（动物营养与饲料科学专业论文）常用内参基因在小鼠乳腺、肝脏、小肠组织中表达稳定性比较.pdf

小鼠乳腺、肝脏、小肠组织中内参基因稳定性比较 研究生：董晓丽 导师：王加启研究员 赵国琦教授 ( 扬州大学动物科学与技术学院) 摘要 本试验由三部分组成，主要研究j ，不同泌乳期小鼠乳腺组织、经过不同免疫 处理的小鼠肝脏组织以及幼龄小鼠成长过程中小肠组织内参基因的稳定性。应用 荧光实时定量p c r 检测基因b 2 m ，a c t b ，g a p d h ，s d h a ，h p r t l 和a r b p 的表 达水平，并应用g e n o r m 程序进行分析，最终选出合适的内参基因，为研究目标基 因的表达奠定基础。 试验一：实时定量p c r ( q p c r ) 是枪测细胞和组织中m r n a 表达量最常川的 技术之，而使用q p c r 要求对数据进行标准化。在本试验中通过q p c r 研究六个 潜在内参基因( b 2 m ，a c t b ，g a p d h ，s d h a ，h p r t l 和a r b p ) 在不同泌乳期小 鼠乳腺组织中的表达情况。经过s a s 6 1 2 中a n o v a 模型进行统计分析，结果表 明b 2 m 差异显著( p o 0 5 ) 。经过g e n o r m 程序分析，所选内参基因稳定性从高剑低 排序分别是g a p d h h p r t l ，a r b p ，a c t b ，s d h a ，b 2 m 。由此推荐应用基因 g a p d h 和h p r t l 作为实时定量p c r 不同泌乳期小鼠乳腺组织的内参照。 试验二：目前实时定量p c r 技术已广泛应用于细胞或组织m r n a 的转录水平 的检测和定量。选择合适的内参基因可以消除不同标本在r n a 的产量、质量以及 逆转录效率上可能存在的差别，从而获得目标基因特异性表达的真正差异。本试 验应用实时定量p c r 技术，研究小鼠在经过免疫刺激后，b 2 m ，a c t b ，g a p d h ， s d h a ，h p r t l 和a r b p 共6 个内参基因在肝脏组织中的表达情况。结果表明，这 6 个内参基因表达存在差异。经过g e n o r m 程序统计学分析，确定了a c t b ，g a p d h 两个看家基因适用于校正目标基因的表达量，为研究小鼠免疫刺激后肝脏目标基 因的表达奠定基础。 试验三：内参基因常用于实时定量p c r 检测m r n a 表达水平的校正和标准化， 但是内参基因表达受生理阶段、组织或细胞以及实验条件的影响。因此，本试验 选择b 2 m ，a c t b ，g a p d h ，s d h a ，h p r t l 和a r b p 共6 个内参基因，研究其在幼 龄小鼠小肠组织内的表达情况。经过g e n o r m 程序和n o r m f i n d e r 程序分析，最终 确定了内参丛i 大js d h a 和h p r t l 适合用。】：校正 i 标基凶的表达节，为研究幼龄小 鼠小肠组织基| 大l 表达奠定基础。 关键词：实时定量p c r ；内参基凶；g e n o r m 样序；小鼠；乳腺；肝脏；小肠 t h es t a b i l i t yo fr e f e r e n c eg e n e si nm a m m a r yg l a n d ，l i v e r 。 a n ds m a l li n t e s t i n et i s s u eo fm o u s e m s c a n d i d a t e ：d o n gx i a o l i a d v i s o r ：p r o f w a n gj i a - q i & p r o f z h a og u o - q i ( c o l l e g eo fa n i r n a ls c i e n c ea n dt e c h n o l o g y ，y a n g z h o uu n i v e r s i t y ) a b s t r a c t t h i sr e s e a r c hc o m p o s e do ft h r e ee x p e r i m e n t sw h i c hw e r ec a r r i e do u tt os t u d yt h e s t a b i l i t vo fr e f e r e n c eg e n e si nm a m m a r yg l a n do fm o u s ei nd i f f e r e n tl a c t a t i o np e r i o d ，i n l i v e ro fm o u s ea f t e ri m m u n i t yt r e a t m e n ta n di ns m a l li n t e s t i n eo fg r o w m gm o u s e l h e e x p r e s s i o nl e v e l so fb 2 m ，a c t b ，g a p d h ，s d h a ，h p r t ia n da r b pg e n e sw e r e d e t e c t e da n dq u a n t i f i e db y r e a l t i m ep c rr e s p e c t i v e l y d a t a w e r e a n a l y s e d s u b s e q u e n t l yb yg e n o r ma l g o r i t h m ，a n dt h e nt h es u i t a b l er e f e r e n c eg e n e sw e r ec h o s e n a n da p p l i e du s e f u l l yf o rt h er e s e a r c ho ft a r g e tg e n ei nm o u s e e x p e r i m e n t1 ：r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r ( q p c r ) i so n eo f t h em o s tw i d e l yu s e d t e c h n i q u e sf o rd e t e c t i o na n dq u a n t i f i c a t i o no f r n r n ae x p r e s s i o ni nc e l l so rt i s s u e s ih e u s eo fq p c rr e q u i r e sd a t an o r m a l i z a t i o nu s i n gi n t e r n a ls t a n d a r d ss u c ha sh o u s e k e 印m g g e n e s ( h k g s ) t oo b t a i na c c u r a t er e s u l t sb e c a u s e o fp o t e n t i a la n a l y t i c a le r r o r sd u et 0 v a r i a t i o n i nt h i ss t u d y , t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fs i xp o t e n t i a lr e f e r e n c eg e n e s ( b 2 m ， a c t b g a p d h ，s d h a ，h p r t 1 a n d 灿啦p ) w e r ei n v e s t i g a t e dmm o u s em a m m a r y g l a n db yr e a l - t i m eq p c ru s i n gs y b rg r e e nd u r i n gt h ed i f f e r e n t l a c t a t i o nd a y s d a t a w e r ea n a l v z e db ya n o v ap r o c e d u r eo fs a s ( v e r s i o n6 12 ，s a s ) t h er e s u l t ss h o w e d t h a tt h ee x p r e s s i o no fb 2 m e x h i b i t e das i g n i f i c a n td i f f e r e n c e ( p 0 0 5 ) t h er a n k i n go f e x p r e s s i o ns t a b i l i t yi n t h e s eg e n e sw a s ( f r o mt h em o s ts t a b l e t ot h el e a s ts t a b l e ) ： g a p d h h p r t1 ：a r b p ，a c t b ，s d h a ，b 2 mb ym e a n so fg e n o r ma l g o r i t h m t h i s s t u d ys u g g e s t e dt h a tt h e t w og e n e sg a p d ha n dh p r t 1 m a yb er e c o 娜n e n t e d a s r e f e r e n c e sf 0 rn o r i i l a l i z a t i o no fr e a l t i m eq p c ri nm a m m a r yg l a n do f m i c emd i f f e r e n t l a c t a t i o nd a y s e x p e r i m e n t2 ：r e a l t i m eq u a n t i t a t i v ep c r ( r t p c r ) i st h et e c h n i q u e so fc h o i c e 南rd e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no fm r n ae x p r e s s i o ni n c e l l so rt i s s u e s s u i t a b l e r e f e r e n c eg e n ei se s s e n t i a lf o rh i g hp r e c i s i o no ft a r g e tg e n eb yt a k i n gt h er n aq u a l i t y a n de f f i c i e n c i e so fr e v e r s et r a n s c r i p t i o ni n t oa c c o u n t t h ep u r p o s eo ft h ep r e s e n ts t u d y w a st oi n v e s t i g a t et h ee x p r e s s i o no fb 2 m ，a c t b ，g a p d h ，s d h a ，h p r t 1a n da r b p i nm o u s el i v e r a f t e ri m m u n i t yt r e a t m e n tb yr t p c ri n d i v i d u a l l y d i f f e r e n c e si n e x p r e s s i o nl e v e l sw e r eo b s e r v e db yg e n o r ma n a l y s i s 。a c t b a n dg a p d hw e r e d e t e r m i n e da ss u i t a b l ei n t e m a lc o n t r o lg e n e s t h er e s u t si m p l i e da c t ba n dg a p d h c o u l db ea p p l i e dt oc o m p a r et h ee x p r e s s i o no ft a r g e tg e n ei nm o u s el i v e ra f t e ri m m u n i t y t r e a t m e n t e x p e r i m e n t3 ：r e f e r e n c eg e n e sa r ew i d e l yu s e df o rn o r m a l i z a t i o no f t h ee x p r e s s i o n l e v e l so fm r n ai nr t p c r b u tt h ee x p r e s s i o no fr e f e r e n c eg e n ei s i n f l u e n c e db y p h y s i o l o g i c a ls t a g e ，t i s s u e so rc e l l s ，a n dt h ec o n d i t i o no fe x p e r i m e n t t h ea i m so ft h i s e x p e r i m e n tw e r et oi n v e s t i g a t e t h ee x p r e s s i o no fb 2 m ，a c t b ，g a p d h ，s d h a ， h p r t1a n da r b pb yr t p c ri ns m a l li n t e s t i n eo fy o u n gm o u s e b yg e n o r ma n d n o r m f i n d e ra n a l y s i s ，s d h aa n dh p r t1w e r ef i n a l l yd e t e r m i n e da ss u i t a b l er e f e r e n c e g e n e su s e dt on o r m a l i z em r n a l e v e l sb e t w e e nd i f f e r e n ts a m p l e s t h et w oc h o s e ng e n e s c o u l db eu s e f u lf o rr e s e a r c ho f t a r g e tg e n ei ns m a l li n t e s t i n eo fg r o w i n gm o u s e k e yw o r d s ：r e a l - t i m eq u a n t i t yp c r ；r e f e r e n c eg e n e s ；g e n o r m ；m o u s e ；m a m m a r y g l a n d ；l i v e r ；s m a l li n t e s t i n e 缩写英文名称 论文缩略词表 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n l c r l i g a s ec h a i nr e a c t i o n t s a t r a n s c r i p t i o n b a s e da m p l i f i c a t i o n s y s t e m n a s b an u c l e i ca c i ds e q u e n c eb a s e d 3 s r a m p l i f i c a t i o n 中文名称 多聚酶链式反应 连接酶链式反应 转录依赖的扩增系统 核酸序列复制系统 s e l f - s u s t a i n e ds e q u e n c er e p l i c a t i o n核酸序列自主复制系统 r t - p c rr e a l t i m eq u a l t i t yp c r b 2 m a c t b g a p d h s d h a h p i u l a r b p b e t a - - 2 - m i c r o g l o b u l i n 1 3 - a c t i n g l y c e r a l d e h y d e s - 3 - - p h o s p h a t e d e h y d r o g e n a s e s u c c i n a t ed e h y d r o g e n a s e f l a v o p r o t e i ns u b u n i t h y p o x a n t h i n e - g u a n i n e p h o s p h o r i b o s y l t r a n s f e r a s e 1 实时定量p c r 胆- 微球蛋白 b e t a a c t i n 甘油醛3 磷酸脱氢酶 丁二酸脱氢酶复合物，亚单位a 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶l a c i d i cr i b o s o m a lp h o s p h o p r o t e i np 0 酸性核糖体磷酸蛋白 董晓丽：常用内参基因在小鼠乳腺、肝脏、小肠组织中表达稳定性比较 5 7 扬州大学学位论文原创性声明和版权使用授权书 学位论文原创性声明 本人声明：所呈交的学位论文是在导师指导下独立进行研究工作所取得的研 究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含其他个人或集体已经发表 的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。 本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名；嚣秘嘲 签字日期：卫印7 年4 月f6 日 学位论文版权使用授权书 本人完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向 国家有关部门或机构送交学位论文的复印件和电子文档，允许论文被查阅和借阅。 本人授权扬州大学可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索， 可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学 技术信息研究所将本学位论文收录到 中国学位论文全文数据库，并通过网络向 社会公众提供信息服务。 蕺晓腑：常h j 内参基冈n ：小鼠乳腺、肝脏、小肠纠l 织t 表达稳定陀比较 第一章绪论 1 定量p c r 技术研究进展 8 0 年代中期，美国c e t u s 公司首创一种d n a 扩增技术多聚酶链式反应 ( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，p c r ) t 1 1 。近年来还发展了其他体外核酸扩增技术，如连 接酶链式反应( 1 i g a s ec h a i nr e a c t i o n ，l c r ) 、转录依赖的扩增系统( t r a n s c r i p t i o n b a s e d a m p l i f i c a t i o ns y s t e m ，t s a ) 、核酸序列复制系统( n u c l e i ca c i ds e q u e n c eb a s e d a m p l i f i c a t i o n ，n a s b a ) 和核酸序列自主复制系统( s e l f - s u s t a i n e ds e q u e n c er e p l i c a t i o n ， 3 s r ) 等1 2 , 3 1 ，其中以p c r 最为简便易行，已被广泛应用于基因表达量的检测。p c r 是在体外扩增特定基冈片段的方法，被广泛应用于获取日的基因或基凶片段及临 床基因诊断等领域。但常规p c r 无法对扩增终产物进行分析，不仅费时、费事、易 污染，且无法对起始模板准确定量。 定量p c r 技术是对常, 规p c r 技术的进一步发展和补充。在定量过程中须广泛借 助于各种形式的参照物，参照物按其性质不同可分为内参照和外参照。内参照和 外参照均是在定景p c r 过程中一种己知含量的标准品。内参照与待检样本一起加于 同一扩增系统，与待检样本共用同一对引物或采用另一对不同引物。内参照若与 待检样本共用同一对引物，两模板的扩增存在竞争性，则内参照又称为竞争性参 照物，这种条件下进行的定量p c r 又称竞争性定量p c r 。而后者，内参照与待检样 本并不共用同一对引物，这种定量p c r 因其不存在竞争性故属非竞争性定量 p c r t 4 l 。外参照与内参照相对而言，独立于待检样本定量p c r 扩增系统，常采用系 列稀释的已知含量标准品。在非竞争性定量p c r 中，通过外参照单独扩增建立标准 品初始含量与最终产物之间的标准曲线用于未知样本的类推定量。采用外参照进 行的定量p c r 亦属非竞争性定量p c r t 5 1 。参照物在定量p c r 中具有以下作用：第一， 作为扩增系统的阳性对照；第二，作为未知样本定量的参比标准；第三，通过竞 争性作用校正扩增系统之间的扩增效率，使其具有可比性。 理想的竞争性内参照应具备与待检样本长度相等或相近，扩增效率相同，通 过一定方法扩增产物较易与靶基因扩增产物分开的特点。在竞争- i 生p c r 中通过梯度 稀释系列标准品与已知含量的内参照混合共扩增而作出初始状态下标准品含量与 竞争模板含量比例和靶基因终末产物的标准曲线用于待检样本的定量。 定量p c r 按其出现后可分为以下几种：终点稀释法【6 1 ：属非竞争性外参照定 扬州人学砂! l j 学何论文 2 节p c r 方法。方法为：对检测标本进行梯度稀释后作p c r ，直全检测结果为i i j 性为 止。这样即可依据p c r 检测阳性结果的最大稀释度结合外参照进行定鼍。扩增产物 的榆测多采用凝胶电泳。本方法系统误差火，方法繁琐，已淘汰。竞争性定量 p c r 蕊l ：由于采用内参照的竞争性定量，克服了常规p c r 扩增效率不稳定的缺陷， 各管l l i j 差异得以避免，故在准确性方面优越于终点稀释法定甓，是目前较理想的 一种定量方法。尽管如此，这种方法仍存在诸多不足：竞争性模板制备较难，需 经反复测试，实践中其与靶基因模板扩增效率很难达到完全相同；内参照与靶基 因相瓦作用，内参照与靶基因是否会形成二聚体尚有待深入研究；定量原理从根 本上说仍是采用基于标准曲线的类推法，单个标准品的点变异对定量结果影响较 大。荧光定量p c r 9 1 0 是新近才出现的一种定量p c r 检测方法，可采用外参照的 定量法，亦可采用内参照的定量方法。扩增后产物采用荧光显示，定量方法多样 化，算法更为精确。 综上所述，定量p c r 技术的发展具有以下趋势：从粗略定量、半定最剑精确 定量、绝对定量。从单纯外参照非竞争性定量到内参照竞争性定量。从扩增 样品终点一次检测到扩增过程中动态连续检测进行定量。检测方法也由手工、 半自动发展到成套设备检测，检测效率及自动化程度越来越高。定量p c r 技术的发 展，是在不断克服其原有的缺陷，求得高度的灵敏性和较好的精确性的统一过程 中发展、提高的。 2 实时荧光定量p c r 2 0 世纪9 0 年代中期出现的实时荧光定量p c r 技术，具有敏感性高、重复性好、 速度快、自动化程度高和污染少等优点，并且可以提高检测效率，缩短检测周期， 提高经济与社会效益，并为核酸定量带来了革命性的飞跃。 2 1 基本原理 实时荧光定量p c r ( r e a lt i m ep c r ，r t p c r ) 是指在p c r 反应体系中加入荧 光化学的基团，通过荧光定量p c r 仪实时、自动监测整个p c r 扩增过程中荧光信号 的积累，检澳t j p c r 扩增产物及对未知模板进行定量分析的方法。该技术结合了实时 定量p c r 仪、实时荧光定量试剂、通用电脑和自动分析软件，构成了p c r d n a r n a 实时荧光定量检测系统。其荧光化学基础分为两类，即荧光染料和荧光标记的寡 核苷酸探针。 前晓附：常用内参基冈4 ：小鼠乳腺、片 ：儿庄、小 场组织中表达稳定性比较 s y b rg r e e n 足一种特殊的荧光染料，在游离状态f 只发出极微弱荧光，能j 双链d n a 结合，结合后其荧光强度可增强1 0 0 0 1 啬- 以l 。在常规p c r 反应体系内， 加入s y b rg r e e n ，在p c r j ：j 。增过程中，随着新生双链d n a 的合成，s y b rg r e e n 结 合于双链d n a 的小沟部位，荧光信号随荇p c r 产物的增加而增加。s y b rg r e e n 使 用方便，价格便宜，无序列特异性，可以用_ j ：4 i i 叫模板。该法不涉及特异性探针， 其特异性依赖于特异性引物，但由于任何双链d n a 的存在都会导致荧光的产生， 因此特异性低于荧光标记探针。为化学基础的荧光定最p c r t 】。主要用于目标基因 的检测、定量和融解曲线分析。 2 2 定量原理 从理沦上讲，p c r 产物在扩增过程中呈指数积累。但实际上，当产物积累到一 定程度，由于反应体系内引物，d n t p s 的消耗及酶活性的降低，则进入平台期。含 不同最起始模板，其指数增长期所用的循环数是不同的，在设定的循环数到达时， p c r 扩增是否处于平台期不得而知。因此用终点扩增产物的量来推算起始样品中模 板的量难以得f j j 可靠结果。 荧光定量p c r 在判定结果时，用c t 值作为临界点，该点位于p c r 产物进入指 数增长期的起始位置，反应体系处于最佳状态，最能稳定地反映出与起始模板数 量上的关系，因此用c t 值作为定量判断点比终点法准确的多。 在荧光p c r 中有几个重要概念：荧光曲线：随着p c r 反应的进行，扩增产物 不断累加，荧光信号强度不断增加。每经过一个循环，收集次荧光强度信号， 得到一条荧光曲线图。荧光阈值：是在荧光曲线上人为设定的一个值，它可以 设定在指数扩增阶段任意位置上，但实际应用时要结合扩增效率，线形回归系数 等参数来综合考虑。通常采用以p c r 前1 5 个循环的荧光信号为本底基线( b a s e l i n e ) ， 荧光阈值设定为3 1 5 个循环荧光信号标准差的1 0 倍。c t 值：c 代表p c r 循环 ( c y c l e ) ，t 代表荧光阈值( t h r e s h o l d ) 。c t 值是指在p c r 过程中荧光信号到达设定荧 光阈值时所经过的p c r 循环数。起始模板与c t 值的关系：起始模板拷贝数越高， c t 值越小，反之则越高。利用已知拷贝数的系列标准模板制成标准曲线，其中横 坐标代表起始拷贝数的对数( 1 0 9 ) ，纵坐标代表c t 值。l o g 浓度与c t 值呈线性关系， 只要获得未知样品的c t 值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始模板数【l 2 i 。 r t p c r 使用针对扩增d n a 的荧光物质，使得d n a 的数量与检测到的荧光强度 成线性关系，得至i j d n a 理想的扩增曲线应为j 型，符合2 n 方程，实际上的扩增曲线 是s 型，包括不可检测期、指数期、平台期。实时荧光定量p c r 的标准扩增曲线如 扬州大学硕上学f 1 ：论文 4 图1 1 。其t f l r n + 表示每点测镀的荧光强度，代表反应管含fj 模板d n a ；r n 表示荧 光基线强度，代表反应管不含有模板d n a ，其在理想情况卜j 是一条平线，只具有 背景荧光数值；a r n 的值表示p c r 过 擎中，探针降解的紧，也i i j p c r “：物的量。基 线( b a s e l i n e ) 是背景曲线的一段，范围为从反应开始不久荧光值开始变得稳定，到 所有反应管的荧光都将要但还未超出背景m 15 1 。 琶o 8 0 零( 7 0 麦o 6 0 i d 0 5 0 晕0 4 0 罨0 3 0 裁篙 蕺晓丽：常h j 内参肇扫：小鼠乳 j 泉、肝脏、小肠组织- l - 表达稳定r t 比较 机械手臂口丁按一定顺序将待测样占j 1 运送歪j i 机内，配备的条形码阅凄器叮自动识 别进行主机的样品编号。每h 可完成5 0 0 0 份样品实时荧光检测。 2 3 4i c y c e r 荧光定量p c r 仪 美困b i 0 2 r a d 公司产品。依据选择反应模块不同，可同时p c r 扩增4 8 份或9 6 份 或3 8 4 份样品，并可同时实时检测4 种f 同荧光，自动计算样品c t 值。 2 3 5l i g h t c y c l e r 荧光定量p c r 仪 r o c h e 公司产品。p c r 扩增置于纤细封闭的玻璃毛细管中进行，快速的空气热 传导和毛细管的高表面积体积( 5 一- - 2 0 t d ) 比，保证了2 0 - - , 3 0 m i n 内完成3 0 - - - 4 0 个循 环。可同时扩增3 2 份样品，并可同时实时检测3 种荧光，自动计算样品c t 值。 2 4 技术特点及应用 第一，在全封闭状态下进 t p c r 扩增及产物柃测，可有效避免扩增产物污染而 致的假阳性。第二，应用光谱技术进一步提i 岛了检测灵敏度，可检测单拷贝基因， 可区分微小的拷贝数差异。第三，应用荧光标记探针杂交，进一步提高了目的基 因检测的特异性。第四，p c r 扩增，荧光标记探针杂交与实时自动化分析一体化， 使检测简便、快速。第五，实现了对所检测f 1 的基因的定量，包括d n a 定量，r n a 定量，已应用于转基因研究、药物疗效考核、病原体检测，单个或多个基因表达 的研究等领域。第六，利用不同颜色荧光剂标记不同探针，可在同一反应体系内 对多种目的基因同时进行检测，易于区分。可用于s n p 分析、基因型鉴定、物种鉴 定、菌株鉴定、病原体分型和r n a 变异分析等。第七，可用于融解曲线分析。 荧光p c r 技术是定量检测目的基因的一个快速、有效的工具。目前，已呈现 出良好发展前景，其研究还需不断深入，以便有成本更低、效果更好、结果更精 确的检测模式出现【l6 1 。随着荧光p c r 技术的进一步普及和发展，荧光p c r 试剂盒的 进一步开发，以及它具有比传统病原学、血清学和常规的p c r 更敏感、特异性强、 无污染等优点，此技术将会得到更加广泛的应用。 3 内参基因在实时定量p c r 中的应用研究进展 实时荧光定量p c r 分绝对定量和相对定量。在相对定量检测中，为了比较不同 样本m r n a 表达量水平，要求不同的样本之间起始细胞数目相同、r n a 提取效率 相同，目的基因的扩增效率相同，但这些条件不可能同时满足。为了避免不同标 本在r n a 的产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，进而获得目标基因特 扬州人学硕i ：学何论文 6 异性表达的真上e 差异，通常选择一定的内参基因进行校正和标准化。e f l 此1 1 丁见， 选择合适的内参琏i 大l 能够减少枪测样本f 1 j 的差异。 内参皋凶在彳i 同类型的细胞、组织及不同的试验条件和环境卜表达彳、= 同。止 确的选择内参丛w ，很大程度上依赖所研究的细胞或组织，不问的试验需要寻找 适合各自试验体系的特异性稳定表达的内参基因。然而，合适内参基l 大l 的选择， 需要在每种类掣的细胞、每种类型的组织和每种实验条件下进行比较选择。理想 的内参基因应在各种试验条件下，各种类型的组织和细胞中均恒定表达，而且其 表达量是近似的，无显著性差别。另外要求不存在假基冈，以避免基因组的扩增。 3 1 内参基因在实时定量p c r 中应用 实时荧光定量p c r 是检测低丰度m r n a 的敏感方法，通过比较不同样本的r n a 产量、质量以及逆转录效率上可能存在的差别，获得口标基因特异性表达的真正 差异。但是，在应用实时荧光定量p c r 检测基因的表达量中，必须选择合适的内参 基因进行校正和标准化。内参基因在p c r 扩增中的变化可以反映r n a 数量、质量 和c d n a 合成效率的变化。 实时定量反转匀之p c r 技术能够快速、精确的检测样品m r n a 扩增效率和鉴定基 因转录数案。在这种分析中最重要的问题足m r n a 分离和反转录效率的变化引起的 样品间遗传物质数量变异。因此，需要内参基因对样品变异进行标准化。作为内 参基因，应该表现为在分析样品类型中表达稳定、不可调。看家基因能够达到这 个标准并在大多数研究中用于标准化。然而，在不同类型的组织和不同处理条件 下看家基因转录水平可能发生变化。因此，必须选择合适的内参基因以减少检测 样本间的差异。 3 2 内参基因应具备的条件 理想的内参基因应该满足以下条件：不存在假基因( p s e u d o g e n e ) ，以避免基 因组d n a 的扩增：高度或中度表达，排除太高或低表达；稳定表达于不同类 型的细胞和组织( o h i e 常细胞和癌细胞) ，而且其表达量是近似的，无显著性差别； 表达水平与细胞周期以及细胞是否活化无关；其稳定的表达水平与目标基因 相似；不受任何内源性或外源性因素的影响，如不受任何实验处理措施的影响。 排除内参基因的条件则为：在正常和异常的细胞组织中的表达存在差异；呈 现细胞周期依赖的表达；定位于x 染色体。内参基因通常是各种看家基因，在细 胞内组成性表达，有助于保持细胞的功能。看家基因在某些类型细胞中的表达是 蕺晓丽：常用内参琏1 人l 红小鼠乳腺、1 1 1 脏、小肠约i 织- l ，辰达稳定陀比较 7 恒定的，但在其他类型的细胞中则足变化的，尤其足与恶。陀疾病相关的临床标本。 常j j 的人类内参基凶【协3 1 1 见表l l 。 表卜1 常用内参丛冈 扬州大学硕十学位论文 8 3 3 最常用的两种内参基因 内参基因往往是在不同个体及组织细胞中均稳定表达的看家基因。常用的内 参基因包括g a p d h 和b a c t i n 等，这些看家基因是在假设表达恒定的基础上，作为 应用实时定量p c r 检测目标基凶m r n a 表达水平的标准化。然而，近年来的研究发 现，这些常用内参基凶均存在小稳定性，在不同类型的细胞和组织、细胞增殖和 器官发育的不同阶段、体外培养、各种实验条件等情况下，它们的表达量通常变 异较大。有资料i i e u j l g a p d h 干nj 3 a c t i n 的表达在增殖、催化和分化的情况下是上调 的。g l a r e 等研究发现在哮喘气道组织中g a p d h 和p a c t i n 基因表达不稳定，不适合 用于m r n a 水平的标准化p 2 1 。 3 3 。1g a p d h 甘油醛3 磷酸脱氢酶( g a p d h ) 是糖酵解、糖异生及光合作用碳固定循环过 程中的关键酶，在生物进化的早期出现，是最为常用的内参基因之一。有研究表 明g a p d h 在缺氧等某些特定条件下出现明显的上调或下调，此时需要选择新的内 部参照标准。徐安定等研究表明，缺氧后星形胶质细胞( a s t r o c y t e s ，a c ) 的g a p d h m r n a 显著上调1 3 3 , 3 4 ；人恶性胶质细胞瘤中g a p d h 缺氧条件下既没有上调也没有 下调，是该条件下理想内参基因的选择之一。比较正常与患病犬关节结缔组织中 内参基因表达情况时，d u n c a na y e r s 等发现g a p d h 表达很稳定。n i c h o l a ss i l v e r 等 应用r t p c r 研究人网状细胞内参基因的表达时，发现g a p d h 是表达最稳定的基 因，适合应用于标准化。而g a p d hm r n a 在猪不同组织中表达变化很大，应用荧 光染料实时定量p c r 方法研究基因的表达水平及稳定性，结果发现g a p d h 基因是 表达最不稳定的 3 5 - 3 s 】。 董晓丽：常用内参琏1 人i n ：小鼠乳腺、肝脏、小肠组织q i 表达稳定性比较 9 3 3 21 3 - a c t i n 1 3 - a c t i n 作为内参基因被广泛使用，它足构成细胞骨架的j 卜要成分肌动蛋白 的。4 种，是微丝的结构成分，其瞥体外观呈哑铃状，具有基【丈j 高度保守、m r n a 表达数量高且稳定等特点。比较j 结节瘸皮肤与正常皮肤组织- i t 内参基闪农达情 况时，发现基【大l b a c t i n 的表达没有受马结节病变的影响，其表达较稳定，适合用于 定量p c r 的标准化。h a o z h iy a n 等发现1 3 a c t i n 基因在植物病原体p h y t o p h t h o r a p a r a s i t i c a 不同生长阶段表达变化较大，不适合用作标准化内参丛因。a m ylf i l b y 等发现鱼受到周围激素影响时，1 3 - a c t i n 的表达也受到影响。s t e f a nt o e g e l 等( 2 0 0 7 ) 研究关节软骨蛋白中内参基因活性时，通过g e n o r m 程序分析发现在整个试验过程 p a c t i n 是表达最不稳定的基因【3 9 - 4 2 。 3 4 内参基因稳定性的分析方法 在很多定量试验中都以内参基【大j 作为参照物，女h r n a 酶保护试验、n o r t h e r n 印迹、半定量r t p c r 等。大量研究通过r t p c r 方法研究内参基因的表达量。目 前j ov a n d e s o m p e l e ，c l a u s 和m i c h a e l 等分别编写g e n o r m 、n o r m f i n d e r 和b e s t k e e p e r 程序用于进行比较内参基因的表达变化和稳定性【3 1 , 4 3 , 4 4 。 g e n o r m 程序是j ov a n d e s o m p e l e 于2 0 0 2 年编写的专门用r t p c r 方法选择内参 基冈的程序，后来该程序得到进一步改进。g e n o r m 程序可以用于筛选任何组织或 细胞的任意数量内参基因，选择出2 个以上，而不是传统地使用单一内参基因，将 有利于系统偏差的校正，得到更可靠的基因准确定量结果，这对于细微表达差异 的生物学研究具有极其重要的意义1 4 5 1 。另外g e n o n l l 程序利用对标准化因子进行配 对差异分析确定所需看家基因的最适数目。 n o r m f i n d e r 程序是用于选择合适内参基因的工具，由c l a u s 等2 0 0 4 年编写的。 其运行原理与g e n o r m 程序类似，产生基因表达稳定值，然后根据稳定值的大小排 序，最终将表达稳定值最小的基因作为最稳定的基因。其缺点是只能选择一个合 适的内参基因作标准。而g e n o r m 程序通过基因配对的形式，筛选出最不稳定的基 因，然后将剩下基因重新排序重新配对进行筛选，最终选出适当数目的合适内参 基因【4 6 】。 b e s t k e e p e r 是m i c h a e l 等( 2 0 0 4 ) 编写的针对内参基因和目标基因进行选择的 程序。b e s t k e e p e r 软件可以比较1 0 0 个样品中1 0 个内参基因和1 0 个目标基因的表达 水平。具体操作是把原始数据输, a b e s t k e e p e r 软件的e x c e l 表格中，内参基因和目 标基因进行单独分析。b e s t k e e p e r 程序在每个基因之间产生配对的相关系数和 扬州大学颂l ：学f t 论文 j 0 b e s t k e e p e r 指数( 每个候选基闪c t 值的几何i f 均数) ，根据其值的大小进行比较。 其优点是小但可以分析内参基因的稳定性，而n 可以比较目标基【大l 的表达水平。 3 5 选择内参基因 没有一种m r n a 的表达水平在所有条件+ 卜是。陋定的。内参基因存各种冈素的影 响下，如小l 司生理阶段、不同组织或细胞、不川的试验条件下其表达发生很大变 化。 m a s s i m ob i o n a z 等( 2 0 0 7 ) 应用q p c r 评价奶牛不同泌乳期基凶表达情况，选 择九个可以作为内部对照的基因( r p s 9 ，a c t b ，g a p d ，g t p ，i t g b 4 b p ，m r p l 3 9 ， r p s 2 3 ，r p s l 5 和u x t ) 进行研究，应用g e n o r m 程序分析稳定性。结果发现u x t ， r p s 9 和r p s l 5 不受奶牛和泌乳阶段的影响，具有较稳定的表达率，而常用基因 a c t b 和g a p d h 受不同泌乳阶段影响，表达变化较大1 4 7 1 。 在不同组织和细胞中，内参基因的表达i 现差异。s o l o m o nm a m o 等1 4 8 】在体内 和体外培养的不同发育阶段小鼠胚胎中，选择了1 2 个已用过的看家基因( a c t b ， g a p d h ，h 2 a f z ，h p r t ，p p i a ，u b c ，e e f ie1 ，t ub b 4 ，h i s t 2 h 2 a a 1 ，t b p ，b m p 7 ， p o l r 2 a ) 研究其表达模式和水平。结果发现在不同的培养体系下基凶的表达模式 是相似的，但是经过g e n o r m 程序比较其表达水平受到培养条件的影响。基因p p i a ， h 2 a f z 和h p r t l 通过不同的阶段和培养条件表达最稳定，而传统的看家基因a c t b 表达最不稳定。 s c h m i t t g e n 箸f