（动物学专业论文）黄粉虫中壳聚糖的制备及其抑菌研究.pdf

论文题目：黄粉虫中壳聚糖的制备及其抑菌研究 专业：动物学 硕士生：陈文武 指导老师：古德祥教授 摘要 以黄粉虫( ，咖e 厶一d 肋j 叮l i n 鹏) 为材料提取壳聚糖，并对常规方法、 分步碱液法、微波法、相转移催化几种制备方法进行了比较研究。从产品质量、 环保、经济、节省时间缩短生产周期等方面综合考虑，相转移催化法是一。种比较 好的壳聚糖制备方法。通过正交实验，认为在按甲壳素质量为3 ，以十六烷基 三甲基溴化铵为催化剂条件下，氢氧化钠溶液浓度为4 0 、反应温度1 0 5 、反 应时间3 h 、醇碱体积质量比4 ：1 ，是相转移催化法最优工艺条件。 研究了两种壳聚糖衍生物( 羧甲基壳聚糖与异丁基壳聚糖) 的制备方法。试验 结果表明氢氧化钠与氯乙酸重量比为o 9 ：1 ，控制反应温度6 5 ，反应时间3 h ， 所制得的羧甲基壳聚糖的取代度为7 9 5 6 。在碱性条件下，以溴代异丁烷为卤 代剂对壳聚糖进行化学修饰制备异丁基壳聚糖。制得的异丁基壳聚糖取代度为 5 7 4 5 。结果：改性后的壳聚糖具有良好的水溶性。 研究了三种不同分子量壳聚糖( 其中一种从黄粉虫中制得，另两种从s i g m a 公司购得) 及两种壳聚糖衍生物对三种革兰氏阴性菌( 大肠杆菌、猪霍乱沙门氏 菌、铜绿假单孢菌) 及三种革兰氏阳性菌( 短小芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、藤黄 八叠球菌) 的抑菌情况。与壳聚糖衍生物相比，壳聚糖显示了较高的抑菌活性。 不同分子量壳聚糖对特定菌的抑制效果表明，壳聚糖显著抑制了大多数细菌的生 长。通常l 的壳聚糖溶液对革兰氏阳性菌的抑菌效果比对革兰氏阴性菌的抑菌 效果明显。根据不同分子量壳聚糖对不同细菌的抑菌情况的不同，壳聚糖的最小 抑菌浓度变化范围从0 0 5 到大于0 1 。就壳聚糖溶剂对细菌抑制效果而言， 0 1 的乙酸和o 1 的柠檬酸作溶剂有效地抑制了大多数细菌的生长。从p h 研 究范围4 5 5 9 的情况看来，p h 对壳聚糖抑菌的影响成负相关关系，口h 越低壳聚 糖的抑菌活性越高。 本研究对壳聚糖的制备方法进行了比较研究，并对相转移催化法的条件进行了 优化，并研究了各种因素对壳聚糖抑菌活性的影响，对壳聚糖的开发利用有重要 意义。 关键词：黄粉虫，壳聚糖，壳聚糖衍生物，提取，抑茵活性 l l t i t l e ：p r e p a r a t i o no fc h i t o s a nf r o m 乃席已6 ，如m d 胁，a n di t s a n t i b a c t e r i a la c t i v i t y m a j o r ：z o o l o g ) ， n a m e ：c h e nw e n w u s u p e r v i s o r ：p r o f e s s o rg ud e x i a n g a b s t r a c t f o u rm e t h o d s ，c o n v e m i o n a lm e t h o d ，p h a s et r a n s f c rc a t a l y s t ，m i c r o w a v em e t h o d ， a ( a i l is o l u t i a o nt r e a t m e m tu s i l l gm e t h o do f 舶c t i o n a ls t e p s ，w e r eu s e dt og e tc h “o s a n 丘d ma i li 1 1 s e c t ，死n p 6 r f d 坍o ，f ，0 rl i l l l l 6 t h er e s u l t ss h o w e dt h a t t h a tp 1 1 a s et r a n s f e r c a t a l y s ti st h eb e s tm e t h o da c c o r d i n gt o t h eq u a l “yo fp r o d u c t ，e n v i r o n m e n t a l p r o t e c t i o i l c o s t sa n dt i m eu s e d b a s e do nac r o s s - t e s t ，t h eo p t 岫a lc o n d i t i o n so f p h a s e t r a t l s f e rc a t a l y s t 、v e r e4 0 s o d i u mh y d r o x i d e 、r e a c t i o nt e m p e r a u r e1 0 5 、r e a c t i o n t i m e3 h 、 e l h a n o i ( v ) ： s o d i u mh y d r o x i d e ( m ) = l ： 4o nt h ec o n d i t i o no fu s i n g3 c h i t i n ( m ) o fc e t y l t r 谊l e t l l y la m m o 缸u mb r o m i d ea sc a t a l y z e f t h ep r e p a r a t i o nr n e t h o d so f t w oc h i t o s a l ld e r i v a t e s ( c a r b o x ym e t h y lc h i t o s a l la i l d i s o b u t e n e - c h i t o s a n ) w e r ea l s os t u d e d w h e nt h cw e 逗h tr a t i oo fs o d t u mh y d m x i d e a 1 1 dc h l o r o e t h a n o i ca c i di s0 9 1 0 ，r c a c t i o nt e r n p e r a t u r e6 5 a n dr e a c t i o nt i m e 3 h ，t h es u b s t i t u t i o n a ld e g r e eo fc a r b o x ym e t h y l c h i t o s a nw a s7 9 5 6 i s o b u t e n e c h 敏o s a i l 砸p r 印a r a t e db yu s i n gb r o m o i s o b u t a l lu n d e rb a s i cc o n d i t i o n t h es u b s ti t u ti o n a ld e g r e eo fi s o b u t e n e c h i t o s a l lw a s5 6 4 5 t h ec h i t o s a n d e r i v a t e sh a dag o o ds o l u b i l i t yi i lw a t e l t h r e ec h i t o s a n s ( o n ec h i t o s a l lp r e p a r e d 矗o m 乃胛p 6 砌埘o ，如rl i n n 垂t h eo t h c r t w oc h h o s a n sp u r c h s e d 五 o ms 适m a )w i t h d 词 e r e mm o l e c u l a rw e i 曲t ( m w s ) a n d t w oc h “o s a nd e r i v e r a t e sw e r ee x a m i r l c df o rt h e i ra 1 1 t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s a a a i n s tt h r e e a g a i n s tg r 锄一n e g a t i v e (西c 洲c 砌 c o ，f ，踟砌o ”p 如c 厅d 彪m p s 甜括 s u b s p ， n p “面m d 聆邪d 8 r 增加。船) a i l dt h r e eg r 锄一p o s t i v eb a c t e r i a ( 曰日c 川螂p “川打魍肋c 埘螂 i c p 陀岫s 凯加n ，村z p n ) t h r e ec h i t o s a n ss h o w e dh i g h ta n t i b a c t e r i a la c t i v n e st h a nt w o c h i t o s a nd e r i v a t e sa n dm a r k e d l yi n h i b i t e dg r o w t ho fm o s tb a c t e r j at e s t e da n h o u g h i i l l l i b h o r ve 仃e c t sd i 脓r e dw nm w so fc h h o s a na n dt h eb a c t e r i u mt e s t e d c h i t o s a n g e n e r a l l ys h o w e ds t r o n g e r b a c t e r i c i d a le 仃c c t sw j t hg r a m - p o s i i v eb a c t e r i at h a n g r a r n _ n e g a t i v e b a c t e r i ai nt h ec o n c e n t r a t i o no fo 1 c h i t o s a n t h cm j n i m u m i n h i b i t o r yc o n c e n t r a t i o n ( m i c ) o f c 址o s a f lr a n g e d 疗o m ( o 0 5t o o 1 呦d e p e n d i n g o nt l eb a c t e r i u ma n dm w so f t h ec h i t o s a n a sac h i t o s a ns o l v e n t 1 a c e t i ca c i d 趾d 1 c i t r i ca c i dw a se 脆c t i v em i n h i b h i n gt h eg r o 叭ho fm o s to ft h eb a c t e r i at e s t e d a m i b a c t e r i a la c t i v i t yo ft h cc 1 1 i t o s a l l sw e r e 协v e r s e l ya 腩c t e db yp h ( p h4 5 5 9 r a n g et e s t e d ) ，w “hh i g h e ra c t i v i t ya tl o w e rp hv a l u e i ns h o r t ，t h i sp 印e rc o n l p a r e d4p r 印a r a t i o nm e t h o d so fc h “o s a n ，o p t 油i z e dt h e c o n d - t i o no f t h ep h a s ct r a n s f e rc a t a l y s t a n d ，s t u d i e dt h ei i n p a c to f d i f f e r e n tf a c t o f so n t h ea n t i b a c t e r i a la c t i v “i e so f3c h i t o s a na n d2c h i t o s a nd e r i v a t e s k e yw o r d ：琵栉它6 r 如卅o ，豇d ，h n n 6 ，c h i t o s a n ，c h i t o s a nd e r i v a t e ，e x t n c t i o n ， a n t i b a c t e r i a la c t i v i t i e s 第一章前言 一慨况 甲壳素( c h h i n ) ，又名甲壳质、蟹壳素、几j 质、壳多糖。大量存在于虾、蟹 等海洋节肢动物的甲壳中，也存在于菌类、藻类的细胞膜、昆虫的内外角质层和 高等植物的细胞壁中( 王军利，刘忠2 0 0 2 ) 。化学名称为( 1 ，4 ) 2 一乙酰氨基一2 一 脱氧一b d 一葡聚糖。壳聚糖( c h k o s a n ) ，是甲壳素脱乙酰基产物，其化学名称为( 1 ，4 ) 一2 一氨基一2 一脱氧一肛d 一葡聚糖，是迄今为止发现的唯一阳离子动物纤维，唯一的碱 性多糖( 开立峰，许梓荣2 0 0 3 ) 。壳聚糖具有许多独特的生物活性，如具有良好 的絮凝沉淀性、可生物降解性，生物相溶性。其本身无毒、无害、不污染环境， 是一种环境友好材料而广泛运用于许多领域，如运用于食品工业的保鲜剂、沉降 剂、添加剂，纺织印染工业的染料增湿剂，水处理絮凝剂，冶金工业贵金属回收助 剂，对环境、人体有毒害作用的重金属熬合剂，日化工业的添加剂以及运用于农业、 造纸和化学工业等( 陈永平，廖建和2 0 0 2 ) 。 目前，甲壳素、壳聚糖的生产原料主要来自于虾蟹壳，但虾蟹中甲壳素灰份 含量高，提取成本完全受制于虾蟹壳的价格。而对世界上生物量最大的优势动物 类群及富含甲壳素的生物类群一昆虫的甲壳素及壳聚糖资源丌发势在必行。利用 昆虫源材料制备壳聚糖的研究工作在国内外取得了一定进展。从查阅的文献来看 有从金龟子( 王敦，胡景江，刘铭汤2 0 0 3 ) 、柞蚕蛹( 贾延华，刘颖等2 0 0 3 ) 、蝇 蛆( 陈盛，余萍，李柱来1 9 9 6 ) 等昆虫中提取甲壳素、壳聚糖的报道。为此，本 研究以黄粉虫( t e n e b r i om o l i l o rl i n n 6 ) 为材料提取甲壳素，制取壳聚糖。 从1 8 8 1 年法国人第一次发现甲壳素到现在，壳聚糖及其相关产品已广泛应用 于许多领域，壳聚糖的提取方法日趋成熟。目前从甲壳素中提取壳聚糖的方法主 要有连续碱液法、分步碱液法、微波法、超声波法( 周家华，刘永等2 0 0 2 ) ，相转 移催化法( 夏士朋2 0 0 2 ) 。本研究是在日口人研究的基础上对制备壳聚糖的几种方 法进行比较研究，试图探索一种产品质量好，经济、环保而可行的方法。 壳聚糖分子链中存在大量亲水性羟基( 一o h ) 及游离的氨基( 一n h ：) ，这些活性 基团可以与其它物质的分子发生化学反应，生成衍生物，其溶解性能，化学活泼 性都大为改变，具有某些独特的物化性质和生物功能，如具有良好的絮凝沉淀性， 生物活性、生物相溶性。因而改性后的壳聚糖衍生物具有很好的吸附性、通透性、 成膜性、吸湿性和保湿性( 王军利，刘忠2 0 0 2 ) 。本研究制各了羧甲基壳聚糖与 异丁基壳聚糖两种壳聚糖衍生物，并比较了两者之问的性质，对其产物进行了红外 光谱鉴别。 由于壳聚糖及其衍生物具有许多独特的生物活性如抗菌、抑制肿瘤、降血脂， 许多国内外学者对其功能研究做了很多有意义的工作，也取得了骄人的成绩。在 功能研究中包括方方面面，其中抑菌研究就是其中的一个方面。在国内，研究抗 细菌的工作不多，主要是研究壳聚糖抑制真菌方面。在国外，对抑制细菌的研究 比较深入，对壳聚糖及其寡聚糖的抑菌活性做了比较研究，结果显示，壳聚糖比 寡聚糖更能有效抑制细菌生长。此外有报道认为，壳聚糖及寡聚糖的抑菌效果依 赖于其分子量，因此h o o gk y o o nn o 等( 2 0 0 2 ) 研究比较了不同分子量壳聚糖及 不同分子量寡聚糖对革兰氏阴性菌及革兰氏阳性菌的抑菌活性，证明了不同分子 量壳聚糖及寡聚糖对阳性菌与阴性菌有不同的抑菌活性，更能有效地抑制阳性菌 的生长。但当壳聚糖分子量太大时是否仍有抑菌效果、抑菌活性如何，尚未见这 方面的报道。也未有人比较过壳聚糖及其衍生物的抑菌效果。基于此，在本研究 中比较了三种不同分子量壳聚糖( 高分子量壳聚糖、中等分子量壳聚糖、低分子 量壳聚糖) 与壳聚糖衍生物( 羧甲基壳聚糖、异丁基壳聚糖) 对三种革兰氏阳性 菌与三种革兰氏阳性菌的抑菌活性。 二研究意义、创新点及技术路线 1 研究意义及创新点 目前，甲壳素、壳聚糖的生产原料主要来自虾蟹壳，但虾蟹中甲壳素含量少、 灰分含量高、提取成本高，且原料受季节产地影响，生产过程消耗大量浓碱，对 设备腐蚀强、对环境污染严重，产品中钙、蛋白质含量高、脱乙酰度低且不稳定 等缺点。也有以微生物为来源获取几丁质的方法。如从黑曲酶，蓝色梨头菌，柠 檬酸废菌体a b e s i d ac o e r u e n 、a b e s i d ab u t l e r i 等中提取，而对世界上生物量 最人的优势动物类群及富含甲壳索的生物类群一昆虫的甲壳素及壳聚糖资源丌发 势在必行。因此利用昆虫源材料制备壳聚糖的研究工作在国内外取得了一定进展。 从查阅的文献来看有从金龟子、柞蚕蛹、蝇蛆等昆虫中提取甲壳素、壳聚糖的报 道。为此，本研究中以黄粉虫( t e n e b r i om o i l o rl i n n d ) 为材料提取甲壳素， 制取壳聚糖。黄粉虫俗名面包虫，为鞘翅目( c o l e o p t e r a ) 拟步甲科 ( t e b e b e r u i b u d a e ) 壳粉甲属的昆虫，可群体大量饲养，已经可以工厂化生产。研 究黄粉虫蛹壳中提取甲壳素、壳聚糖的可行性，拓宽了壳聚糖的昆虫源材料，在 昆虫资源的开发利用方面都有实际的、经济的意义。而且在世界性的开发、利用 壳聚糖趋势下，我国在这方面已经落伍了许多，生产工业条件相对落后、生产过 程中对环境污染严重、制得的产品粗糙、对壳聚糖的某些功能方面的研究不够深 入等情况下，在本研究中对提取过程的工业条件进行探讨，对产品进行降解、改 性等方法精制壳聚糖及较深入的研究壳聚糖的抑菌性及各种因素对抑菌的影响， 从这种角度来说也是非常有意义的。 从查阅的文献来看，其他人在研究壳聚糖的制备及其功能时一般只是以单一的某 种方法进行研究，在本研究中将各种方法进行比较、综合运用研究。通过试验，从产 品质量、环保、经济、节省时间缩短生产周期等方面综合考虑，相转移催化法是一种 比较好的壳聚糖制备方法。通过正交实验，认为在按甲壳素质量为3 ，以十六烷基 三甲基溴化铵为催化剂条件下，氢氧化钠溶液浓度为4 0 、反应温度1 0 5 。c 、反应时 间3 h 、醇碱体积质量比4 ：1 ，是相转移催化法最优工艺条件。 国内外学者在壳聚糖抑菌活性研究中做了许多卓有成效的研究，但当壳聚糖 分子量太大时是否仍有抑菌效果、抑菌活性如何，尚未见这方面的报道。也未有 人做过壳聚糖及其衍生物抑菌效果的比较研究。基于此，在本论文中研究了三种 不同分子量壳聚糖( 高分子量壳聚糖、中等分子量壳聚糖、低分子量壳聚糖) 与 自制壳聚糖衍生物( 羧甲基壳聚糖、异丁基壳聚糖) 对三种革兰氏阳性菌与三种 革兰氏阴性菌的抑菌活性比较研究。从本研究选择的三种分子量壳聚糖及两种壳 聚糖衍生物抑菌效果柬看，壳聚糖分子量太高时抑菌效果不明显，壳聚糖衍生物 有定的抑菌作用，但效果不明显，以分子量为9 8 ，0 0 0 的壳聚糖抑制作用最强。 并且从所选择的溶剂及p h 条件来看，以乙酸作溶剂、p h 为4 5 的抑菌效果最好。 2 技术路线( 图1 1 ) 3 图1 - 1 技术路线图 第二章壳聚糖不同制备方法及其最佳反应条件 4 2 1 材料与方法 2 1 1 材料 2 1 1 1 黄粉虫的饲养 温度2 5 。c - 3 0 1 2 ，湿度5 0 - 7 2 黑暗条件下，以麸皮为主要饲料饲养，也 可以加入地瓜、胡萝h 等既可以作黄粉虫饲料又可以补充水份。不同龄期幼虫、 蛹、成虫分开饲养，而且放养密度不宜过密，以幼虫放养厚度1 - 2 c m 为宣。 2 1 1 2 材料的收集 龄期越小的幼虫蜕皮周期越短，可以2 - 3 天收集一次黄粉虫各期脱皮。一周 收集成虫2 次，微波炉中处理一段时间，得壳。 2 1 1 3 样品预处理 样品预处理如下图所示。 蜕皮、成虫壳 清洗 烘干 液氮研磨 3 0 目过筛 筛洗 6 0 烘干 1 试样 2 1 2 试剂 1 ) 氧氧化钠( 广州化学试剂厂a r ) 2 ) 盐酸( 广州化学试剂厂a r ) 3 ) 乙醇( 广州化学试剂厂a r ) 5 ) 双氧水( 广州化学试剂厂a r ) 6 ) 亚硫酸纳( 广州化学试剂厂a r ) 7 ) 钙黄绿素( 上海爱思化学试剂有限公司) 8 ) e d t a 试剂 9 ) 磷钼酸( 天津化学试剂四厂a r ) 1 0 ) 磷钨酸( 湖南南化化学有限公司a r ) 1 1 ) 甲基橙( 天津密欧化学试剂开发中心) 1 2 ) 十六烷基三甲基溴化铵( d e n m a r ka r ) 1 3 ) 醋酸( 广州化学试剂厂a r ) 2 1 3 仪器 1 ) j b 9 卜d 型强力搅拌器( 上海标本模型厂) 2 ) j c 一1 5 型套式恒温器( 浙江新华医疗器械厂) 3 ) l g 牌微波炉( 天津乐金电子电器有限公司) 4 ) 三颈烧瓶( 浙江淑江玻璃仪器厂) 5 ) 回流冷凝管( 浙江淑江玻璃仪器厂) 6 ) 温度计 7 ) 9 0 7 0 8 b 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海佳胜实验设备有限公司) 8 ) b s 2 0 0 s 电子天平称( s i g m a ) 9 ) d s y 一卜2 孑l 恒温水浴锅( 北京东霞科学仪器厂) 1 0 ) 7 81 型滋力加热搅拌器( 上海南汇电讯器材厂) 1 1 ) 乌式粘度计( 浙江淑江玻璃仪器厂) 1 2 ) 碱式滴定管( 浙江淑江玻璃仪器厂) 1 3 ) k s w 一4 d 一1 3 型马福炉 7 1 4 ) 傅立叶变换红外光谱仪 2 1 4 方法 2 1 4 1 甲壳素的提取 以3 h c l 室温下搅拌反应，以钙黄绿素作指示剂，e d t a 滴定钙离子至反应液 成明显绿色以确定脱钙完全，筛洗至中性，以3 n a 0 h 开启冷凝装置搅拌下煮沸 脱蛋白质，l o w r y 法确定脱蛋白质完全，制得深色甲壳素。 2 1 4 2 壳聚糖的制备 2 1 4 2 1 壳聚糖制备工艺流程 黄粉虫壳聚糖的提取工业流程示意图见下图。 3 h c l 3 n a o h 试样= 。 至至 二b 钙试样= = = ：) ( 二至至垂亟p 甲壳素 四种方法 2 5 h 2 0 2 10 n a 2 s 0 3 6 0 c = 令 ! 至p 白色片状壳聚糖 2 1 4 2 2 连续碱液法( 传统方法) 制得甲壳素后，以4 5 n a o h ，1 1 0 开启冷凝装置搅拌反应6 h 脱乙酰基，制 备壳聚糖。 2 1 4 2 3 分步碱液法 制得甲壳素后，以4 5 n a o h ，1 1 0 。c 丌启冷凝装置搅拌反应2 h ，筛洗，再换 卜新鲜碱液继续脱乙酰基处理，共换碱2 次，制备壳聚糖。 2 1 4 2 4 微波法 以5 0 碱液，在7 5 0 w 、2 4 5 0 m h z 微波炉中分高档火、中档火、低档火至碱液 微沸，室温过夜。 2 1 4 2 5 相转移催化法 以十六烷基三甲基溴化铵为催化剂，按3 甲壳素加催化剂，做四因素三水平 乖交实验以确定醇碱介质中脱乙酰基制备壳聚糖的最佳反应条件。 表2 - 1 正交实验条件 因素水平 氢氧化钠浓度( a ) 反应温度( b ) 反应时间( c )碱醇质星体积比( d ) 旦 ! 竺!业 1 4 0 1 0 0 2 5 ：1 2 3 7 5 1 0 5 3 4 ：1 l 望一! ! ! ! ! ；1 2 1 5 各项指标检测方法 2 1 5 1 水份的测定：减重法 2 1 5 - 2 灰份的测定：重量法即马福炉中7 0 0 灰化至恒重，称量灰份重量。 2 - l - 5 3 表观粘度的测定：在2 5 水浴中用乌式粘度计测定 2 1 5 4 特征粘度测定：根据粘度的测定采用外推作图法 2 1 5 5 粘均分子量( m ) 的测定：稀释法 n = 1 8 1 l o 。m u ”，求m 2 1 5 6 脱乙酰度测定：酸碱滴定法 2 1 6 定性分析方法 采用红外光谱对比法分析壳聚糖。标准样品为分析纯壳聚糖( 原料：虾壳， 美国s i g m a 公司生产) ；仪器为傅立叶变换红外光谱仪；测定条件为将壳聚糖样品 烘干，k b r 压，；( 蒋挺大2 0 0 1 ) ：测定波数4 0 0 4 0 0 0 c m l 。 2 1 7 数据分析方法 采用直观分析方法。即单因素影响的结果之和( k ；) 中的最大值减去最小值得 级差值( r t ) ，根据r 值大小判断对实验结果影响因素的主次顺序。 2 2 结果与分析 2 2 ，i 不同脱乙酰基方法制得黄粉虫壳聚禧的各项指标 以黄粉虫为材料进行脱钙、脱蛋白制得甲壳素，采用不同脱乙酰基方法制得 壳聚糖产品呈白色略带黄色半透明粉末状，脱乙酰度达7 0 以上，粘度在2 0 0 m p a s 以上，各项指标测定值均超过标准5 ，其中相转移催化法所制得的壳聚糖粘均分子 量和粘度最高。( 表2 2 ) 表2 2 不同脱乙酰度方法制得壳聚糖的各项指标比较 脱乙酰基得率水份 灰份 脱乙酰度粘度粘均 方法( )( ) ( )( ) m p a s分子量 标准 7 0 2 0 0 连续碱液法3 17 5 0 7 68 9 7 2 1 74 9 1 0 s 分步碱液法 2 66 7 0 5 99 0 6 2 0 9 4 4 1 0 s 微波法3 89 1 0 6 27 2 9 2 0 34 1 1 0 ； 相转移催化 3 5 8 80 5 78 5 6 2 2 65 6 1 0 s _ 一 2 2 2 定性分析结果 壳聚糖样品与标准样品的红外光谱图见图( 2 一l 及2 - 2 ) 。从这两种图的谱带特 征可以看出，黄粉虫中提取的壳聚糖与标准样有很大的相似之处，黄粉虫提取的 壳聚糖与标样红外光谱图差异很小。这说明黄粉虫中提取的壳聚糖与标样化学构 成一致，在质上是致 口 d 0 0 03 5 0 03 o2 , 5 0 0川11 d 5 0 0 w a v s f l u m r c m 图2 - 1s i g m a 标准样品 4 0 0 03 5 0 0 3 0 一5 0 0 b w c m 。 图2 - 2 黄粉虫壳聚糖 2 2 3 不同脱乙酰基方法对脱乙酰度、粘度的影响 以下实验数据选用s i g m a 公司甲壳素产品为材料获得 2 2 3 1 连续碱液法与分步碱液法对结果的影响( 表2 - 3 ) 表2 - 2 连续碱液法与分步碱液法对壳聚糖各项指标的影响 、jf 1 、jj ，11、 、l v 。 ，f 、11li。 ，f、” 、 从表2 2 可以看出，以s i g m a 公司购得甲壳素为材料，利用连续碱液法与分步碱 液法脱乙酰基，制得的壳聚糖脱乙酰基均超过了9 0 ，分步法的甚至达到了 9 5 5 ，但分步法制得的壳聚糖粘度及粘均分子量均比连续碱液法的要低得多。在 所选用的脱乙酰反应中连续碱法与分步碱液法制得壳聚糖脱乙酰度最高，达9 0 以上。但这两种方法费时问，而且要求氢氧化钠浓度、反应温度都比较高，这样 生产周期比较长，制备成本、对设备的要求都比较高。 2 2 3 2 微波法不同条件处理对结果的影响( 表2 4 ) 表2 - 3 微波法不同条件对壳聚糖各项指标的影响 高档火 中档火 低档火 7 1 5 6 8 4 7 8 8 9 5 5 3 6 2 4 2 1 0 0 5 0 2 1 0 6 7 5 5 1 0 6 5 2 5 1 0 6 微波法是制各壳聚糖方法中最简单，最容易操作的方法。微波法比常规法达 到相同的脱乙酰度，所需的反应时间可以缩短9 0 ，壳聚糖粘度也明显提高。微 波法的缺点是温度较难控制，反应温度过高，分子链断裂速度很快，粘度下降， 时间越长粘度下降越多( 蒋挺大2 0 0 1 ) 。从表2 - 4 所示数据可以看出，高档火处理 所得产品的粘度、粘均分子量最小，中档火的粘度、粘均分子量最大，低档火的 脱乙酰度最高，粘度、粘均分子量也较高。当同样质量的反应液达微沸时，高档 火处理所需时间最短，只需低档火处理的3 0 左右，但反应条件太剧烈壳聚糖分 子链断裂很块，产品粘度急剧下降。中档火处理时间也只需低档火时间的一半左 右，反应时间短了，而且反应条件较低档火不是太剧烈，因此制得的壳聚糖产品 脱乙酰度最低，粘度、粘均分子量最大。通过三者比较，利用微波法制备壳聚糖， 中档火处理较好，中档火处理，脱乙酰度较其他两种方法处理降低，但粘度最高， 粘均分子量最大。 2 2 3 3 相转移催化法对产品质量的影响 在选用十六烷基j 三甲基溴化铵为催化剂，按3 甲壳素加催化剂的条件v ，选 取四因素三水平制定了l 。( 4 3 ) 正交表，进行正交实验，其结果列在表25 中。 2 5 3 5 2 1 7 4 1 6 2 5 9 1 6 3 9 4 2 0 0 7 6 6 0 2 0 9 2 2 0 2 6 2 1 4 6 5 4 3 9 4 8 3 4 1 5 2 0 9 8 1 9 5 7 2 1 2 4 2 2 5 3 2 9 6 3 9 2 9 3 6 7 0 1 4 6 2 r 5 2 3 4 】8 5 n 2 3 8 q2 4 6 z 甲壳素脱乙酰反应是碱催化反应，碱的催化能力随碱性增强而增强，由于乙 醇钠的碱性较氢氧化钠强，因此反应介质中含有乙醇，理论上应该有利于甲壳素 的脱乙酰反应( 蔡中英等1 9 9 8 ) ，这样可以降低氢氧化钠的浓度。选用十六烷基三 甲基溴化铵为催化剂，使反应条件变得温和，反应时间较常规法大大节省了，而 制得的壳聚糖各项指标都超过了标准6 。从表2 - 5 的数据和级差分析结果可以看出， 甲壳素脱乙酰反应的因素先后顺序为：氢氧化钠溶液浓度 碱醇质量体积比 反 应时间 反应温度。这与陈东辉等( 2 0 0 2 ) 实验结果，影响脱乙酰度的主次顺序： 反应温度 氢氧化钠浓度 反应时间有很大差异。从表2 5 所列数据可以看出， 13 舳糊呲撕m啷戮猫 4 与5 2 7 5 0 届每阻踮8呈德阻他韶船虬 1 1 l 1 l l 1 1 l豇乱弘弘乱缸弘融 2 3 4 3 4 2 4 2 3 蚴删蛳吣蚴撇|重 啪|呈m瑚呈m姗兰m ) o o与五与5 5 5 颤4 4钾盯盯3 3 3 l 2 3 4 5 6 7 8 9 k k k r k k k 在a 。b ，c 胍条件下制得的壳聚糖脱乙酰度最高8 8 5 ，但从产品粘度，经济、反应 时问等因素考虑相转移催化法制备壳聚糖的最佳l 业条件为：a b ：c 。d ：，在浚条件 卜- 制得的壳聚糖脱乙酰度达8 5 6 ，粘度2 4 6 9 、粘均分子量较大。在本研究中根 据夏士朋( 2 0 0 2 ) 所述最佳反应条件进行了一次实验，实验结果为脱乙酰度仅有3 9 ，这与夏士朋( 2 0 0 2 ) 结果脱乙酰度为7 2 3 差别很大，而且从表2 5 可以看出， 当碱液浓度为3 5 时，无论反应温度多高，反应时间多长，碱醇质量体积比多大， 所得壳聚糖产品脱乙酰度都不会超过6 0 。通过级差分析可以看出，影响产品粘 度的主次因素为氢氧化钠溶液浓度 碱醇质量条件l k 反应时间 反应温度。并 且与粘度随氢氧化钠浓度增大、反应温度升高、反应时间延长而降低一致。 外观 透明至半透明白色或微黄色 粘度 2 0 0 m p a s ( 浓度l 2 0 ) 氨基值4 0 6 0 含水量 1 0 不溶物 2 灰份 l k 条件，制得的壳聚糖脱乙酰度9 0 以上，粘度较大。以4 5 n a o h ，li o 。c 开启冷凝装置搅拌反应2 h ，筛洗，再换上新鲜碱液继续脱乙酰基处理，共换碱2 次，是分步碱液法中可行的条件，制得的壳聚糖产品达9 5 以上。 ( 3 ) 从壳聚糖的脱乙酰度、粘度、粘均分子量等质量要求来看，微波法脱乙酰反应 中，7 5 0 w 、2 4 5 0 m h z 微波炉中档火处理至微沸，放置过夜是微波法中比较好的脱乙 酰反应条件。 ( 4 ) 从产品质量、环保、经济、节省时间缩短生产周期等方面综合考虑，相转移催 化法是一种比较好的壳聚糖制各方法。通过正交实验，认为在以3 甲壳素的为催 化剂条件下，氢氧化钠溶液浓度为4 0 、反应温度1 0 5 。c 、反应时间3 h 、醇碱体 积质量比4 ：l ，是相转移催化法最优工业条件，制得的壳聚糖产品脱乙酰度8 5 6 ，粘度较高。 3 1 材料与方法 3 1 1 材料与试剂 第三章壳聚糖衍生物的制备 3 1 1 1 材料 壳聚糖，利用s i g m a 公司甲壳素制得，脱乙酰度大于8 5 3 1 1 2 试剂 1 ) 乙醇( 广州化学试剂厂a r t ) 2 ) 丙酮( 广州市海珠区化学试剂厂a r ) 3 ) 甲醇( 广州化学试剂厂a r ) 4 ) 氯乙酸( 上海化学试剂厂a r ) 5 ) 溴代异丁烷( 上海华东师大化工厂a r ) 6 ) 异丙醇( 广州化学试剂厂a r ) 7 ) 氢氧化钠( 广州化学试剂厂a r ) 8 ) 浓硫酸( 广州化学试剂厂a r ) 3 1 1 3 仪器 1 ) j b 9 卜d 型强力搅拌器( 上海标本模型厂) ： 2 ) 9 0 7 0 8 b 型电热恒温鼓风干燥箱( 上海佳胜实验设备有限公司) 3 ) d k8 型电热恒温水浴槽( 扬州市三发电子有限公司) 4 ) 三颈烧瓶( 浙江淑江市玻璃仪器厂) 5 ) 回流冷凝管( 浙江淑江市玻璃仪器厂) 6 ) 温度计 7 ) 乌式粘度计( 浙江淑江市玻璃仪器厂) 8 ) b s 2 0 0 s 电子天平称( s i g m a ) 9 ) 傅立叶变换红外光谱仪 1 0 ) k s w 一4 d 一1 3 型马福炉 3 1 2 方法 3 1 2 1 羧甲基壳聚糖的制备方法 1 ) 在1 0 0 0 m l 的三口烧瓶中，加入2 0 0 r a l 异丙醇和2 0 9 壳聚糖，开启搅拌器2 0 m i n 左右使壳聚糖均匀分散在异丙醇中。 2 ) 将预先配制好的l o m o l l _ l n a 0 1 t 溶液5 0 m l 分成5 份，每隔3 0 m i n 加入一份，加 完后在室温下继续搅拌l h ，得反应物淤泥浆。 3 ) 称取2 4 9 固体氯乙酸，分成3 - 4 次在搅拌下加入反应物淤泥浆中，加完后将反 应物混合物用水浴加热到6 5 ，在控温下开启冷凝装置和搅拌器继续搅拌n 立3 h ， 停止反应后用冷醋酸调节p h 7 8 。 4 ) 将上述混合物过滤，滤饼用无水甲醇充分洗涤，在6 0 下烘干至恒重，得产物 羧甲基壳聚糖约3 0 9 。 3 1 2 2 异丁基壳聚糖的制备方法 在带温度计、机械搅拌器和冷凝装置的三口烧瓶中，加入精制壳聚糖及一定 量含2 0 氢氧化钠的异丙醇，在室温搅拌l h ，使其溶胀，逐次加入过量的溴代异 丁醇，并升温至6 5 v i 豆应4 h ，反应停止后用6 m o l l 盐酸中和至反应体系的p h 为 l7 7 ，加入丙酮沉淀产物，静置片刻后过滤，8 5 甲醇洗涤数次至无溴离子后，用无 水甲醇洗涤两次，6 0 。c 干燥，得微黄色粉术状异丁基壳聚糖。 3 2 产物性能测试与鉴别 3 2 1 溶解度的测定 称取一定量羧甲基壳聚糖与异丁基壳聚糖逐渐加入2 0 0 m l 蒸馏水中，搅拌溶解， 至不溶为止。 3 2 2 粘度的测定 将1 o g 羧甲基壳聚糖与异丁基壳聚糖溶入l o o m l 蒸馏水中，溶解后，用乌氏粘 度计测定其粘度。 3 2 3 取代度测定 灰份分析法。准确称取1 0 0 0 9 羧甲基壳聚糖与异丁基壳聚糖于坩锅中，炭化， 马福炉7 0 0 。c 灰化4 0 m i n ，将灰份残留物移入锥形瓶中，加入2 滴甲基红指示剂、 5 0 m l 去离子水，0 1 m o l 硫酸标准溶液滴定至红色，再加入l o m l 硫酸标准溶液总体 积为v - 。将溶液加热煮沸l o m i n ，用o 1 m o l 氢氧化钠标准液滴定至黄色，消耗的 氢氧化钠的体积为v 2 计算公式如下： d s = 2 0 3 x ( 1 0 0 0 - - 8 0 x ) x = ( c * v l cn 化饿v 2 ) w d s - - 羧甲基壳聚糖、异丁基壳聚糖取代度；c 。一硫酸标准液浓度：v 。一硫酸标 准溶液总体积；c 氢n 钠一氢氧化钠标准液浓度：v ：一氢氧化钠标准液体积：w 一羧 甲基壳聚糖、异丁基壳聚糖质量。 3 2 4 红外光谱采用k b r 压片法( 蒋挺大2 0 0 1 ) 。 3 3 结果与分析 3 3 1 制备的壳聚糖衍i i 物的特。件 表3 一j 制备的壳聚糖衍牛物的特性 氢氧化钠与氯乙酸重量比为o 9 0 ，控制反应温度6 5 。c ，反应时间3 h ，所制备 的羧甲基壳聚糖的取代度为7 9 5 6 ( 表3 1 ) ，溶解度高，其水溶性好，透明度高。 取代度大于6 0 的羧甲基壳聚糖易溶于水，取代度越高水溶性越好，溶液的透明 度也愈好。 壳聚糖分子中存在着易发生化学反应的活性基团一n h 。、o h ，可与多种试剂发生 取代反应。要破坏可聚糖分子中固有的氢健，并使改性后的异丁基壳聚糖溶于水， 体系中的碱必须达到一定的浓度。氢氧化钠浓度太低，产物的水溶性不好；太高， 又会引起分子链的断裂，使产物的平均分子量下降。另外，反应温度、时间、改 性剂的用量及加入的方式等对产物的取代度和粘度都有较大影响。在2 0 氢氧化 钠的异丙醇，逐次加入过量的溴代异丁醇，并升温至6 5 反应4 h ，所得异丁基壳 聚糖取代度为5 7 4 5 ( 表3 - 1 ) ，溶解度较高，其水溶性较好，透明度较高。同时， 同量的溴代异丁烷分次加入时，产物的取代度明显高于一次性加入的结果，这可 能是因为溴代异丁烷在6 0 因挥发而有一定损失，不断地补充溴代异丁烷可适当 减少这种损失，延长其壳聚糖的接触反应时间，从而使反应更为完全。 3 3 2 产物的鉴别 4 0 0 0 1 1 0 0 05 帅v _ m b e rc m 。 图3 - 1 羧甲基壳聚糖红外光谱图 一一，ij，7r一，71a飞，、。， 图3 2 异丁基壳聚糖红外光谱图 图3 - 3 s i g m a 标准壳聚糖红外光谱图 壳聚糖存c 2 、c 6 上有一n h 2 和一o h 活性基团，易发生羧甲基取代反应。取代后 的羧甲塾壳聚糖有三种：o 一羧甲基壳聚糖，n 一羧甲基壳聚糖，n ，o 一羧甲基壳聚糖。 壳聚糖在碱性介质中与氯乙酸发生反应，取代反应局限在c 6 的伯羟基，t 成的产 物为o 一羧甲基壳聚糖；壳聚糖与_ 二羟厶酸反应生成水溶性胶状亚胺( 席夫碱) ， 然后用适当的还原剂如氰基硼氢化物还原，则取代反应只发生在c 2 的伯胺上，生 成n 羧甲基壳聚糖；壳聚糖在浓碱液中与氯乙酸反应，适当控制反应条件，则可 以彳寻到n 0 羧甲基壳聚糖。 本试验是在1 0 m o l l 氢氧化钠存在的情况下壳聚糖与氯乙酸反应，得到的应 是n ，o 一羧甲基壳聚糖。从图3 一l 与图3 - 3 来看，壳聚糖与羧甲基壳聚糖没有明显 的差别，但羧甲基壳聚糖在1 6 0 4 处有羧基的特征吸收峰，说明壳聚糖在氢氧化钠 溶液中与氯乙酸反应后引入了羧基，该特征吸收峰的强度随取代度的改变而改变。 羧甲基壳聚糖的n - h 吸收峰1 4 2 3 c m 1 、1 3 4 2 c m l 、1 0 6 9 c r n l 与壳聚糖相比有一定 的变化，这说明取代反应主要发生在- n h 2 活性基团，是以n 位为主的羧甲基壳聚 糖。 从图3 2 与图3 - 3 可见，壳聚糖异丁基化后，在2 8 8 0 、2 9 3 0 、1 4 5 0 c m l 处的 吸收峰强度明显比壳聚糖增大，说明在壳聚糖分子中引入了c h 2 、一c h 3 基团，而 改性后的n h 弯曲振动吸收峰1 6 5 5 、1 6 0 6 、1 4 2 5 c m 较之壳聚糖1 6 3 0 、1 5 2 4 c m “ 峰有明显变化，说明取代反应主要发生在- n h 2 的活性基团上。 3 3 小结 ( 1 ) 氢氧化钠与氯乙酸重量比为o 9 1 ，控制反应温度6 5 。c ，反应时间3 h ，所制备 的羧甲基壳聚糖的取代度为7 9 5 6 ，溶解度高，其水溶性好，透明度高。壳聚糖 经羧甲基改性以后，提高了其水溶性，扩大了其应用范围。 2 ) 本实验在较温和的反应条件下，对壳聚糖进行了改性研究。结果表明用澳代异 丁烷为卤代剂，2 0 氢氧化钠异苯醇为反应介质，在6 5 。c 反应4 h ，异丁基壳聚糖 有良好的水溶性。 2l 第四章不同分子量壳聚糖及壳聚糖衍生物抑菌活性比较 4 1 材料与方法 4 1 1 材料 4 1 1 1 壳聚糖及壳聚糖衍生物 壳聚糖( 分子量= 7 5 5 0 ，3 2 9 k d as i g n m 公司购得) 壳聚糖( 分子量= 9 8 k d a 黄粉虫中提得) 羧甲基壳聚糖( 自制) 异丁