的关注，它们是宝贵的新型酶资源。 来自嗜冷型生物的酶类已有应用价值，部分原因是由于它们能起到工业加工中降低能 耗的作用。它们被广泛应用于去垢添加剂，纺织工业，食品工业，生物除污，生物催化等 领域。例如，将其应用于去垢剂上，用这些酶能够在较低温度下去污，对于发展洗涤行业 是可行的。这些蛋白酶中，嗜冷蛋白酶、淀粉酶或脂肪酶有很大的商业潜能。几种食品加 工过程也将受益于低温酶类的实用性。嗜冷微生物的许多酶类的典型特征是在中等的温度 下高催化活性和低温稳定性，将这些酶类用于低温保存等方面的研究已成为热点。 利用工程技术将极端微生物，特别是嗜冷微生物的特异功能片段载入一般生物体内成 为当今研究的重点。这就需要对嗜冷生物有充分的了解。而纤毛虫是一种良好的模式生物， 因其取材方便、实验方法可行、生物周期短、具有遗传改造和表型分析手段。但纤毛虫的 基因组现今仍是空白。 本研究采用南极发现的嗜冷纤毛虫e u p l o t e s 鼻o c a r d i i 为实验原料，在建立其d n a 文库 的过程中得到一条基因，旨在通过其氨基酸序列的推测，进而推测其生物功能。 利用多种试剂盒，使目的d n a 的质量和纯度都得到保证。对了解适冷酶机制，进而应 用其进行工业化生产，做出贡献。 关键词：游仆虫e u p l o t e sf o c a r d iid n a 文库试剂盒氨基酸序列 c h a r a c t e riz a tio no ft h ec oid - a d a p t e da t p a s ed n af r o mt h e p s y c h r o p h iiic cii ia t ee u p l o t e sf o c a r d i i a b s t r a c t o w i n g t ot h es t r i n g e n tr e q u e s to ft h eb i o c a t a l y s td u r i n gt h ep r o c e s so ft h ei n d u s t r yp r o d u c e ， p e o p l eh a db e e ns e e k i n gt of i n d i n go u te v e r yk i n d so fk i n a s et h e s ey e a r s c o m p a r i n gw i t ht h e s y n t h e t i c a lo r g a n i c ，t h eb i o c a t a l y s th a sb e t t e rc h a r a c t e r i s t i ci ns p e c i f i c s e l e c t i o n i tc o u l db eu s e d t op r o d u c to b j e c t i v e - p r o d u c t i o ne f f e c t i v e l ya n dr e l i e v et h es t r e s so ft h ee n v i r o n m e n t ，a l t h o u g h ， u n t i ln o wi th a sb e e nf o u n dm o r et h a n3 0 0 0k i n d so fe n z y m e sa n dm a n yo ft h e mh a v eb e e n a l r e a d ya p p l i e di n d u s t r y , t h er e q u i r e m e n t so ft h e ms t i l ln o tb e e ns a t i s f i e d ，t h eb a s i cr e a s o ni st h e k i n a s ec o u l dn o tu n d e r g os o m et y p eo ft h er e a c t i o nc o n d i t i o n v i e w i n gt ot h i sp o i n t , t h e m i c r o o r g a n i s mo fw h i c he x i s t si nt h ee x t r e m ec o n d i t i o np l a yam o r ea n dm o r ei m p o r t a n tr o l ei n n o w a d a y s ，t h e ya r ep r e c i o u sn e wt y p er e s o u r c ei nt h i sf i e l d t h ee n z y m e sf r o mt h ep s y c h r o p h i l i co r g a n i s mf a m i l yh a v eb e e na p p l i e d ，p a r t l yb e c a u s eo f t h ef u n c t i o nw h a tc o u l dc u td o w nt h ee n e r g ye x p e n d i t u r ed u r i n gt h ei n d u s t r ye l a b o r a t i o n t h e y a r eu s e dw i l d l yi nd e t e r g e n ta d d i t i v e s ，t e x t i l ei n d u s t r y ，f o o di n d u s t r y ，b i o r e m e d i a t i o na n d b i o c a t a l y s i s f o re x a m p l e ，i fw e u s ei to nt h ed e g r e a s e r , i ts h o u l db ee f f e c t i v ei n d e c o n t a m i n a t i o nu n d e rt h el o wt e m p e r a t u r e ，i ti st o t a l l yf e a s i b l ef o rt h e mt oa p p l i e di nt h e l a v e m e n tv o c a t i o n ，a l s ot h e r ei sav e r yh u g eb u s i n e s sp o t e n t i a lt ou s et h ee n z y m es u c ha s p r o t e a s e ，p s y c h r o p h i l i cp r o t e a s e ，a m y l a s e ，l i p a s ea n di nf u r t h e r i n gc o n s i d e r i n g ，n o to n l yt h i s v o c a t i o nb u ta l s ot h ef o o dp r o c e s s i n gw i l lg e tt h eb e n e f i tf r o mt h eu t i l i t yo ft h e s ep s y c h r o p h i l i c e n z y m e s t h et y p i c a lc h a r a c t e r i s t i co ft h e mi sh i 【g hc a t a l y t i ci nm o d e r a t et e m p e r a t u r ea n d s t a b i l i t yi nl o wt e m p e r a t u r e t h ea p p l i c a t i o no fc o n s e r v i n gi nl o wt e m p e r a t u r eo f t h e s ee n z y m e s h a sa l r e a d yb e c o m et h ew a r ms p o t s u s i n gt h eb i o t e c h n o l o g yt oi n t r o d u c et h ee s p e c i a lf u n c t i o n a lf r a g m e n t so fe x t r e m o p h i l e s ， e s p e c i a l l y , t h ep s y c h r o p h i l i co r g a n i s m si n t ot h en o r m a lo 略a m s m sb e c o m e st h ei m p o r t a n tp o i n t i nr e s e a r c h i n g s oi tn e e d st h ek n o w l e d g eo nt h ep s y c h r o p h i l i co r g a n i s m t h ec i l i a t e si sak i n d o fg o o dt e s tm o d el i v i n g ，b e c a u s ei ti se a s yt oo b t a i n ，t h ew a yo fe x p e r i m e n ti sf e a s i b l e ，i t s b i o c y c l ei ss h o r ta n dq u a l i f yo fg e n e - r e f o r m i n g ，p h e n o t y p ea n a l y s i s ，b u tu n t i ln o wt h eg e n o m e o ft h ec i l i a t e si ss t i l lab l a n k t h ee x p e r i m e n tu s et h ep s y c h r o p h i l i ee u p l o t e sf o c a r d i ia st h em a t e r i a l sw h i c hh a db e e n f o u n di na n t a r c t i c ，d u r i n gt h ep r o c e s so ft h ed n a b a n k - e s t a b l i s h i n g ，o b t a i n e dag r o u po fg e n e s ， a i ma tp r e s u m i n gt h eb i o l o g i c a lf u n c t i o nt h r o u g hs u p p o s i n ga m i n oa c i ds e q u e n c e s m a n yk i n d so fk i t sw e r eu s e dt om a k eg u a r a n t e et h a tt h eq u a l i t ya n dp u r i t yo f d e s i r e dd n a ， f o rc o m p r e h e n d i n gt h em e c h a n i s mo fp s y c h r o p h i l i ce n z y m e ，f u r t h e r i n gf o rm a k i n gc o n t r i b u t i o n t ot h ei n d u s t r yp r o d u c t i o n k e yw o r d s ：e u p l o t e sf o c a r d i i d n aii b r a r y k i t s a m i n oa c i ds e q u e n c e i i 独创性l 声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得吉林农业大学或其它教育机构 的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均 已在论文中作了明确的说明并表示了谢意。 学位论文作者签名： 糯 签字日期抄宕年5 月j 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解吉林农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或 扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意吉林农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。( 保密的学位论文在解密后应遵 守此协议) 学位论文作者签名：袖 签字日期：沏野! 砖j 日 导师签名： 雾鬟 q 签字日期：球j 月乡日 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文嗜冷纤毛虫e u p l o t e sf o c a r d i i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鉴定 第一章文献综述 1 1 极端生物 1 1 1 极端生物的定义 极端生物( e x t r e m o p h i l e s ) 是指在极端环境下( 包括高温、高压、高盐、高低p h 值等) 能够正常生存的生物群体的统称。 1 1 2 极端生物的分类及举例 1 1 2 1热适应生物( h o ta d a p t e dm i c r o o r g a n i s m ) 可分为超嗜热型( h y p e r t h e r m o p l i i u s ) 、嗜热型( t h e r m o p h i l i e ) 和耐热型( t h e r m o p h s ) ( 表1 ) 2 1 。 目前己发现2 0 多个属，大多数是古细菌，广泛分布于温泉、堆肥、煤堆、有机物堆、 强烈太阳辐射加热的地面、地热区土壤以及陆地和海底火山喷口附近或其周围区域口1 等高 温环境。例如，李安明等1 从四川康定热泉中分离一株厌氧嗜热菌，可发酵木聚糖；又 如龚革等3 从生活废水的厌氧污泥床的样品中分离出9 株嗜热甲酸盐产甲烷菌 ( m e t h a n o b a c t e r i u mt h o r m o f o r m i c i c u m ) ；在冰岛，有一种嗜热茵可在9 8 的温泉中生 长；在美国怀俄明州黄石国家公园的含硫热泉中，曾经分离到一株嗜热的兼性自养细菌一 一酸热硫化叶菌( 勋而j 拍姻) ，可在高于9 0 。c 温度下生长口1 ；又在俄罗斯地堪察加里的 温泉里( 5 7 。c 9 0o c ) 发现存在着红色栖红菌( h e r m u st u b e r ) ；1 9 7 7 年，在温度高达 3 5 0 。c 的东太平洋海底发现了包括嗜热菌和古细菌的特殊深海生物群落。 1 1 2 2 冷适应生物( c o l da d a p t e dm i c r o o r g a n i s m ) 可分为嗜冷型( p s y c h r o c o p h i l e s ) 和耐冷型( p s y c h r o t r o p l i s ) ( 表1 ) 瞳1 。 此类生物主要分布于常冷环境中，如南北极脚、深海、冰窖、终年积雪的高山、冻土 地区呻1 。同时其具有广泛的微生物的区系，已发现的嗜冷生物既有真细菌、蓝细菌，又有 酵母菌、真菌、藻类、原生动物及古细菌n 3 。例如，r a y 嘲从南极土壤中筛到一株分泌酸性 蛋白酶的耐冷菌( 仍门出幽h u m i c o l a ) ；又如，f e l l e r n 叩从海水中筛选四株分泌脂酶的嗜 冷莫拉氏菌，该菌在4 c 生长良好，在1 8 。c 细胞繁殖和酶分泌将会受到影响；南极气温可 低达- 6 0 ( 3 以下，最高5 c ，从那里分离到了隶属芽孢杆菌属、分枝杆菌属( m y c o b a c t e r i u m ) 、 微球菌属( m i c r o c o c c u s ) 等的细菌、隶属链霉菌属和诺卡氏茵属等属的放线茵；耶尔森 氏茵( y e r s i n i a ) 是美国医学家在2 0 世纪2 0 年代中后期发现的，其抗寒力强，在o c 以下 仍能生长繁殖，4 c 更为适宜。各种蔬菜、水果最易受到它的污染。吃了这种菌感染的食 物，会引起耶氏茵肠炎。耶氏茵肠炎的症状与一般肠炎相似，如腹泻、腹痛、恶心、呕吐 等，通常称为“电冰箱病”n 1 。 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文嗜冷纤毛虫b u p l o t e sf o c a r d i i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鉴定 表1热适应生物及冷适应生物分类 t a b i e1 c i a s s i f i c a t i o no f h o ta d a p t e do r g a n i s i na n dc o i da d a p t e do r g a n is m 1 1 2 3 酸适应生物( a c i da d a p t e do r g a n i s m ) 可分为嗜酸型( a c i d o p h i l e s ) 和耐酸型( a c i d p l i s ) ( 表2 ) 幢1 。 此类生物主要生长在酸性环境，硫矿和金属硫化矿酸性矿水，煤矿排出水、含硫的酸 性土壤、酸性热泉盯1 以及其它人为酸性环境等。若以物种对营养要求，将这类生物分为化 能自养和化能异养。前者已报道7 个属5 个种，后者已报道5 个属1 0 个种乜1 。嗜酸硫杆菌是 一种能进行化自养和化能异养生长的细菌，最适p h 值在3 0 - - 3 5 2 _ 间。一些嗜酸嗜热的芽 孢杆菌( b a c i l l u s ) ，在6 0 c 6 5 。c 、p h 值3 - - - 4 的条件下，生长速率达到最大。这类生物 能利用碳水化合物或氨基酸作为营养源。嗜酸热原体( t h e r m o p l a s m aa c y d o p h i l u m ) 是在 酸热环境中生长繁殖的一种最异常的生物，它的最适生长温度为5 9 c ，最适p h 值为2 左右， 无细胞壁，对营养要求相当复杂，必需利用酵母膏作为营养基质，且必须有天然的有机营 养才能生长。此外，在酸性环境中，还生活着许多嗜酸的真核微生物，如椭圆酵母、红酵 母等。有一种头孢霉( c e p h a l o s p o r i u m ) ，能在浓度为l o 以上的硫酸中生长，它是迄今 发现的抗酸能力最强的微生物口1 。曾焕泰等n 妇从污泥中分离得到一株嗜酸光合细菌 ( r h o d o p s e u d o m c m a sa c i d o p l i j a ) 。其中一种叫氧化硫杆菌( y h i o b a c i i l u st h i o o x i d a n s ) 的细菌在p h 值o 5 时仍能存活。 1 1 2 4 碱适应生物( a l k a lia d a p t e do r g a n i s m ) 可分为嗜碱型( a l k u l i p h i l e s ) 和耐碱型( a l k a l i t o l c i a r i l ) ( 表2 ) 埋。 此类生物自从1 9 2 8 年d o w n i ea w 发现第一个嗜碱菌( s t r e p t o c c u sf a e c a l i s ) 以来瞄1 ， 大量不同类型的嗜碱生物已从土壤、碱湖、碱性泉、海洋，甚至在一些中性环境中n 2 1 分离 得到，包括细菌、真菌和古菌，例立l h o r i k o s h u n 3 3 发现可产生碱性纤维素酶的嗜碱芽孢杆 菌n - 4 ( a l k a l o p h i l i cb a c i l l u ss p ) ；又如陈漱浈n 4 1 从内蒙古碱湖中分离出来一株嗜碱 菌n o 1 0 一1 ，其生长p h 值为8 1 3 ，最适时值为1 0 1 1 ，此菌好气，杆状，具纤毛，可生产 碱性淀粉酶；又如，巴氏芽孢杆菌( b a c i l l u sp a s t e u r i i ) 、嗜碱芽孢杆菌( b a c i l l u s a l c a l o p h i l u s ) 等细菌；在高p h 值的碱水泉中，曾分离出一种黄杆菌( f l a v o b a c t e r i u m ) ， 它在p h 值1 1 4 的条件下生长良好；在出现富营养化的石灰湖水体中，也发现了许多嗜碱蓝 2 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文嗜冷纤毛虫点u p l o t e s f o c a r d i i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鉴定 细菌，它们的最适p h 值在9 1 0 之间；有一种藻类甚至能在p h 值1 3 的强碱条件下生长，这 是迄今发现的抗碱值最高的适碱生物；近年来，人们还发现了进行光合作用的嗜碱细菌n 1 。 表2 酸适应生物及碱适应生物分类 t a b l e2 c i a s s i f i c a t i o no fa c i da d a p t e do r g a n is ma n da ik a f a d a p t e do r g a n is m 1 1 2 5 适盐生物( s a l ta d a p t e do r g a n i s m ) 可分为嗜盐型( e x t r e m e l a l o p h o t o ) 和耐盐型( m e h a l o t o l e r a n t ) 1 2 1 。 前者一类在一定浓度盐中可正常生长，且高浓度盐是生长必需条件的微生物；后者是 类能耐受一定浓度盐溶液，但在无盐条件下也可正常生长的微生物。一般生活在含 1 0 - - - 2 0 盐成分的天然碱湖中，在晒盐场、盐湖、腌制品中以及世界上著名的死海中i l 副【l o j 也有分布，目前已在埃及的w a d in a t r u n ，美国的o w e n 分离出一些极端嗜盐菌【l7 1 。例如， 田新玉【l8 】从内蒙古哈马合碱湖分离得到一株多形态嗜盐菌( n a t r o n o b a c t e r i u mi n n e r n o n g o l i a e ) ；又如，王振雄【1 9 】从内蒙古马都倬盐湖分离到和嗜盐碱菌( n a t r o n o b a c t e r i u m i n n e rn o n g o l i a e ) 和嗜盐碱菌y 2 1 ( n a t r i a l b aw u d u n a o e n s i s ) 。在盐度高达2 3 2 6 的死海有 少数几种细菌能i - , 很z 好的生存，如盐生盐杆菌( h a l o b a c t e r i u m h a l o b i u m ) 。 1 1 2 6适压生物( b a r oa d a p t e do r g a n i s m ) 可分嗜压型( b a r o p h i l e s ) 和耐压型( b a r o t o l e r a n t ) 埋。 前者指一类大多数生活在深海底及深油井中，能耐受普通生物不能忍耐的高压多数 生长在0 7 o 8m p a 环境中，高的可达1 0 4 m p a 以上，低于0 4 o 5 m p a 贝u 不能生长；后者 指一类能耐受一定高压，但也可在低压环境中正常生长的生物。例如，从深海底部 1 0 1 ，3 2 5 个m p a 处，分离到假单胞菌( p s e u d o m o n a sb a t h y c e t e s ) ，在1 0 1 3 1 0 8 p a 、3 c 下培养，经潜伏期四个月后开始繁殖，3 3 天后菌量倍增，一年后达到静止期；在1 0 ，0 0 0 米的深海，水压高达1 1 5 ，5 1 0 m p a 处仍发现有生物；有人曾经在太平洋靠近菲律宾的1 0 8 9 7 米深的海底分离到了嗜压细菌，还发现嗜压的酵母菌；从深3 5 0 0 m ，压强约4 0 5 1 0 7 p a ， 温度为6 0 。c 1 0 5 。c 的油井中曾分离到一种嗜压井嗜热的硫酸盐还原菌。 1 1 2 7 适强辐射生物( h e a v yr a d i a t i o na d a p t e do r g a n i s m ) 自然界中广泛分布着抗各种幅射( 如紫外线、可见光、红外线、x 射线、咖玛射线和 宇宙射线) 的生物，海洋中的一种鞭毛虫( b o dm a r i n e ) ，即使在紫外线剂量为0 0 1 1 1 焦耳，平方毫米的条件下仍能有约1 0 的细胞存活乜训。 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文嗜冷纤毛虫e u p l o t o s ，o c a r d i i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鉴定 1 1 2 8 其它 除以上几类外，还有生存在高金属浓度下的嗜金属生物。 由于极端生物生存环境的特殊性，环境中某一种极端因子常常与另一种或几种极端环 境因子同时出现，故产生一些适应多方面极端环境的生物种群。例如田新玉等n 踟从内蒙古 哈马台碱海分离得到一株多态嗜盐嗜碱菌( n a t r o n o b a c t e r i a mc y t l l e r y n o r g o l i a e ) ，其 生长的n a c l 浓度范围为1 2 3 0 ，生长p h 值范围7 8 1 0 4 。此外还有嗜热嗜压菌、嗜 热酸、嗜热碱等极端微生物。深海是高压低温域( 中温型微生物 低温型微生物，离子对的转移和弱的相互作用是提高 嗜冷酶结构高弹性和可变性的关键。f e l l e r 等对耐冷型g o r a x e l j as p 产生的3 种脂酶的氨 基酸序列比较研究表明，嗜冷酶的一级结构发生微小的变化就足以能够改变其折叠状态的 柔韧性，从而解释其在0 低温时仍具有高活性的现象。a r p i g n y 等h 对南极耐冷菌 p s y c h r o b a c t e r i 脚o b i l is p 的脂酶序列的分析表明，该脂酶中稳定的碱性残基精氨酸与 精氨酸一赖氨酸的摩尔比例比嗜温微生物及嗜热微生物中的比值低得多。在嗜冷性脂酶 中，精氨酸等稳定性残基的低数量可能有助于形成更为柔性的三级结构。另外，增加的甘 氨酸残基可能会起到有利的促进作用，在低温催化过程中促进酶的构象改变。这些特性可 能与该脂酶的冷适应性有关。 f e l l e r 等建立的计算机模型也表明，嗜冷蛋白酶含有大量带负电荷的氨基酸残基，特 别是天冬氨酸残基；分子表面的4 个极性环状结构呈伸展状态，分子内缺少离子间作用与 疏水作用。这些结构特征使酶分子呈松散状态，具有较大的可变性，从而导致酶的热稳定 性降低。 另外在很多嗜冷酶中都可以观察到氢键、离子对的减少，而分子的表面环呈伸展状态， 某些区域还发现表面环的脯氨酸减少。这些结构特征都有利于增加蛋白的柔性，使嗜冷酶 在低温下获得更高的催化效率。通过对假单胞菌产生的q 一淀粉酶的三维结构的研究发 现，其分子表面的柔性和不具刚性的蛋白核心及蛋白内部功能区域之间的较少相互作用是 决定嗜冷酶柔性构象的主要因素。吴虹等h 2 1 认为，含有一个底物更容易接近的活性中心， 具有相对的柔性和小的功能域，减少亚基表面的相互作用，同时缺乏亚基内部离子对作用， 增加暴露在溶剂部分的疏水残基，增加分子内部的离子对等等是嗜冷酶适应低温的分子结 构特征。 1 2 2 5 冷休克蛋白与冷适应 当温度突然降低，细胞中会产生一种冷休克反应，即一种特殊形式的基因表达使细胞 适应这一急剧降低的低温环境j o n e s h 3 1 观察到将叵c d - 枞3 7 突然转移到i o * c 时，会产 生一种冷休克蛋白，主要的冷休克蛋白是c s p a ，它结合于本身基因的启动子上，作为转座 因子对冷诱导基因的表达起作用。在其它细菌中已经发现了它的同源蛋白，主要是在 显s u b t i l i s 中发现的c s p b 蛋白，与c s p a 有6 1 的相似性。现已发现冷休克蛋白在原核和 真核微生物中普遍存在，冷刺激的幅度越大产生的冷休克蛋白就越多。r a y 1 等以大肠杆 菌的c s p a 为探针，检测了分离自南极的耐冷菌中冷休克基因的存在及表达，发现有些耐冷 菌在2 2 c 和4 时冷休克基因能经常表达，有些耐冷菌当温度从2 2 ( 2 突然降到4 ，l h 后 c s p a 表达量最大。 除冷刺激蛋白之外，还存在第二类蛋白，称为冷适应蛋 刍c a p s ，同冷刺激蛋白相比， c a p s 在低温环境中是对应温度生长速度连续合成的。耐冷菌由于生活在温度波动的环境 中，它们必须耐受温度的快速降低，这与它们产生的冷休克蛋白是密切相关的。冷休克蛋 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文嗜冷纤毛虫e u p l o t e s f o c a r d i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鉴定 白不仅在原核生物和真核生物中普遍存在，并且发现它与真核生物的d n a 结合蛋白具有很 高的相似性，其具体功能有待于进一步研究。在冷适应期间，至少有1 5 种不同的冷休克蛋 白被诱导合成。 1 2 3 冷活性酶的结构柔韧性 冷活性酶( c o l da c t i v ee n z y m e ) 又称嗜冷酶( p s y c h r o p h i l i ce n z y m e ) ，是主要发 现于冷适应微生物细胞中的一类在低温范围内具有较高催化活性的酶类h 引。 冷适应微生物通过其产生的冷活性酶来调节它们的代谢活动，以此适应低温环境。冷 活性酶在低温条件下所表现的催化活性是通过其结构的柔韧性( f l e x i b i l i t y ) 实现的。 酶的柔韧性与其催化功能密切相关，整个蛋白质或某个功能域结构的柔韧性使蛋白质或酶 的构象更容易改变，从而减少低温催化时的活化能。因此，增加的柔韧性是冷活性酶低温 催化活性最主要的特征。但同时，增加的柔韧性也会导致冷活性酶的稳定性下降，使冷活 性酶在中温和高温条件下很快变性失活。研究冷活性酶结构的柔韧性、稳定性和酶活性之 间的相互关系可揭示冷活性酶低温催化的机制、理解蛋白质结构与功能之间的关系，为人 工改造冷活性酶的热不稳定性提供理论依据。 1 2 3 1 酶的活性、稳定性和柔韧性 酶的活性是指酶的催化能力，酶的稳定性是指酶在不同条件下保持活性的能力。酶的 柔韧性是酶构象间的相互转化，它降低了酶与底物结合时诱导楔合过程中的能量消耗，发 挥酶的催化功能。酶的刚性结构能够在生理温度条件下使蛋白质保持特定的三维构象。所 有蛋白质的柔韧性结构和刚性结构必须保持平衡。一般来说，嗜热酶在室温下催化活性和 催化效率很低，因为酶在室温下的紧密构象阻碍了酶与底物之间的相互作用。相反，冷活 性酶具有较高的柔韧性，酶分子可以消耗较低的能量与底物有效结合，但正是冷活性酶的 柔韧性导致其热不稳定m 1 。 1 2 3 2 冷活性酶柔韧性的结构特征 酶蛋白的氨基酸组成、分子内的化学键，酶蛋白与溶剂分子的相互作用，酶蛋白亚基 问的相互作用和酶蛋白核心的致密度( 核心大小和空间分布) 等因素，都会引起蛋白质柔 韧性发生变化。由于酶分子的柔韧性很难定量测定和描述，导致对冷活性酶柔韧性的结构 基础缺乏足够的实验数据。通过对冷活性酶、中温酶和嗜热酶的蛋白质结构分析显示，与 催化机制有关的氨基酸残基一般来说都是非常保守的，这说明低温催化活性并不是由于活 性中心的改变，而是与活性中以外的其他序列有关。根据已获得的冷活性酶的一级结构和 高级结构，与中温酶和嗜热酶相比冷活性酶具有以下一些结构特征h ”。 1 2 3 3 氨基酸组成 1 2 3 3 1甘氨酸含量增加在推测的酶的活性中心周围存在的甘氨酸可减少酶活性位点 入口处的空间位阻，而且由于甘氨酸无侧链，可以提供绝大多数其他氨基酸所没有的双面 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文嗜冷纤毛虫量u p l o t e sf o c a r d i i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鉴宴 角，从而有利于酶活性位点( 局部) 及整个酶蛋白结构的柔韧性，并为其提供了一个有利 的能量环境。对南极嗜冷菌碱性磷酸酶进行定点突变研究发现，当甘氨酸2 6 2 被丙氨酸取 代后，酶的活性降低，当甘氨酸2 6 1 被丙氨酸所取代后，在酶稳定性降低的同时，酶促反 应的活化能增加。 1 2 3 3 2 脯氨酸、精氨酸残基的数量减少脯氨酸被认为通过调整蛋白质折叠时熵的变 化而影响蛋白质主链的柔韧性，脯氨酸可限制主链的旋转。因此，脯氨酸残基数量的减少 可增强多肽链二级结构之间的柔韧性。精氨酸的胍基中含有3 个氮原子可以与周围残基形 成5 个氢键，同时可与酸性基团形成2 个盐桥，因此，精氨酸通过与酰基主链和侧链形成氢 键而对蛋白质的稳定性起重要作用h 羽。对一株嗜冷菌( p s e u d o a l t e r o m o n a s h a l o p l a n k t i s ) 中的d n a 连接酶进行比较研究，发现了精氨酸所占全部氨基酸比例为5 7 ，。而温酶中为 7 和8 7 ，而嗜热酶中则为1 0 1 。在冷活性酶中精氨酸残基含量较少可降低氢键和盐 键的形成，对冷活性酶结构的柔韧性起作用。 1 2 3 3 3 分子内相互作用减弱冷活性酶中盐桥、芳香环相互作用、疏水作用减弱，分 子间、亚基间以及结构域间的相互作用减弱，在某种情况下还会减少离子键的强度，氨基 酸表面电荷密度减弱，疏水键降低并向溶剂中暴露增加等h 9 j 。与中温同类酶相比，来自南 极嗜冷茵的仅淀粉酶含有少量表面盐桥、少量极性相互作用和低的脯氨酸含量。弱的分 子内相互作用可以通过整个酶分子弱的作用力，也就是酶整体柔韧性( g l o b a l f l e x i b i l i t y ) 实现，也可以通过一个或几个少数重要区域结构的柔韧性，即局部柔韧性 ( 1 0 c a l i z e df l e x i b i l i t y ) 实现。冷活性酶在低温条件下保持较高的催化活性需要弱的 分子内相互作用，这样在低温条件下酶与底物结合时构象变化更容易，实现低温条件下的 催化功能，但同时导致酶稳定性的降低。当过量的疏水表面降低时，冷活性酶的活性中心 失去稳定性。冷活性酶、中温酶和嗜热酶带电表面依次增加。带电表面的增加，引起离子 对的增加，导致酶稳定性的增加。暴露于溶剂中的离子对被认为是嗜热酶在高温时催化适 应的关键。冷活性酶则相反，带电表面减少，而疏水基团向溶剂中暴露。通过疏水荧光探 针( 8 一a n i l i n o 一卜n a p h t a l e n e s u l f o n i e a e i da n s ) 结合实验发现，大多数天然蛋白质因 为其疏水核心被刚性侧链保护不能结合a n s ，当天然蛋白质疏水位点向溶剂中暴露时，结 合染料的能增强。 1 2 3 3 4 环结构( 1 0 0 ps t r u c t u r e ) 增加研究冷活性柠檬酸合成酶时发现，一个延 伸的带电荷的表面环( 1 0 0 p ) 对活性位点区域酶的柔韧性起重要作用呦1 。冷活性酶的肽链 较中温酶和嗜热酶长，为其增加分子表面的环状结构提供了基础。序列分析表明，在许多 冷活性酶的环状结构中插入带电荷氨基酸残基可引起酶的柔韧性发生改变。在嗜热酶中已 经观察到环状长度减少，这可能与酶的热稳定性有关。 在研究冷活性琥珀酸脱氢酶黄素蛋白( n a v o p r o t e i n ，f p ) 大亚基时发现了与环状结 构相似但又不同的结构特征，与酿酒酵母细胞中同一亚基相比，蛋白质氨基酸的序列同源 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文 嗜冷纤毛虫e u p l o t e s ，d c a r d i i 的适冷a t p 酶d n a 的分析鳖塞 性很高，但有3 个位置的氨基酸被在b 转角处出现频率很高的氨基酸( 丝氨酸、天冬氨酸、 苏氨酸) 所取代，我们认为这将使多肽链形成更多转折，从而增加酶的柔韧性哺，这一结 构特征在其他研究中尚未见报道。 1 2 3 3 5空间结构特征冷适应模型研究表明，冷活性酶只是在酶分子很小的区域具柔 韧性，从而影响与其邻近酶活性中心的结构。g e o r l e t t e 等佰2 1 在研究冷活性、中温和嗜热 d n a 连接酶时发现冷活性酶在低温和中温范围内活性较高，整个酶的结构特别是酶的活性 中心是不稳定的，同时具有高度的构象柔韧性。而中温酶和嗜热酶则相反，在低温范围内 活性较低，但却具有较好的稳定性和较低的柔韧性。三维结构模型显示，这3 种酶在二级 结构特别是酶的活性中心部位的二级结构是非常保守的。这说明冷活性酶、中温酶和嗜热 酶的空间结构相似，但当在低温条件下与底物结合时冷活性酶表现出结构的柔韧性。这种 空间结构的柔韧性是由其氨基酸特点、表面电荷、表面疏水性、分子之间的相互作用力等 因素决定的。t s i g o s 等啼3 1 对冷活性碱性磷酸酶进行了定点突变研究发现，冷活性酶主要是 通过局部而不是整体实现酶构象的柔韧性，只改变冷活性酶部分序列就可影响酶活性位点 的柔韧性。通过对冷活性脂酶三维空间结构预测并对位于活性中心的甘氨酸2 4 4 进行取代 研究，结果发现少数氨基酸的改变可引起酶活性中心的柔韧性降低，冷活性和热稳定性取 决于围绕酶活性中心部位局部的柔韧性结构阳1 。因此，冷活性酶构象的柔韧性可能只与酶 分子的一个很小区域有关。并不是每一种冷活性酶都同时具有以上特征，不同的冷活性酶 使用不同的策略保持低温条件下构象的柔韧性。关于冷活性酶的柔韧性结构可以总结为： 冷活性酶中甘氨酸和天冬氨酸含量增加，脯氨酸、精氨酸含量减少；冷活性酶具有弱的分 子内相互作用；冷活性酶更容形成环( 1 0 0 p ) 结构；冷活性酶只是在酶分子很小的区域具 柔韧性，从而影响与其邻近的酶活性中心的结构；冷活性酶、中温酶及嗜热酶的一级结构 特别是酶的活性中心很相似，但酶的高级结构不同，从而造成酶催化功能的不同。 1 2 4 适冷酶分子适冷机制的研究热点 酶是低温微生物适应低温环境的一种极为重要的因素，在低温下为了弥补酶反应速率 慢，低温酶最适酶活温度向低温转移，且在低温( 0 1 0 ) 催化活性高，有些酶的催化 效率是相同种类中温酶的十倍，但酶的热稳定性差5 | 。而最初关于适冷酶分子适冷机制的 研究仅局限于嗜冷、嗜温及嗜热酶之间同源性模型的结构对比，以及部分酶序列片段的比 较分析。最近，随着蛋白质工程、生物物理学和x 射线结晶学等方法发展，使有关的适冷 酶基因、蛋白序列、初级结构、三维分子构象及适冷酶基因的异源表达等方面得到广泛的 研究，同时进一步揭示了适冷酶分子适冷机制唧1 。 1 2 5 适冷酶分子适冷机制的研究方法 目前研究适冷酶冷适应机制的方法主要有3 种。第1 种是比较不同来源的适冷酶结构之 间的差异，对比分析适冷酶适冷的结构基础璐引。第2 种是应用随机、定点突变的方法，即 1 4 吉林农业大学硕( 博) 士学位论文 嗜冷纤毛虫e u p l o t o sf o c a r d i i 的适冷a t p 酶d i q a 的分析鉴崔 在酶基因中引入突变，筛选使酶的作用温度改变的突变，鉴定突变，考察由于突变导致的 酶结构和功能变化，从而确定与适冷相关的氨基酸残基嘲1 。第3 种是选择在系统进化上较 为接近的有机体产生的同功酶进行比较。这样有利于将基因漂移和其它自然选择所造成的 氨基酸变化排除，直接研究导致蛋白质温度敏感的氨基酸变化。近来，一些新技术也应用 于低温酶的冷适应机制的研究中，如错误倾向性p c r 扩增、d n a 步移、增变细胞和中子散射 等技术瞄们。 1 2 5 1 适冷酶分子适冷机制研究热点 1 2 5 1 1重组适冷酶在适冷酶研究取得较大成就的同时，x 射线结晶学、定点突变和 基因工程等技术的发展使重组适冷酶被大量研究。1 9 9 1 年，适冷酶基因首次被克隆到大肠 杆菌，并且从重组克隆中筛选到有活性的基因表达产物嘲1 。而后，通过p c r 技术分离出一 些在表达库中不能检测的基因，这些基因表达出的低温酶与中温酶序列具有高度相似 性。到目前为止，很多适冷酶( 蛋白酶、脂肪酶、柠檬酸合成酶、谷氨酸脱氢酶、几丁 二糖酶、0 c 一淀粉酶及苹果酸脱氢酶等) 基因已经被克隆出来，并且在中温宿主微生物( 大 肠杆菌、杆菌及少数酵母菌) 中得到表达2 儿6 引。 关于重组适冷酶研究热点主要有以下几个方面：首先，适冷酶基因异源表达的温度一 直是许多学者关心的问题。如果适冷酶在接近0 时能在野生菌株中表达，那么升高温度 后适冷蛋白的表达和折叠对于野生菌株将是致命因子；但温度在1 5 - 1 8o c 表达的适冷酶与 野生型的适冷酶分子之间在酶动力学常数、蛋白质的折叠和三维结构等参数上是没有差异 的哺2 1 ；但在3 7 。c 时重组适冷酶基因经常沉默或表达产物失去活性；即使在这个温度下适冷 酶基因能够表达，由于蛋白质错误的折叠或者基团的失活，重组适冷酶的性质已经改变。 其次，亲和标签应用于重组适冷酶纯化也是一个研究热点。组氨酸标签p g k 作为介质已经 应用于适冷酶和以酵母为宿主的重组适冷酶。对两者酶动力学性质的研究发现，亲和标签 影响到酶活性中心的稳定性，因此为使适冷酶在低温表达，有必要分离或除去亲和标签以 及在进行亲和层析时计算动力学常数。 最近，一个适冷淀粉酶在南极嗜冷菌p s e u d o a l t e i o f l l o l l a sh a l o p l a n k