（微生物学专业论文）植物中抗氧化活性成分的纯化及构效解析.pdf

ab s t r a c t r e a c t i v e o x y g e n s p e c i e s p r o d u c e d b y s u n l i g h t , u lt r a v i o l e t l i g h t , i o n iz i n g r a d i a t i o n , c h e m i c a l r e a c ti o n s a n d m e t a b o l i c p r o c e s s e s h a v e a w id e v a r i e t y o f p a t h o l o g ic a l e ff e c t s , s u c h as d n a d a m a g e , c a r c i n o g e n e s i s a n d c e l l u l a r d e g e n e r a t i o n r e l a t e d t o a g i n g . t h e p o t e n t i a l v a l u e o f a n t i o x i d a n t s h as p r o m p t e d i n v e s t i g a t o r s t o s e a r c h f o r n a t u r a l c o m p o u n d s w i t h p o t e n t a n t i o x i d a t i v e a c t i v ity b u t l o w c y t o t o x i c i t y . i n t h e p r e s e n t s t u d y , a q u e o u s e x t r a c t o f m e d i c i n a l h e r b f 2 1 w e r e i d e n t i f i e d f o r i t s a n t io x i d a n t c o m p o n e n t s . a n a c t i v e c o m p o n e n t ( f , ) w as i s o l a t e d a n d p u r i f i e d t h r o u g h c m3 2 - c a t i o n c e l l u l o s e e x c h a n g e r a n d s e p h a d e x g - 7 5 c o l u m c h r o m o t o g r a p h y . s t r u c t u r e as s a y in c l u d i n g n mr , f t i r , u v s c a n a n d e l e m e n t a l a n a l y s i s i n d i c a t e d t h a t 瓦i s a k i n d o f g a l l i c a c i d d e r i v a t i v e . t h e a n t i o x i d a n t e ff e c t s o f c r u d e e x t r a c t a n d p u r i fi e d fr a c t i o n o f f 2 1 a g a i n s t l i p i d p e r o x i d a t i o n i n r a t b r a i n a n d k i d n e y h o m o g e n a t e s a n d r a t e r y t h r o c y t e h e m o l y s i s , a n d s u p e ro x i d e - a n d h y d r o x y l r a d i c a l - s c a v e n g i n g a c t i v i t i e s w e re e x a m i n e d . 凡e x h i b i t e d p o t e n t a n t i o x i d a t i v e a c t i v i ty i n a l l as s a y s . a t t h e s a m e t i m e , a n e w t y p e o f a n t i o x i d a n t 一 p o ly s a c c h a r i d e s f z e x h i b i t e d p o t e n t a n t i o x i d a t i v e a c t i v i ty i n h e m o l y s i s a s s a y . n o n e o f t h e c o m p o n e n t s t e s t e d e x e rt e d a n o b v i o u s p ro - o x i d a n t e ff e c t . h e n c e o u r r e s u l t s i n d i c a t e t h a t e x t r a c t s fr o m f 2 1一 g a l l i c a c i d d e r i v a ti v e ( f 3 ) a n d p o l y s a c c h a r i d e s 低) h a v e p o t e n t a n t i o x i d a t i v e p r o p e r t i e s a n d l o w p r o - o x i d a n t e ff e c t k 妙w o r d s : p l a n t , a n t i o x i d a n t , f r e e r a d i c a l , p e r o x i d a t i o n , s t r u c t u r e - a c t i v i t y r e l a t i o n s h i p 南开大学硕士研究生论文前言 第一部分 前 言 一 氧自由基的代谢 ( 一)氧自由基 原子或分子外的电子都在一系列能级不同的轨道上运动。根据分子轨道理 论，每一轨道上可容纳两个自 旋相反的电子，自由基 ( fr e e r a d i c a l ) 便是指那些 独立存在的有一个或几个不配对电子的原子或基团1i 1 。自由基的特征在于它具 有不配对电子，因此具有极高的化学活性，能从邻近的分子夺取一个电子以弥 补它自 身的外层轨道而变得稳定.氧所形成的自由基统称为活性氧，无论在正 常代谢或病理变化中均极为重要。这些活性氧包括超氧阴离子、轻自由基、过 氧化氢分子、 氢过氧基、 烷氧基、烷过氧基、 氢过氧化物和单线态氧p 1 超氧阴离子自由基不仅具有重要的生物功能和与多种疾病有着密切的关 系，而且它还是所有氧自由基中的第一个自由 基，可经过一系列反应生成其它 氧自由基，因此具有特别重要的意义11 1 . 轻基自由基则是己知氧化性最强的氧自由基，可以进攻细胞成分，膜脂、 蛋白 质、酶和核酸等，这是自由基生物学和医学的重要内容13 1 ( 二)氧自由基与氧毒性 自由基参与的很多反应对机体是有益的。在正常细胞的代谢过程也有氧自 由基产生，但体内还存在一个清除氧自由基的体系，主要包括一些抗氧化酶和 抗氧化剂，使得体内氧自由基的产生和清除处于一个平衡状态。 但在日光、紫外线、电离辐射、化学反应、药物等外界物理化学因子的作 用下，或在某些病理情况下，机体发生氧化应激反应，将产生大量高反应活性 的氧自由基1 z n m t , c d m t 2 c d m t , 。 最新研究结果证明z n m t 2 基因 可在各种类型细胞和器官中表达， 而m t , 基因表 达的专一 性更强。 据 此可 解释， 不同 亚型m t 基因非 等同表 达而 产 生生理功能的差异。此外，还特别注意研究含硫化合物的免疫增强作用与抗氧 化作用的关系。 i v . 植酸和植烷的 研究 谷物和植物种子内含有植酸，以玉米胚芽、米糠、麦数、芝麻中含量较高。 植物作为抗氧化剂使植物种子在生 长时 氧 化代谢 旺 盛保护本身 不被氧化损伤。 它通过鳌合作用和铁形成鳌合物而抑制种子内脂质过氧化及其所造成的损伤。 ( 二)抗氧化剂研究的方向和待解决的问题 i .金属离子的作用 自由基反应涉及最多的金属离子是铁离子，这是由于铁离子本身的性质和存 在的广泛性所决定的、在机体内的氧化还原电势和 p h 条件下铁离子容易改变价 南开大学硕士研究生论文 一 j j一一 j 一 月 u台 态。 金属离子或启动子 ( p r o m o t e r ) 存在的地方，就是产生 o h 的地方，也是 损伤生物分子的地方。因为 o h 极为活泼，作用半径小。这样，金属离子附 在膜脂上，就会发生脂质过氧化。铁是细胞功能所必需的元素，但是，若铁在 不应存在的地方出现将会造成意外的损伤。所以，在细胞内的铁离子总是以络 合物的 形式 存在， 如血 铁黄素、 转铁 蛋白 、 铁蛋白 等。 并且。 用 铁离子库 ( p o o l s o f i r o n )定 域化 ( c o m p a r tm e n t i n g ) ，以 隔开敏感的膜位置。 然而，通常情况下， 如光、辐射、 化学、感染或应激反应， 铁离子变为非定域化，并不断加剧自由 基链式反应的启动。f e z 参与f e n t o n型h a r b e r - we i s s 反应产生 o h、游离铁也 可催化氧化还原往返机制 ( r e d o x - s h u t t l e ) . ii . 合成可实际应用的抗氧化酶 为了补充体内的抗氧化酶 s o d等，人们从生物制品中提取 s o d等酶用于 临床，但受到来源和寿命的限 制。为此许多人合成 s o d的模拟物或 g s h - p x 的模拟物。国内外在这方面己 进行了许多 研究，多是将 s o d连接于高分子化合 物，延长其在体内的存在时间。 将s o d联接上特殊的活性基因而制成锚泊s o d是一个新的设想。这种s o d 可结合于体内某些部位和组织，在该处聚集较多的s o d发挥作用。 ii i . 寻找高 效低毒的 天然抗 氧化 剂 开发利用天然抗氧化剂已成为当前国内 外发展的趋势，也是当前自由基生物 学的前沿课题。中草药和食物中抗氧化剂的研究具有我国特色，也是在国际上 有影响的和领先的研究领域。 w. 调动机体中内 源性抗氧化剂的活性 上述抗氧化剂是外源性地加入机体，以提高机体清除自由基的能力。其实 生物体内有丰富的抗氧化剂。设法调动或激活机体中的内源性抗氧化剂，使其 数量和活性增强到机体需要的水平，将有利预防或减轻自由基损伤。例如，实 验证明，练习气功或者借助气功师治疗，可能使机体微循环得到改善，自由基 遭到抑制，脂质过氧化减弱，细胞损伤减轻，疾病明显缓解。研究抗氧化剂包 括两大方面，一方面研究内源性抗氧化剂的产生，外源性抗氧化剂氧化还原性 质，活性中 心和电子传递速率;另一方面必须深入研究抗氧化剂的吸收和代谢 环节，起始作用，靶细胞内的作用点及其作用于生物大分子的本质。尽管抗氧 化剂的研究进展很快，但尚存在许多问 题pfi 待解决，其中最薄弱的环节是关于 抗氧化剂的体内代谢和作用环节。鉴于上述问题没有圆满解决，导致合理应用 抗氧化剂受到限制。 南开大学硕士研究生论文 ( 三)抗氧化剂的 促氧化作用 业己证实具有亲核性和还原性或者具有清除自由基和抑制氧化反应的抗氧 化剂在一定微环境条件下还具有很强的氧化损伤作用称之为促氧化作用。 内 源性抗氧化剂具有促氧化作用的主要有两大类( a ) 抗坏血酸和烯二醇( e n e -d i i s ) 。抗坏血酸在氧化还原链的自 身被氧化过程中表现出促氧化作用从而产 生细胞毒效应。此外烯二醇和二轻基富马盐 ( d i h y d r o x y f u m a r a t e )表现较抗 坏血酸更强的促氧化作用。( b )半耽氨酸和谷肤甘肚之细胞毒作用主要是通过 其 氧化过程中 产生h , o z 及o h 而 使细胞内 产 生促氧化作 用的结果。 抗氧化剂的促氧化作用的机制和生物学意义的理论体系正在形成。现分述 如下: 氧化损伤的闽值 促氧化作用所造成的氧化应激态升高可导致细胞应激态，加速细胞凋亡和 细胞死亡。用抗氧化剂调节 ( 或干预)体内 氧化应激水平都应有一个阐值。关 键问题在于调节细胞应激态是一个动力学过程，主要是反映外源性抗氧化剂加 上代谢所再生的抗氧化能力之和的基本水平对氧化剂所消耗的抗氧化剂之间竟 争的动力学变化。 氧化还原链 抗氧化剂做为一种自 动氧化的催化剂参与体内氧化还原链和网络系统。通 过自身氧化进行电子传递 ( 或递氢) ，形成 “ 自由基转换” ，使代谢物氧化及其 毒性代谢物再生。因此，常以抗氧化剂自 动氧化的程度和性质测定机体内氧化 还原链的整体性质。总之，抗氧化剂的促氧化作用之大小在很大程度上取决于 氧化还原链及其动力学变化。 制约抗氧化剂促氧化作用的因素 体内许多氧化还原链将机体各种生理过程联结成一个整体，成为生命过程 能否正常进行的决定性因素。抗氧化剂和促氧化剂受很多因素制约 ( i )氧化还 原链中的金属离子传递电子的作用，如:f e 2 - f e ; ( i i ) 抗氧化剂的浓度成为 抗氧化作用还是起促氧化作用的开关，低浓度起促氧化作用，浓度高到可以完 全清除代谢反应环中 产生的 氧自 由 基， 则 起抗氧化作用:( i i i ) 抗氧化的双( 多) 相作用和氧分压有关。氧分压低则会出 现促氧化作用。随着氧浓度升高，氧化 作用减弱，细胞毒作用下降。 但也有相反的 情况. 氧浓度高起促氧化作用; 低 氧浓度可有效地抑制脂质过氧化。 如 p 一 胡萝卜 素。以上三种因素之间也互为因 果，联成一个整体对氧化还原链起相互制约作用。 南开大学硕士研究生论文 一 ，j 一， 月 u舌 三 天然杭氧化植物资源的 研究与开发 ( 一)抗氧化剂保护的一般原则 抗氧化剂这一名词经常使用，文献中也随处可见，但人们对它的理解比较 混乱。一个较严格和普遍被接受的定义是:任何物质当以低于氧化底物浓度存 在时，可以明显推迟或抑制底物的氧化，该物质就称为抗氧化剂16 1 抗氧化剂依其作用性质可以分为两大类，第一类为预防性抗氧化剂，这类 抗氧化剂可以清除脂质过氧化链起动阶段的自由基等引发剂，如 s o d ，过氧化 氢酶，谷胧甘肤过氧化物酶等:第二类为脂质过氧化链式反应的阻断剂，这类 抗氧化剂可以捕捉脂质过氧化链式反应中产生的自由基，减少脂质过氧化反应 链长度，因此可以阻断或减缓脂质过氧化的进行，如维生素 c ，维生素 e等就 属于这类抗氧化剂。 抗氧化剂可以 作用于脂质过氧化的以 下几个水平p ,t a 1 )减少局部氧气浓度; 2 )清除起动脂质过氧化的引发剂; 3 )结合金属离子， 使其不能产生起动脂质过氧化的经基自由基或使其不能 分解脂质过氧化产生的脂过氧化氢; 4 )将脂质过氧化物分解为非自由 基产物; 5 )阻断脂质过氧化的反应链， 既清除脂质过氧化中间自由 基， 如脂自 由 基， 脂氧自由基和脂过氧自由基。 ( 二)天然抗氧化剂的开发 从目 前研究结果揭示的证据表明，氧自 由基几乎和人类大部分常见的几种 主要疾病都有关系，从人类死亡率最高的心脑血管疾病，到人类最可怕的癌症， 以及近年来对人类造成威胁的艾滋病，无一不和氧自 由基有着密切关系。 在神 经系统， 早 老性痴呆症 ( a l z h e i m e r d i s e a s e ) , 震颤 麻痹症 ( p a r ki n s o n d is e a s e ) , 癫痛等疾病都有氧自由 基的参与;在循环系统，动脉粥样硬化，血栓的形成， 心肌缺血再灌注损伤的发病过程中氧自由基起着重要作用;肝炎和糖尿病与氧 自由基密切相关;致癌、促癌和癌的形成的每一步都有氧自由基的产生和参与; 白内障的形成和视网膜的损伤是氧自由基和脂质过氧化的直接结果;在免疫系 统的炎症中，巨噬细胞呼吸爆发释放大量氧自由基。 因此，研究人员迫切希望寻找高效的抗氧化剂来防止这类疾病的发生以及 南开大学硕士研究生论文 一 ，j一 一 月 u舌 才 马 延缓衰老的进程。然而， 目前很多合成的抗氧化剂，在一定的条件下，具有一 定的毒性和诱变性，它们在使用上受到很大的限制 19 1 。所以，研究人员已把注 意力转向天然抗氧化剂。天然抗氧化剂主要来源于植物。近年来，从植物中寻 找安全、高效的抗氧化剂成为抗氧化剂研究的热点，也取得了许多成果，并有 少数品种进行了商业化的生产。 目前，国内外有关天然产品的自由基清除和抗氧化活性的研究均处于筛选、 纯化阶段。其中，植物活性成分在过去的十年间的分离纯化工作已广泛开展， 研究表明:黄酮类、多酚类、木质类和多种植物提取成分具有抗氧化活性iz o - 1 近年来，发现不少中药具有清除自由基的作用，使我们从一个崭新的角度来研 究中药的药理。但此类研究只局限于亚洲范围内开展，而且主要是一些黄酮类 物质。 植物来源的抗氧化成分种类繁多，主要是由含酚轻基，不饱和双键，还原 性杂原子等基团的化学成分组成。多年来，国内外学者做了大量的从植物中 筛 选 抗氧化剂的 工作。1 9 5 1 年 c h i p u l t 等人报道认为 唇形科植 物迷 迭香 和鼠 尾草 具有很好的抗氧化能力 4 1 . z n a t a n i ( 1 9 8 2 ) 等人从迷迭香干叶中分离三种酚系 -菇化合物:迷迭香酚，表迷迭香酚和异迷迭香酚，它们对亚油酸有强的抗氧 化能力，是丁化轻基苯甲醚 ( b h a )的4 倍2 1 1 . wu ( 1 9 9 2 )等人从迷迭香的甲 醇提取物中分离出3 种与b h a抗氧活性相当的化合物: 鼠尾草酚， 迷迭香二酚， 迷迭香醒6 1 。常静 ( 1 9 9 2 )等也从我国引种的迷迭香中分离出迷迭香酚和鼠尾 草酚12 7 1 茶叶作为抗氧化剂资源， 近年国内外许多人对其进行了深入的研究，明确 其抗氧化成分为多酚类衍生物。 包含四种单体成分，其中表儿茶素没食子酸酷 抗氧化活性为生育酚的1 6 . 5 倍2 8 ,2 9 1 。目 前，有许多厂家进行商业化生产. 甘草的乙醇提取物抗氧化能力强于 b h a ，对生育酚和多种有机酸有协同作 用3 0 1 。安静 ( 1 9 9 5 )等研究发现甘草提取物的抗氧化性强于生育酚，而单一黄 酮化合物的抗氧化性远远小于生育酚，它的抗氧化是多种抗氧化物质协同作用 的结果3 11 。吴仲几 ( 1 9 9 6 )等对提取甘草酸后的甘草渣进行不同 溶剂提取分离， 并进行抗氧化和抗黄曲霉菌试验，结果表明甘草渣的乙醇粗提物抗氧活力最佳， 有抑制黄曲霉菌活性，经分离鉴定具有双重活性的化合物为2 , 4 , 4 一 三梭基查 几酮 ( 异甘草素)3 2 1 ，这一试验对开发具有多重功能的抗氧化剂具借鉴意义。 银杏叶提取物 ( g b e )中主要的生物活性成分为黄酮类和银杏菇内 酷。 g b e 具有广谱的抗氧化活性，已广泛应用于医药、保健食品等领域。至9 0 年代，日 南开大学硕士研究生论文 本和美国等国家己将g b e作为防治心脑血管疾病和抗衰老的第三代功能食品和 添加剂加以开发。 尚 遂存 1 9 9 4 ) 等从5 1 种植物中筛选出2 3 种具有较强抗氧活性的植物，其中 大黄等 1 0 种抗氧活性最强13 3 j ;韩国k i m ( 1 9 9 4 )等从 1 8 0种植物中发现 4 4种 植物的甲醇提取物有抗氧活性，进一步筛选出淫羊霍、丁香、补骨脂等不同极 性提取物，黄苹、甘草等甲醇提取物最为突出13 4 1 ; 户田 ( 1 9 8 4 )等对 1 0 7种植 物的甲醇提取物进行研究，确认姜、厚朴、郁金有较强的抗氧化活性13 5 1 ;台湾 s u ( 1 9 8 6 ) 等对1 9 5 种植物用不同溶剂浸提， 证明2 2 种植物浸提物强于生育酚 的抗氧化能力，其中金锦香、石榴皮、马鞭草的甲 醉提取物，金锦香、三七草、 芡实、 钩藤的乙 酸乙醋提取物抗氧化能力均强于b h a 13 1 0 此外近年国内对桂皮、荔枝草、香紫苏、 花生等植物的抗氧活性也进行了研究。 综合国内外抗氧化植物资源的研究3 7 -4 3 氧化性能，具有开发应用的价值，其中茶叶、 在日本己商业化生产。 薯蓖、过路黄、甘薯、向日葵、 表i ， 表b 中的植物具有较强的抗 甘草、迷迭香提取物的抗氧化剂 南开大学硕士研究生论文 表i国外植物抗氧化剂成分研究 p l a n tc o n s t i t u e n t c o u n t ry da t e l a mi a c e a e p a l m r o s ma r i n u s o ff i c i n a l i s s a l v i a o ff i c i n a l i s . 1 . g y n o s t e m m a p e n t a p h y l l u m c a r ic a p a p a y a l i n n . r o s ma r i n i c a c i d c a r o t e o i d s p h e n o l i c d it e r p e n e s f r a n c e us 1 9 9 1 1 9 9 1 1 9 9 2 s a p o n i n s ca n a d a1 9 9 3 e r o d i u m c i c u t a r i u m lp o l a n d1 9 9 4 s o y b e a n b e r r i e s a n d n u t s ro o i b o s t e a s u n fl o we r o i l p l u c h e a s a g it t a l i s , ( l a m. ) c a b r . , g i n g k o l i c o r i c e ma g n o l i a o ff i c i n a l is t e a e x t r a c t s ca c t u s fl o we r l e a v e s o f t e r mi n a l i a c a t a p p a l p a r s l e y f r u c t u s c o rni a c h y r o c l i n e s a t u r e i o i d e s ( l a m.) d c . ( m a r c e l a ) e v e n i n g p r i mr o s e v i t a m i n c , m a l i c a c i d , c i t r i c a c i d a n d g l u c o s e v it a m i n c a n d s o m e p o l y p h e n o l i c c o m p o u n d s : t a n n i n , ( + ) - c a t e c h i n a n d g a l l i c a c id i s o fl a v o n o i d s ( e s p . p h y t o e s t r o g e n ) l i g n a n s f l a v o n o i d s t r i a c y l g l y c e r o l s a q u e o u s e x t r a c t j a p a n 1 9 9 3 f i n l a n d f i n l a n d j a p a n b u l g a r i a s p a i n 1 9 9 5 1 9 9 5 1 9 9 6 1 9 9 6 1 9 9 6 g i n k g o l i d e s h o n o k i o l p o l y p h e n o l s p u n i c a l a g i n p u n i c a l i n c e r ma n y i s r a e l t a i wa n t a h v a n i s r a e l t a i wa n 1 9 9 7 1 9 9 7 1 9 9 7 1 9 9 8 1 9 9 8 1 9 9 8 f l a v o n o i d s f l a v o n o i d q u e r c e t i n a n d i t s d e ri v a t i v e s p h e n o l i c a c i d s s u c h a s c a ff e i c , c h l o r o g e n i c a n d i s o c h l o r o g e n i c a c i d s e t h a n o l i c e x t r a c t b u d a p e s t c a n a d a a r g e n t i n a 1 9 9 8 1 9 9 8 1 9 9 8 p o l a n d1 9 9 9 南开大学硕士研究生论文 表i i国内抗氧化剂成分研究 植物名称 茶叶 ( c a m e l l ia s i n e n s i s ) 甘草 ( g ly c y r r h i z a u r a l e n s i s ) 迷迭香 ( r o s m a r i n u s o f c i n a l s ) 鼠层草 ( s a l v i a 雌c i n a l is ) 牛 至 ( o r ig a n u m v u lg a r e ) 荔 枝草 ( s a l v i a p l e b e i a ) 百里香 ( t h y m u s v u l g a r i s ) 桂皮 ( c i n n a m o m u m j a p o n i c u s ) 姜 ( z i n g i b e r 娜c i n a l e ) 八角茵香 ( i l l i c i u m v e r u m ) 花生 ( 壳) ( a r a c h is h y p o g a e a ) 甘薯 ( 冷)( di o s c o r e a e s c u l a n i a ) 向日葵 ( 籽、叶)( h e l ia n t h u s a n n u u s ) 金 银花 ( c o n i c e r a j a p o n ic a ) 杜仲 ( e u c o m m i a u l m o i d e s ) 金锦香 ( o s b e c k i a c h i n e n s i s ) 过路黄 ( l y s i m a c h i a c h r is t in a e ) 月 一 参 ( s o l v i a m i l t i o r r h i z a ) 芡实 ( e u r y a l e f e r o x ) 山 茱英 ( 核) ( c o r p u s o f f i c i n a l is ) 马齿觉 ( p a r t u l a c a o l e r a c e a ) 零陵香 ( c o m a r o n a o c l o r a t a ) 大黄属 ( r h e a m ) 牡丹 ( 皮) ( p a e o n i a s u ff r u t ic o s a ) 抗氧化成分 茶多酚 甘草查几酮a , b ，甘草异黄酮 迷迭香酚、鼠尾草酚、迷迭香醇、迷迭 香二酚、异迷迭香醇、迷迭香醒 鼠尾草酚、迷迭香醇、表迷迭香醇，异 迷迭香醇 寮香草酚、谜迭香酸等 乙醚提取物 类黄酮化合物 氯仿提取物、丁香油酚、甲基丁香油酚 姜油酮、6 姜油醇、b 姜油酚 甲醇提取物 总黄酮、绿原酸、咖啡酸 绿原酸、异绿原酸、新绿原酸、4 - 0 - k咖 啡酸奎尼酸 绿原酸、异绿原酸、新绿原酸、咖啡酸 绿原酸、异绿原酸、忍冬黄素、总黄酮 绿原酸、咖啡酸 鞍花酸、类黄酮及其配糖体 酚类 丹参酮 i 、二氢丹参酮、甲基丹参醒、 隐丹参酮 甲醇提取物 甲醇提取物 甲醇提取物 乙醇提取物 大黄酚、大黄酸、葱醒类衍生物 牡丹酚 南开大学硕士 研究生论文 四 研究意义 我国的药用植物己经有几千年的研究历史，很多实验已经证明，很多植物 中含有天然抗氧化剂，包括现在已经在临床使用的丹参酮，银杏叶提取物 e g b 7 6 1 ，茶多酚等，它们正在为治疗人类的心脑血管疾病发挥着重要作用。从 某种意义上讲，药用植物的天然抗氧化剂研究现在已经发展成为一个自由基医 药学新学科。随着天然抗氧化剂研究的深入，其在治疗人类疾病，防止和减缓 人类衰老方面具有诱人的开发前景。 但是纵观报道文献，可以发现，这些研究涉及面很广，深入研究较少。而 现代药物学要求分离出纯的活性有效成分，并对其药理作用及其机制进行深入 阐述。 本研究以人们一直饮用的一种清热解毒的蔷薇科植物 f 2 1为材料，对其高 效抗氧化活性成分进行了提取纯化:并对分离出的成分从几个不同角度进行了 抗氧化活性的研究比较，以阐述其体外抗氧化机理;并对其分子结构进行初步 解析。以达到两方面的目 的:其一，由于以前并未见对 f 2 1抗氧化活性的研究 报导，因此试图通过本研究对 f 2 1中抗氧化活性成分进行分析与纯化，解释其 抗氧化构效关系;其二，试图从 f 2 1中寻找一些新型的抗氧化成分，为开发新 型的抗氧化剂奠定理论基础。 南开大学硕士研究生论文材料与方法 第二部分 材料与方法 一 实验材料 ( 一)植物水提物 本研究采用的植物 f 2 1购自香港商店 水浸泡过夜，回流煮沸 2 h ，将提取物倾出 燥，所得干粉用于本研究。 将干燥的植物花切成小块，室温用 5 0 0 0 r p m离心 l 0 m i n ，上清冷冻干 ( 二)主要试剂 i .梭甲 基纤维素阳离子交 换剂 ( c m 3 2 - c e l lu l o s e c a t io n e x c h a n g e r) ( wh a t m a n ) ; 2 . s e p h a d e x g - 7 5 、 蓝 色葡 聚 糖2 0 0 0 ( p h a r m a c i a ) ， 鸡卵 清蛋白 、 细胞 色 素 c ( s i g m a ) ， 牛 血清白 蛋白( 天象 人); 3 .脱氧胆酸钠 ( f lu k a ) ; 4 . d n a ( i型，小牛胸腺) 、硫酸博来霉素、丁化经基苯甲醚 ( b h a) ( s i g m a ) ; 5 . 2 , 2 一 偶氮 双一 ( 2 - 胖基丙烷) 氯化二氢 ( a a p h ) ( w a k ) ; 6 .吩嗦硫酸甲 酷 ( p m s ) 、 还原型辅酶i ( n a d h ) .氯化氮蓝四哇 ( n b t ) c ( s i g m a ) 7 .硫代巴比 妥酸 ( t b a ) ( s i g m a ) ; 8 . 其它试齐 均为国产分析纯。 ( 三)实验动物 本研究采用正常雄性 s d大鼠( 1 5 0 - 2 0 0 g ) ， 购自 天津市劳动卫生研究所。 饲养于标准实验室条件 ( 2 1 士2 0c , 1 2 1 1 2 h 昼夜循环) 下，喂食标准啮齿类食物。 南开大学硕士研究生论文1 d 料与方法 ( 四)主要仪器: s b s 1 0 0数控计滴自 动部分收集器上海沪西分析仪器总厂 7 5 2紫外光栅分光光度计上海分析仪器总厂 l g j 0 . 5冷冻干燥机北京四环科学仪器厂 高速冷冻离心机2 0 r p 5 2 d hi t ac hi m a g n a - 5 6 0 型付里叶 变换红外光谱仪 ( f t i r ) 美国 u n i t y p l u s - 4 0 0 型 超导n m r 谱仪 美国v a r i a n 公司 元素分析仪美国 l c - 4 a型高效液相色谱仪日 本岛津日 本岛津 d u - 7 紫外分光光度计美国b e c k m a n 二 实验方法 ( 一)f 2 1 中抗氧化活性成分的分离纯化 1 . c m- 3 2 阳离子交换纤维素柱层析 样品的制备 将f 2 1 粗品约5 0 m g 溶解于2 m l 醋酸按缓冲液 ( l o m m,p h 4 . 5 )中，离心弃 去不溶物，待上样。 2 . 层析 将制备好 的样 品上样于预先用初始缓 冲液一一 醋酸按缓冲液 ( 1 o m m ,p h 4 .5 ) 平衡的 c m - 3 2阳离子交换纤维素层析柱 2 . 5 x 3 5 c m ) ， 然后 用以 下缓冲液依次进行阶段洗脱， 1 ) 2 5 0 m l 醋酸钱缓冲液 ( 1 o m m ,p h 4 .5 ) ; 2 ) 2 5 0 m l 醋酸 钱缓 冲液( 2 0 0 m m ,p h 4 . 5 ) ; 3 ) 2 5 0 m l 醋酸 钱缓冲 液( 4 0 0 m m , p h 8 .0 ) . 流速 2 .5 m u 3 m i n ，以 2 .5 m u 管进行自 动分步收集。测定各管超氧阴离子清除活 性6 4 1 ， 绘制活性洗脱曲 线。同时，以 硫酸一 蕙酮法(6 5 测定各管糖含量 ( 测戊: 。 ) ， 并测定a 2 9 0 。 最后，分别合并各活性峰， 冷冻干燥，以 备后用。 1 1 . s e p h a d e x g - 7 5 分子 筛 凝 胶 过 滤 柱 层 析 1 .标准洗脱曲线的制作 南开大学硕士研究生论文 材料与方法 将四 种凝胶过滤分子量 m a r k e r 表1 ) 各 1 0 m g溶解于 l m l 磷酸盐缓冲液 ( 5 0 m m , p h 7 .0 ) ，小心地上样于以磷酸盐缓冲液 ( 5 0 m m ,p h 7 . 0 )的平衡的 s e p h a d e x g - 7 5 凝胶过滤层析柱 ( 2 . 5 x 1 0 0 c m ) ，然后以 相同的 缓冲液进行洗脱， 流速 4 m ll l o m in , 4 m u 管进行自 动分步收集。测定每管在2 8 0 n m处的光吸收值， 绘制标准洗脱图谱。并且以分子量的对数值为横坐标，d e x t r a n b l u e 2 0 0 0的洗 脱体积为外水体积 ( v , ) ， 各物质洗脱体积v - v o 为纵坐标， 绘制标准洗脱曲 线。 表 ，凝胶过涟分子量m a r k e r 分子量 ud ) 蓝色葡聚糖2 0 0 0 ( d e x t r a n b l u e 2 0 0 0 ) 2 , 0 0 0 , 0 0 0 牛血清白蛋白 ( b o v i n e s e r u m a l b u m i n ) 6 7 ,0 0 0 鸡卵清蛋白 ( a lb u m i n c h i c k e n ) 4 3 ,0 0 0 细 胞 色 素c ( c y to c h ro m e c ) 1 2 , 3 8 4 2 . 样品的s e p h a d e x g - 7 5分子筛凝胶过滤柱层析 将经过 c m 3 2 一 纤维素阳离子交换柱层析分离得到的活性物质进一步上样于 s e p h a d e x g - 7 5分子筛凝胶过滤层析柱， 并以 与标准品相同的条件进行洗脱， 收集。将活性峰冷冻干燥。利用标准曲线计算样品分子量。经此步，既可对活 性成分进行进一步的纯化，又可根据洗脱体积对活性物质分子量进行初步估算。 ( 二)f 2 1 中抗氧化活性成分的鉴定 1 .蕙酮比 色定糖法 蕙酮比色法6 5 ， 是一个快速而方便的定糖方法。糖在浓硫酸作用下生成糖醛， 蕙酮可以和糖醛起反应，反应后溶液呈蓝绿色，于 6 2 0 m n处有最大吸收，在 1 0 - 1 0 0 p g 范 围内 其 颜 色的 深 浅 与 糖的 含量 呈 正比 关 系。 1 .标准曲线的制作 ( 1 ) 取l 0 0 k g l m l 的葡萄糖溶液0 , 0 .0 5 , 0 . 1 0 , 0 .2 0 , 0 .3 0 , 0 .4 0 , 0 .6 0 , 0 . 8 0 , 1 . 0 0 m l ， 用蒸馏水补足到1 . 0 0 m ，以 上每种浓度各做一份重复; ( 2 )再加入4 .0 0 m 1 2 叭 的葱酮试剂 ( 溶于9 8 % 浓硫酸) ， 摇匀， 迅速浸于 冰水中冷却: 南开大学硕士研究生论文材料与方法 ( 3 )待几支试管均加完后，一起浸入沸水浴中，自 重新沸腾起记时，准确 煮沸1 0 m i n a ( 4 )反应完毕，以 流动水冷却。 于室温平衡片刻 ( 约 l o m i n ) 后， 于6 2 0 n m 测定吸光 值。以 糖浓度为 横坐标， o d s , 。 为纵坐标， 制作标准曲 线。 2 .样品含糖量的测定 取 l m l 待测样品溶液，加入 4 m l 蕙酮试剂，迅速浸于冰水中冷却。冷却后 置于沸水浴中，煮沸 l o m i n 。取出用自来水冷却后比色。其它条件与测标准曲 线相同。 1 1 . 蛋白 质的定量测定 l o w ry法166 1 . 福林一 酚试剂的显色原理包括两步反应:第一步是在碱性条件下，蛋白质与 铜作用生成蛋白质一 铜复合物;第二步是蛋白质一 铜复合物还原磷铝酸一 磷钨酸试 剂，生成蓝色物质。在一定条件下，蓝色强度与蛋白质量成正比例。 1 .标准曲线的制作 ( 1 ) 取2 5 0 u g / m 1 的b s a溶液0 , 0 . 1 0 , 0 . 2 0 , 0 .4 0 , 0 . 6 0 , 0 .8 0 , 1 . o o m l , 用蒸馏水补足到1 .0 0 m l ，以上每种浓度各做一份重复; ( 2 )加入5 m l f o l i n - 酚试剂甲，混匀，室温放置 l o m i n ; ( 3 )再加入0 . 5 m 1 f o l i n - 酚试剂乙，立即混匀，3 0 保温3 0 m i n ; ( 4 ) 于5 0 0 n m测定 吸 光 值。以 蛋白 质 浓度为 横坐标， o d s , 。 为 纵坐 标， 制 作标准曲线。 2 .样品蛋白 质含量的测定 取i m l 待测样品溶液 ( 适当 稀释至约含2 5 - 2 5 0 g 蛋白 质) ， 其它操作与“ 标 准曲线的制作”相同。 在有干扰物质存在下的改良 测定法16 7 1 飞 .标准曲线的制作 ( 1 ) 取2 5 0 u g / m l 的b s a溶液 用蒸馏水补足到3 .o o m l , 0 , 0 . 1 0 , 0 . 2 0 , 0 . 4 0 , 0 . 6 0 , 0 . 8 0 , 1 . 0 0 ml , 以上每种浓度各做一份重复; ( 2 )加入2 5 02 % 脱氧胆酸钠溶液，剧烈馄合，放置1 5 m i n ; 南开人学f ly ; 士研究生论文材料 与方法 ( 3 ) 加入 i m l 2 4 % 三氯乙 酸 t c a ) 溶液混匀后， 3 , 5 0 0 r p m离心3 0 m i n , 蛋白质坚实地沉淀在管底，小心倾去上清 ( 上清在管中的残留量应小 于5 0 p 1 ) ; ( 4 )加入 5 m l f o l i n - 酚试剂甲，馄匀，室温放置 i o m i n ; ( 5 )再加入0 .5 m 1 f o l i n - 酚试剂乙，立即混匀，3 0 保温3 0 m i n ; ( 6 )于5 0 0 n m测定吸光值。以 蛋白 质浓度为横坐标， o d , . 为纵坐标，制 作标准曲线。 2 .样品蛋白质含量的测定 取3 m l 待测样品溶液 适当 稀释至约含2 5 - 2 5 0 4 g 蛋白 质) ， 其它操作与“ 标 准曲线的制作”相同。 注: f o l i n - 酚试剂甲:由下述四种溶液配置的。( 1 ) 4 % 碳酸钠溶液;( 2 ) 0 .2 n 氢氧化钠溶液;( 2 ) 1 % 硫酸铜 ( c u 5 q- 5 1 -1 2 0 ) 溶液; ( 4 ) 2 % 酒石酸钾钠溶液。 在使用前，将 ( i) 与 ( 2 )等体积混合配成碳酸钠一 氢氧化钠溶液，将 3 )与 ( 4 )等体积混合配成硫酸铜一 酒石酸钾钠溶液。然后，将这两种溶液按 5 0 : 1的 比例混合，既为f o l i n - 酚试剂甲。该试剂只能用一天，过期失效。 f o l i n - 酚试剂乙: 在2 升的 磨口 回 流装置内 加入钨酸钠 ( n a 2 wo , 2 h , 0 ) 1 0 0 克， 铝酸 钠 ( n a 2 w0 4 . 2 1i 2 o ) 2 5 克， 蒸 馏 水7 0 0 毫 升， 8 5 % 磷 酸5 0 毫 升 和浓 硫酸 1 0 0 毫升，充分混合后，以 小火回流1 0 小时。再加入硫酸铿 ( l i s 0 , ) 1 5 0 克，蒸馏水 5 0毫升及数滴液体澳。然后，开口继续沸腾 1 5分钟，以驱除过量 的澳。冷却后定容到1 0 0 0 毫升，过滤，滤液成绿色。 用 f o l i n - 酚试剂乙滴定标准氢氧化钠溶液 ( i n左右) ，以标定 f o l i n - 酚试剂 乙的酸度，以酚酞为指示剂。当溶液颜色由红色变为紫红、紫灰、再突然转变 成墨绿时，既为终点。该试剂酸度一般为 2 n左右，此为贮存液，使用前，稀 释为 i n的酸，此为f o l i n - 酚试剂乙应用液。 以上两液均应装于棕色瓶内，置于冰箱中，可以长期保存。 i i i . 高效液相色谱测定 ( h p l c ) 使用岛津 l c - a 4 h p l c仪，采用 硅烷 ( c 1 8 ，简称 o d 5 ) ，流动相为 ( 0 . 0 2 5 m, p h 6 . 5 ) ，样品进样量4 0 8 1 c ,: 反 相液一 液色谱法，固定相为十八 烷基 6 0 % 甲 醇- 4 0 % n a 2 h p 0 ; - k h