（微生物学专业论文）白腐真菌phanerochaete+chrysosporium降解24二氯酚的研究.pdf

摘要 目前对氯酚类污染物的处理方法还存在许多缺陷：物理化学方法 存在花费高，对低浓度污染物处理效率低，容易造成二次污染的缺点； 传统的生物方法也存在降解不彻底，对高浓度污染物敏感的问题。而 现在逐渐受到关注的白腐真菌生物技术则可以避免两者的缺陷，能够 相对简单有效的降解氯酚甚至多种持久性有机污染物，因此，研究白 腐真菌生物技术，发展新型氯酚类污染物处理体系是十分必要的。 本文利用白腐真菌典型菌种黄孢原毛平革菌降解水溶液中的 2 ，4 二氯酚。通过对不同培养方式的考察，确定采用固定化技术与摇 床培养相结合的培养方式。分析接种量、p h 值、摇床转数和温度四 因素的影响，优化白腐真菌产酶能力。最后以最优化培养方式测量了 生物降解条件下的2 ，4 d c p 的降解效果。确定2 ，4 d c p 初始浓度、表 面活性剂和金属阳离子对白腐真菌降解效果的影响。 实验结果表明，在白腐真菌产酶体系中，接种量为1 0m l 固定化 凝胶小珠( 孢子浓度为l x l 0 5 个孢子m l ) ，p h 值为4 5 ，摇床转数为 1 8 0r m i n ，温度3 8 时，固定化白腐真菌l i p 和m n p 酶活分别达到 5 6 3u l 和8 4 1u l 。在最佳产酶环境下，白腐真菌生物降解2 ，4 d c p 的效果受到2 ，4 d c p 初始浓度、表面活性剂和不同浓度金属阳离子的 影响。2 ，4 一d c p 初始浓度为2 0m g l 时，白腐真菌对2 , 4 - d c p 的降解 效率最高，而4 0m g l2 , 4 d c p 的降解效果最好。t w e e n 一8 0 能够保护 i 白腐真菌的生长和产酶，表现出降解效果的上升，1 质量浓度的 t w e e n 8 0 能最大的促进2 , 4 d c p 降解效果。金属阳离子m 9 2 + 不影响 降解，c a 2 + 在生长前期对降解效果作用不明显，但在后期对降解有促 进作用。f e 2 + 和高浓度的c u 2 + 对降解效果有抑制作用，m n 2 + 和低浓 度的c u 2 + 能促进降解。 关键词：白腐真菌固定化生物降解2 ，4 二氯酚 a b s t r a c t i no r d e rt or e m o v et h ec p s p o l l u t i o ns o i lo rw a s t e w a t e r , w ea d o p t s e v e r a lt e c h n i q u e st ob i o r e m e d yt h e e n v i r o n m e n t c o m p a r e dw i t h t h e w h i t er o tf u n g it e c h n o l o g y , t h et r a d i t i o n a lp h y s i c a la n dc h e m i c a lm e t h o d a r em o r ee x p e n s i v e ，i n e f f i c i e n c ya n do f t e nc a u s es e c o n d a r yp o l l u t i o n s i m i l a r l y , s o m eb i o l o g i c a l m e t h o d sa r ei n t o l e r a b l e t ot h e h i g h c o n c e n t r a t i o np o l l u t i o na n dc a nn o tb i o d e g r a d ep o l l u t i o n s c o m p l e t e l y h o w e v e r ，t h ew h i t er o tf u n g it e c h n o l o g y , w h i c ha t t r a c t e dm o r ea n dm o r e a t t e n t i o n s ，c o u l da v o i dt h e s el i m i t a t i o ne a s i l y t h u s ，i ti sn e c e s s a r yt o d e v e l o pan e wt e c h n o l o g yt od e a lw i t hc p s c o n t a m i n a t i o na n dr e s e a r c h t h ew h i t er o tf u n g u s b i o d e g r a d em e c h a n i s m i nt h i sa r t i c l e ，t h e b i o d e g r a d i n ge f f e c t o f2 , 4 - d c pf r o ma q u e o u s s o l u t i o nb yp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u mw a ss t u d i e d w ee s t a b l i s h e dt h e m a i no p t i m u mc o n d i t i o n so ft h ee n z y m e sa c t i v i t yo fl i pa n dm n po nt h e p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m ，s u c ha si m m o b i l i z e ds p o r e d o s e ，p h ， r o t a t i n gs p e e da n dt e m p e r a t u r e t h ec p s p o l l u t i o nw a t e rw a st r e a t ea tt h e o p t i m u m c o n d i t i o n sb yu s i n gi m m o b i l i z e dp h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m t h ef a c t o r so fi n i t i a l2 , 4 一d c pc o n c e n t r a t i o n ，s u r f a c t a n tc o n c e n t r a t i o na n d t h em e t a lc a t i o nw e r e i n v e s t i g a t e dt h r o u g l y h 1 t h er e s u l t ss h o w e dc l e a r l yt h a tt h es t a b i l i t yo fe n z y m ep r o d u c t i o na n d a c t i v i t yw e r e r e m a r k a b l ei m p r o v e da f t e ri m m o b i l i z a t i o no ft h ef r e e p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m a f t e ri n o c u l a t e di m m o b i l i z e ds p o r ed o s e 1 0m l ( s p o r ed o s el x l 0 5s p o r e m l ) ，p h4 5 ，r o t a t i n gs p e e d1 8 0r m i n ， t e m p e r a t u r e3 8 ，t h ea c t i v i t yo fl i pa n dm n pe n z y m er e a c h e dt o5 6 3 u la n d8 4 1u l i nt h ee x i s t e n c eo f2 0 m g l2 , 4 一d c p , t h eb i o d e g r a d i n g e f f i e n c yc o u l dr e a c ht o5 5 a f t e r1 2d 1 w vs u r f a c t a n tt w e e n - 8 0h a d b e e ns h o w e dt oe n h a n c et h eb i o r e m e d i a t i o na b i l i t y t h eb i o d e g r a d i n g n a c t i v i t yi s a l s oi n h i b i t e db yf e 2 + a n d1 0 m g lc u “，m n 2 + a n dl m g l c u “c a ni m p r o v et h er e m o v a le f f i c e n c yo f2 ，4 一d c e k e y w o r d ：p h a n e r o c h a e t e c h r y s o s p o r i u m ； i m m o b i l i z a t i o n ； b i o d e g r a d a t i o n ；2 , 4 一d c p i v 湖南师范大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下， 独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外， 本论文不含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对 本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标 明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。 学位论文作者签名：刀御彩年莎月岁日 湖南师范大学学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定， 研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属湖南师范大 学。同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电 子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权湖南师范大学可以将本学 位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、 缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。 本学位论文属于 1 、保密口，在年解密后适用本授权书。 2 、不保密瓯 ( 请在以上相应方框内打“v ”) 作者签名：力啪 日期：朋富年6 月多日 导师签名：研 够 日期：易缉舌月笋日“ 6 0 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 第一章引言 进入2 0 世纪以来，随着人口的飞速增长和工业的快速发展，环 境污染逐渐成为一个世界性的问题。排放到自然环境中的废水、废气 和废渣无时无刻不在危害着周围的生态系统，许多重金属和有机污染 物甚至严重威胁到人民的生产生活安全，对于环境污染修复的研究与 应用也随之受到社会各界的重视。在为数众多的环境污染物中，持久 性有机污染物( p e r s i s t e n to r g a n i cp o l l u t a n t s ，简称p o p s ) 的治理一直都 是重中之重。p o p s 即具有毒性、生物蓄积性和半挥发性，能在环境中 持久存在的人工合成有机污染物质【。由于持久性有机污染物化学结 构都十分稳定，对微生物具有毒性，同时大规模进入自然环境的时间 不长，大多数微生物还不具有对p o p s 的降解能力，能够利用p o p s 的微生物种类不多，这给其治理过程带来很大麻烦。受到p o p s 污染 的主要是水系统和土壤，被污染的水资源和土地的使用受到极大限 制，对我们的生活和经济发展造成严重影响。石油、化工、造纸等工 业废水中就含有大量持久性有机污染物，它们通过流动和蒸发作用扩 散到江河湖海，甚至在南极的冰中都可以检测到d d t 残留，水系统 中p o p s 污染的治理重要性不言而喻。而氯酚类化合物及其衍生物一 直都是引起水污染的一大类持久性有机污染物【2 1 。 1 1 氯酚类化合物污染 1 1 1 氯酚类化合物的来源 硕士学位论文 氯酚类化合物( c h l o r o p h e n o l s ，c p s ) 被广泛应用于造纸、农药、 医药、防腐剂等工业中【3 】o 其中2 , 4 二氯酚主要用于制造杀菌剂、农 药除草醚( 2 , 4 d ) 及防蛀、防腐和种子消毒剂，同时作为医药硫双 二氯酚的中间体【4 】o 而作为污染物出现的氯酚类化合物则主要来源于 上述工业的废水如纸浆漂白废水，木材防腐剂以及有机氯农药分解物 【5 】；较低一级的氯酚类化合物可由较高的氯酚类化合物分解产生，如 五氯酚就可以分解为四氯酚、三氯酚和二氯酚【6 】；另外含氯有机物的 燃烧也会产生c p s ，例如焚烧城市或工业垃圾常常会伴有c p s 的产生。 通过中国科学院生态环境研究中心的实地监测，中国各大水系均可检 测到c p s 残留，c p s 主要出现在工业或农业比较发达的地区，主要是 沿海地区和农业大省。其中2 , 4 二氯酚含量较高地区主要为沿海， 2 ，4 ，6 三氯酚含量较高地区是黄河流域及东北三省，五氯酚含量较高 地区则是江浙地区、淮河流域及珠江三角洲网。这些地区人口密集， 经济发达，因此氯酚类化合物污染的状况必须得到严格控制和治理。 1 1 2 氯酚类化合物的性质和危害 氯酚类化合物由于其苯环结构的存在而比较稳定，其苯环上的氯 离子对氯酚类化合物的毒性起主要作用 8 1 。从单氯酚到五氯酚，随着 苯环上的氯离子的增加，c p s 的毒性上升。2 ，4 ，6 三氯酚( 2 ，4 ，6 t c p ) 对绿藻的半数致死浓度( e c 5 0 ) 约为3 0m g l ，而五氯酚( p c p ) 的e c 5 0 值仅为3 8m g l t 9 】；稳定性也与氯离子数成正相关性，主要原因在于 氯离子带的负电使苯环形成一个难以被氧化的疏电子环，氯离子越 多，氯酚越难被氧化。正是c p s 强毒性和高稳定性的特点使c p s 难 自腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 以被微生物分解利用，成为持久性有机污染物。另外c p s 溶解度随氯 离子增多呈下降趋势，2 一氯酚( 2 c p ) 的溶解度为2 8 5 x 1 0 4m g l ，2 , 4 二氯酚( 2 ，4 一d c p ) 的溶解度为4 5 x 1 0 3m g l ，p c p 仅微溶于水。 氯酚类化合物对动植物和微生物都具有很强的毒性，而且具有生 物富集作用。水体中的藻类对氯酚类化合物十分敏感，若水质被c p s 污染，藻类的生长将受到抑制；五氯酚是氧化磷酸化过程的强抑制剂， 它和许多氯酚类化合物的中间代谢产物都会影响生物的生长；氯酚类 化合物同时具有“致癌、致畸、致突变 的三致效应，在燃烧过程中， 氯酚类化合物将会产生二恶英【1 0 1 ，而该物质被认为是世界上致癌性最 强的污染物之一。因此，氯酚类化合物污染受到全世界的关注，美国 环保署e p a ，欧盟都将氯酚列入优先污染物名单之中【1 1 】，我国也将 2 ，4 二氯酚、2 , 4 ，6 三氯酚和五氯酚列入6 8 种优先污染物名单【1 2 1 。在 中华人民共和国污水综合排放标准( g b8 9 7 8 1 9 9 6 ) 中明确规定， 2 ，4 d c p 和2 , 4 ，6 t c p 的最高允许排放浓度一级标准为0 6m g l ，二 级标准为0 6m g l ，三级标准为1 0m g l t l 3 1 。对c p s 污染的控制和治 理势在必行。 1 2 治理氯酚类化合物污染的方法 在了解c p s 污染的危害以后，人们意识到必须尽快对c p s 污染 进行控制和治理。科学界和工业界研究开发了许多c p s 污染治理技 术，我们可以把它们分为物化治理技术和生物修复技术两大类。 1 2 1 物理和化学方法治理氯酚类化合物污染 采用物理和化学方法来治理氯酚类化合物污染，就是利用氯酚类 硕十学位论文 化合物的物理化学特性，达到去除或分解c p s 的目的。这些方法主要 包括物理吸附法，电动力学法，f e n t o n s 试剂法和纳米催化技术。 1 2 1 1 物理吸附法 物理吸附法的实质就是使用的吸附剂表面的活性部位与氯酚类化 合物连接，使氯酚类化合物吸附到物理吸附剂的表面。由此可知，物 理吸附剂要求表面积大，活性位点多，吸附能力强，符合要求的物理 吸附剂包括活性炭、硅藻土和腐殖酸树脂等，其中最简便和应用最广 泛的是活性炭【1 4 】。物理吸附法的优点在于操作简单，见效快，无需仪 器；缺点就是实际应用中吸附剂很难进行特异性吸附，导致回收困难， 另外并没有改变污染物的化学特性，危害并没有得到根治。 1 2 1 2 电动力学法 电动力学法主要用于治理受c p s 污染的土壤及地下水，电动力学 法对土壤施加一个直流电场，通过电渗析和电泳作用将污染物带动到 电极的附近分离【1 5 】。电动力学法原来主要用于从低渗透性土壤中去除 离子性污染物( 如重金属离子) ，但近年来也逐渐应用于土壤有机物污 染的治理。电动力学法的优点在于处理过程简单，可以进行原位修复 而不破坏环境。缺点则是能源消耗大，容易使被修复场址固化和酸化， 容易产生电极极化现象【1 6 】。 1 2 1 3f e n t o n s 试剂法 在p h 在2 , - - 5 的酸性环境下，若溶液中共同存在f e 2 + 和h 2 0 2 ，则 反应体系具有强氧化性，这个反应就叫做f e n t o n s 反应。f e n t o n s 反 应的原理在于在酸性条件下h 2 0 2 在f e 2 + 催化作用下能产生具有高反 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 应活性的羟自由基( o n ) ，o h 氧化有机物使其分解。f e n t o n s 试剂法 的强氧化性可应用于氧化水溶液中的持久性有机污染物，因此被广泛 用于各种难降解有机废水【1 7 1 。f e n t o n s 试剂法操作简单，反应迅速， 对环境友好；但只能应用于酸性环境中，许多中性、碱性废水需要投 入大量酸反应才能进行；同时氧化污染物有时也会造成二次污染【1 8 1 。 1 2 1 4 纳米催化技术 纳米催化技术主要是使用纳米t i 0 2 等纳米材料作为催化剂，在紫 外光或日光的条件下对氯酚类废水进行降解。原理是在紫外线的照射 下，溶液中的纳米t i 0 2 材料表面产生羟自由基( o i l ) ，o h 氧化氯酚 产生分解。纳米t i 0 2 催化技术的优点是：降解速度快，一般只需要几 十分钟到几个小时即可取得良好的废水处理效果【1 9 】；降解范围广，有 机污染物都能降解；反应简单。但是，纳米材料催化氯酚后得到的分 解产物毒性并没有降低，没有做到真正的环境修复。 总而言之，物理和化学方法治理氯酚类化合物污染反应一般较快， 处理污染物的范围广，但都存在处理费用昂贵，仪器材料要求高，常 造成二次污染的缺点，同时对低浓度的有机污染废水处理效率很低。 而氯酚类化合物在水溶液中的溶解度不高，对生物具有强毒性，上述 几种物理和化学方法对低浓度氯酚废水的实际处理效果不佳。因此， 越来越多的研究集中到生物修复技术上，希望通过生物方法找到去除 氯酚污染的最佳途径。 1 2 2 生物修复技术处理氯酚类化合物污染 生物修复技术通常是利用生物自身特性和对污染物的降解能力 硕十学位论文 对氯酚类污染进行治理。这些方法包括：生物吸附法，生物降解法， 固定化技术降解法。 1 2 2 1 生物吸附法 生物吸附法是指利用微生物和植物从环境中富集氯酚类污染物的 方法。我们根据生物吸附剂的不同，又可以将生物吸附法分为植物吸 附和微生物吸附两大类。利用植物的富集作用吸附有机污染物主要是 利用植物的根吸收土壤中的污染物，使污染物进入植物体内。 j a c q u e l i n emt r o n t 等人利用水生植物浮萍吸附水中的2 ，4 d c p ，6 5g 浮萍加入至l j 4 0 0m l 浓度为1 2 0 m 的2 ，4 一d c p 废水中，2 4h 后浮萍内 2 ，4 d c p 的含量达至1 j 7 2 9 ，在4 8 h 后2 ，4 一d c p 的含量达至i j 9 3 7 1 2 0 。 微生物吸附所用的吸附剂则是微生物菌体，通过菌体表面的各种功能 基团和化学成分对污染物的亲和作用吸附氯酚到微生物上，从而达到 去除氯酚污染的目的。微生物菌体细胞膜、细胞壁和荚膜结构都会影 响到有关污染物的吸附效果。生物吸附法处理废水具有诸多优点：吸 附剂来源广，许多微生物和植物生物量都可以作为吸附剂使用，以菌 丝体形式存在的微生物生物量大，使用回收都很方便，是吸附剂的重 要来源；成本低廉，许多发酵工业的废菌体就满足条件；可直接采用 污染环境中的植物和微生物，对环境友好；无需仪器和化学试剂，二 次污染比物理化学方法小。它的缺点在于吸附污染物能力较弱，吸附 剂回收困难，同时对污染物只能起到移除的作用，对减少氯酚类污染 的毒性没有帮助。 1 2 2 2 生物降解法 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一- 二氯酚的研究 生物降解法是指利用生物的新陈代谢作用，分解和利用污染物的 过程。生物降解有机污染物的能力一方面受需要降解的有机物的化学 结构影响，有机物结构越稳定降解越难，在氯酚类化合物的修复过程 中，能够利用并降解五氯酚的微生物最少，单氯酚的降解微生物最多； 另一方面与微生物自身特性有关，特异性降解微生物的降解能力显著 高于普通微生物，经过驯化后的微生物降解能力也比天然微生物高。 因此，目前生物降解氯酚的研究主要集中于单氯酚及二氯酚【2 ，所采 用的微生物通常是特异性降解微生物和驯化微生物【2 2 1 。生物降解法修 复氯酚类污染的方法通常利用活性污泥池【2 3 】和生物反应器【2 4 】作为反 应环境。活性污泥法是指由大量微生物和原生生物聚集形成的活性污 泥对污水的生物处理过程。其原理是通过充分的供氧，使微生物大量 繁殖产生菌胶团形成凝絮物对氯酚类物质吸附后，在多种微生物的共 同作用下分解污染物，使污水得到净化和解毒。活性污泥法的特点在 于应用范围广，各种污染物都能同时降解，工艺成熟；处理量大，适 应大批量的氯酚类废水的处理。缺点在于活性污泥中的微生物对氯酚 类污染物的降解无特异性，因此能够降解的氯酚类污染物浓度不高， 全向春等人利用活性污泥法处理单氯酚和二氯酚，在4 m c p 和 2 ，4 - d c p 同时存在时，完全降解仅需要1 2 - - 一1 4 d x 时，但4 m c p 的浓度 不超过3 0m g l ，2 ，4 - d c p r 曼度只有1 0m g l 【2 5 1 。另外有氯酚类污染存 在的条件下，活性污泥的生长受到明显限制，对总污染的降解能力下 降。生物反应器的降解方式分为好氧和厌氧两种，与活性污泥法不同， 生物反应器内培养的微生物通常是较单一的特异性驯化微生物，优 硕十学位论文 化生物反应器培养条件即可使氯酚的降解率大大提高【2 5 1 。生物反应器 法具有反应器种类繁多，反应方式灵活；反应参数容易优化，可到达 最优降解效果；降解效率高，对氯酚的解毒作用明显的特点。同时也 存在影响因素多，实际操作复杂的缺点。 1 2 2 3 固定化技术降解法 氯酚污染能够抑制微生物的生长甚至导致微生物死亡，因此人们 在利用微生物降解氯酚的过程中采取了多种方式保护微生物活性，其 中最有效的当属固定化方法【2 6 1 。另外，某些过氧化物酶也能氧化氯酚 类化合物导致其分解，为了避免酶的失活和重复利用，通常将酶做固 定化处理。所以固定化细胞和固定化酶技术成为氯酚污染物降解技术 的研究热点。 1 3 白腐真菌在环境修复中的作用 白腐真菌生物学研究是- - i - j 新兴起来的学科，从2 0 世纪7 0 年代初 开始，人们开始对白腐真菌降解木质素的现象加以研究，逐渐了解到 白腐真菌的基本生理特性。1 9 8 4 年t i e n 和飚r k 分离纯化出白腐真菌的 木质素过氧化物酶( 1 i g n i np e r o x i d a s e ，l i p ) 刚，从此白腐真菌研究 进入酶学阶段，同年k u w a h a r a 分离出锰过氧化物酶 ( m a n g a n e s e d e p e n d e n tp e r o x i d a s e ，m n p ) 1 2 8 1 ，以后陆续有新的酶被 发现。在1 9 8 5 年b u m p u s 矛i t i e n 在s c i e n c e 杂志上发表论文证明白腐真 菌能对d d t 、二恶英、六六六、氯代联二苯等高毒性的持久性有机污 染物进行降解和矿化【2 9 1 ，从此白腐真菌对持久性有机污染物的降解研 究进入飞速发展时期。到如今，白腐真菌生物学研究已经成为跨微生 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 物学、生态学、环境科学、酶工程、基因工程等学科的综合性学科。 1 3 1 白腐真菌生物学特征 白腐真菌( w h i t er o tf u n g i ，w r f ) 是一类可以利用、降解植物木 质素，引起木质白色腐烂的丝状真菌的总称。白腐真菌在植物木质部 生长时，其菌丝可以钻入木质细胞内，释放降解木质素的酶，将木质 素做为碳源分解，导致木质腐烂成白色的海绵状物体，这就是白腐真 菌名称的由来。白腐真菌对木质素的降解能力是木腐真菌中最强大 的，它可以将木质素彻底降解成为c 0 2 和h 2 0 。木质素在碳素循环中 占有重要地位，是地球上含量第二丰富的可再生资源，仅次于纤维素， 是高等植物的主要成分之一。由于木质素结构十分稳定，微生物很难 利用并降解，因此白腐真菌降解木质素的能力对于地球碳素循环非常 重要。 白腐真菌大部分属于担子菌，其研究的典型菌种黄孢原毛平革菌 p h a n e r o c h a e t e 如聊d 印d 一“m 就属于担子菌【3 0 1 。黄孢原毛平革菌具有 发达的菌丝体，菌丝常为多核，少有隔膜，培养成熟后产生大量无性 分生孢子。黄孢原毛平革菌的生长可分为初生生长和次生生长两个阶 段【3 1 1 ，在初生生长阶段，孢子萌发，菌丝体生长；次生生长时期生长 基本停止，只有在碳、氮营养限制的情况下才能触发白腐真菌的次生 代谢【3 2 】，黄孢原毛平革菌才开始分泌木质素降解酶系进入生物降解阶 段。影响白腐真菌次生代谢的因素有很多，碳、氮源的种类和碳氮比 的不同都会影响白腐真菌产酶效果。葡萄糖、甘油、纤维素都可以作 为白腐真菌的碳源使用，酒石酸氨则是最常用的氮源。黄孢原毛平革 硕十学位论文 菌生长适宜p h 值为5 5 ，但木质素降解酶系的最佳p h 值一般在4 5 左 右，所以白腐真菌降解污染物的最优化p h 值需要实际操作才能确定； 黄孢原毛平革菌的培养温度较高，一般在3 5 以上；环境中氧浓度与 白腐真菌降解活性呈正相关性【3 4 】；另外，培养方式的不同也会影响白 腐真菌的酶活0 5 1 。 1 3 2 白腐真菌木质素降解酶系 木质素降解酶系是白腐真菌独有的酶系统，在其他微生物中没有 发现它们的存在。白腐真菌主要依靠其分泌的木质素降解酶系对木质 素和众多持久性有机污染物的降解，在培养过程中酶的产量和酶活与 有机污染物降解能力直接相关。虽然木质素降解酶系降解污染物的机 制尚未形成系统的理论基础，但一般认为是酶系在共同作用于污染 物。随着白腐真菌木质素降解酶系酶活的上升，它对污染物的降解效 果和效率都会有明显改善。在所有关于白腐真菌生物修复的研究中， 研究者总是尽力提高白腐真菌木质素降解酶系的酶活。因此白腐真菌 的酶学研究一直是白腐真菌生物学的重中之重。木质素降解酶系主要 包括木质素过氧化物酶l i p 、锰过氧化物酶m n p 矛d 漆酶( 1 a c c a s e s ，l a c ) 【3 6 】 o 木质素过氧化物酶l i p 是最早发现的能降解木质素的酶，最开始是 从黄孢原毛平革菌中分离纯化的。大部分白腐真菌都有l i p 的存在【3 7 1 ， l i p 是一种含有糖基的血红蛋白，它有多种同工酶【3 剐。l i p 催化反应的 类型包括羟基化、脱甲氧基、脱甲基、c c 键断裂和氧化性脱氯等， 反应机制在于黄孢原毛平革菌产生的h 2 0 2 氧化l i p 形成酶中间体，酶 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 中间体与底物反应产生自由基最终将污染底物氧化分解 3 9 , 4 0 1 。l i p 的 产生和活性大小受到碳氮源的影响，只有在碳氮源营养限制的条件下 白腐真菌才能产生l i p ，c t a b 和叠氮化合物是l i p 的抑$ 1 j 齐l j l 4 1 1 ，而藜 芦醇( v e r a t r y la l c o h o l ，v a ) 可以提高l i p 的活性1 4 2 1 。 锰过氧化物酶m n p 存在于属于担子菌的白腐真菌中【4 3 1 ，反应体系 中必须要有m n 2 + 的存在白腐真菌才能表现出m n p 活性。m n p 同样也是 一种含有糖基的血红蛋白【删。m n p 主要催化酚类化合物，在对染料废 水的处理中对染料的脱色起主要作用。m n p 催化反应的类型包括酚类 的氧化、烷基苯基断裂、c 。c b 断裂、苯甲基甲醇的氧化等，反应机 制在于m n p 在h 2 0 2 的存在下将二价锰氧化为三价锰，在白腐真菌自身 产生的三价锰螯合剂作用下将酚类化合物氧化成对应的自由基实现 降解1 4 5 , 4 6 1 。m n p 的产生和活性大小同样受到碳氮源的影响；m n p 活性 表达必须有m n 2 + 存在【4 7 1 。巯基乙醇会抑$ i j m n p 的酶活【4 8 1 。 漆酶l a c 广泛存在于植物、细菌和真菌中，她在白腐真菌木质素降 解酶系中同样占有重要作用【4 9 】。不同的菌种的l a c 可能不同，而培养 方式不同也可能导致白腐真菌不产生l a c 。l a c 是一种细胞外的糖基氧 化酶【5 0 1 ，其活性部位含有c u 2 + 存在，因此反应体系中c u 2 + 能够提高l a c 的酶活。l a c 能够催化c c 键和c 0 键断裂，脱甲基化，对氯化有机物 的脱氯也是l a c 功能之一【5 1 ，5 2 1 。a b t s 会提高l a c 的酶活，h 2 0 2 是l a c 的抑制剂【5 3 ，5 4 1 。 1 3 3 白腐真菌生物降解有机污染物 降解木质素和其它异生物质的能力是白腐真菌越来越受到重视 硕十学位论文 的原因。白腐真菌生物降解能力一方面取决于环境污染物的理化性 质。它们的稳定性和毒性都会影响降解效果，同时污染物的化学结构 不同，在降解体系中起主要作用的酶也不同。例如白腐真菌对染料废 水脱色的能力主要取决于m n p 而不是l i p t 5 5 】；另一方面则取决于菌种 和培养方式的不同。在次生代谢条件下，大部分白腐真菌分泌m n p 和 l i p ；而c e r r e n am a x i m a 是m n p 高产菌种【5 6 1 ，r i g i d o p o r u sl i g n o s u s 只产 生m n p 和l a c 却没有l i p 分泌【5 7 1 ，p y c n o r u sc i n n i b a r i n u s 仅仅只分泌 l a c t 5 8 1 。另外，黄孢原毛平革菌在使用传统碳源培养时检测不到l a c 的存在，但在利用1 0g l 的纤维素作为碳源的情况下可以检测到低活 性的l a c 。通过力n a c u s 0 4 的方法也可以诱导l a c 的产- 牛t 5 9 , 6 0 1 。通过这 些我们可以了解，白腐真菌对环境污染物的降解机制极为复杂，目前 关于其生物降解能力的研究还没有形成系统的理论体系，对白腐真菌 降解特定污染物的调控还很困难，这也是我们研究白腐真菌生物降解 有机污染物的意义所在。 白腐真菌生物降解的特点首先在于其降解物的广谱性，自腐真菌 木质素降解酶系对于其催化底物来说是非特异性的，这也是l i p 和 m n p 区别于其他过氧化物酶的独特之处。白腐真菌能够产生l i p 和 m n p 是长期进化的结果，l i p 和m n p 的天然降解底物木质素是一种结 构高度复杂的高聚物，它是由不同数量的苯基丙烷单体通过c c 键或 醚键随机联接而成，植物品种、年龄和木质部部位不同的木质素也有 不同【6 卜6 3 1 。可想而知，能够分解木质素的l i p 和m n p 必然具有降解多 种不同类型和复杂结构的有机物的能力。白腐真菌能有降解的对象包 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 括苯类、多氯联苯、多环芳烃、氯酚、硝基芳烃化合物、杀虫剂、除 草剂、染料、酚醛树脂、耵盯等难降解有机物【6 4 鲫，从某种意义上来 说，称白腐真菌为降解持久性有机污染物的“万能微生物”也不为过。 其次，白腐真菌降解有机污染物的能力是自然的新陈代谢过程。 在碳氮营养限制的条件下，白腐真菌进入次生代谢过程，产生的l i p 和m n p 分泌到细胞外，若生长环境中存在有机物，l i p 和m n p 就能将 其氧化分解。也就是说，污染物的存在与否和污染物的浓度与其降解 过程的开始无关。在实际生物修复过程中，许多微生物需要在污染物 的刺激下产生应激性反应，逐步驯化后才能达到理想的降解效果。这 样无疑增加了生物修复的时间和操作步骤。同时，在污染物浓度较低 的情况下，许多微生物应激性不强，降解效率很低，白腐真菌对低浓 度有机污染物的降解具有独特的优势。 第三，白腐真菌的生物降解属于细胞外降解过程。毒性污染物如 果进入细胞内会对细胞产生毒害作用，这对微生物自身生长和降解能 力都有很大影响。因此许多属于细胞内降解方式的微生物对污染物浓 度比较敏感，这无疑限制了微生物生物修复技术的应用。白腐真菌分 泌的孢外酶最大程度降低了污染物对菌体的危害，所以白腐真菌对毒 性物质的耐受性高。反应体系中的l i p 和m n p 还能降解环境中的微溶、 不溶污染物，提高了污染物的生物利用性。另外，白腐真菌次生代谢 时l i p 和m n p 存在于培养液内，分离其培养液可以直接利用于生物修 复过程中，这样既减少了污染物对白腐真菌生长的影响，有利白腐真 菌持续稳定的产酶，同时也减少了污泥的产生，降低二次污染。 硕十学位论文 第四，白腐真菌生物降解具有彻底性。许多微生物生物修复有机 污染物的机制或是改变污染物特定化学结构，将污染物分解为其它产 物；或是通过同化作用将污染物整合到体内。这样的降解方式对污染 物处理不彻底，在修复过程后检测修复环境通常会发现毒性、b o d 和c o d 没有发生质的改变。而白腐真菌降解酶系的降解非特异性和高 氧化还原电位使得它可以持续分解结构复杂的有机污染物，在理论上 白腐真菌能够将污染物完全分解为c 0 2 和h 2 0 。 1 3 4 白腐真菌生物技术的应用研究 白腐真菌对异生物质广谱的降解能力吸引了科学界和工业界对 其降解污染物的应用可行性进行研究。目前，白腐真菌研究最深入， 应用最广泛的领域当属白腐真菌废水处理。 1 3 4 1 白腐真菌废水处理 各种工业废水是造成环境污染的“黑手 之一，由于人类生产生活 的水的需求，以及水自身的流动性，水污染的危害比大气污染和土壤 污染给人们带来的更大。白腐真菌的胞外酶降解系统正好适合液体体 系。 造纸工业在制浆、脱色等工艺流程中都会产生大量的废水，由于 废水中含有大量的木质素衍生物，造纸废水成为白腐真菌废水处理的 首选降解物。l a c k n e r 等人【6 7 1 证明m n p 在高分子量的氯化木质素的脱 色中起主要作用。r o ybp 报道t r a m e t e sv e r s t c o l o ri 匕够将造纸废水中 的氯化有机物直接脱氯矿化f 6 8 1 。王双飞等人将黄孢原毛平革菌吸附在 煤渣表面处理造纸漂白废水，处理一个月后c o d 去除率为6 5 白腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 6 8 ，b o d 5 去除率为8 9 至9 2 6 9 。染料废水的脱色也是白腐真菌废 水处理的主要方向之一。l e v i n 等人【7 0 】发现c o r i o l u sv e r s i c o l o r 在p o l y r 4 7 8 、i n d i g oc a r m i n e 等染料的降解过程中表现良好，培养8 d 后的 c o r i o l u sv e r s i c o l o r 对7 5m g l 的p o l yr 一4 7 8 每小时降解率为3 0 而2 3 m g l 的i n d i g oc a r m i n e 每小时降解率达至u 9 8 。 1 3 4 2 白腐真菌土壤污染处理 白腐真菌对于土壤污染的修复内容也有很多，其主要处理的污染 物包括p c p 、p a h 、p c b 等土壤污染物。l a m a r 7 1 】等人利用黄孢原毛 平革菌对含有2 5 0 4 0 0 g 的p c p z i z 壤，6 5 周内，总, p c p 减少8 8 - - - - 9 1 。z h e n g 等) a , t 7 2 】发现在m n 2 + 和表面活性剂的存在下芘和苯并芘分 别氧化了8 3 7 和9 9 6 5 。r u i z a g u i l a r 等比较黄孢原毛平革菌、 t r a m e t e sv e r s i c o l o r 和l e n t i n u se d o d e s 对p c b 的降解效率，发现黄孢原 毛平革菌培养1 0d 后p c b 去除率为3 4 ，是三种白腐真菌里最高的。 1 3 4 3 白腐真菌在其他方面的应用 为了深入开发白腐真菌的降解能力，白腐真菌生物反应器的研究 与应用也越来越多。目前关于白腐真菌的反应器工程主要集中在生物 转盘反应器( r b c ) 、搅拌釜生物反应器( s t r ) 和序批式反应器( s b r ) 的研究上【7 3 7 5 1 ，它们的目的都是通过各种参数的优化使白腐真菌的 生长和产酶达到最优化效果。另外，白腐真菌能够利用其它微生物不 能利用的木质素等难降解物质，因此有人将稻谷壳，秸杆、花生壳等 农业废弃物通过堆肥的方法，接种白腐真菌进行腐化，既减少了农业 垃圾也能提供更多农肥，同时还能将污染物接入堆肥之中进行生物降 硕士学位论文 解 7 6 , 7 7 】。 1 4 本课题研究主要内容和意义 白腐真菌的研究还不到半个世纪，我国n 2 0 世纪9 0 年代才开始关 注这个领域，属于一门新兴学科，不断有新的白腐真菌、酶和降解污 染物被发现。由于白腐真菌自身生理特点和降解底物的广泛性，研究 和应用白腐真菌的问题还很多。目前白腐真菌的生物降解能力和机制 的研究还没有一个系统的理论支持，研究和应用都处于初级阶段，因 此对白腐真菌降解污染物的研究具有重要意义。氯酚类化合物在自然 环境中分布广泛，属于低浓度高毒性的难降解有机污染物，目前的研 究重点在p c p 的土壤污染治理上【7 8 1 ，对于水环境中的氯酚污染降解的 研究不多。2 ，4 d c p 的降解研究主要还是在物理化学方法，活性污泥 法和生物膜法上【7 9 8 2 1 。结合白腐真菌黄孢原毛平革菌研究水溶液中 2 ，4 d c p 降解效果的报道很少。本文利用黄孢原毛平革菌生物降解水 溶液中的2 ，4 d c p ，探讨了培养方式对游离态白腐真菌和固定化白腐 真菌生长产酶能力的不同，菌种接种量、p h 、温度、摇床转数对固 定化白腐真菌产酶影响；确定固定化白腐真菌产酶优化条件后，研 究了2 ，4 d c p 初始浓度、表面活性剂t w e e n 8 0 浓度和金属阳离子对固 定化白腐真菌对水溶液中的2 ，4 d c p 的降解效果的影响。为黄孢原毛 平革菌处理2 ，4 d c p 废水的进一步研究和应用打下一定基础。 自腐真菌p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r i u m 降解2 ，4 一二氯酚的研究 第二章实验材料和方法 2 1 实验材料 2 1 1 主要实验试剂 葡萄糖( 分析纯) ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 酒石酸铵( 分析纯) ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 琥珀酸钠( 分析纯) ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 海藻酸钠( 生化试剂) ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 琼脂粉( 生化试剂) 上海源聚生物科技有限公司 维生素b 1 ( 生化试剂) 天津市光复精细化工研究所 k h 2 p 0 4 ( 分析纯) ，湖南化学试剂总厂 m g s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) ，中国医药( 集团) 化学试剂公司 c a c l 2 ( 分析纯) ，长沙市延风化学试剂厂 m n s 0 4 ( 分析纯) ，天津市北方天原化学试剂厂 c u s 0 4 ( 分析纯) ，中国医药( 集团) 上海化学试剂公司 f e s 0 4 7 h 2 0 ( 分析纯) ，广东省化学试剂工程技术研究中心 h c l ( 分析纯) ，湖南师范大学化学试剂厂 n a o h ( 分析纯) ，