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含氟聚合物毛细管电色谱整体周定相的制备 摘要 内容摘要：毛细管电色谱是近年来发展起来的一种高效、快速的微分离分析 技术。毛细管电色谱整体柱由于具有制备简单、无需封口和固定相表面易于 改性等优点，越来越受到人们的关注。因此，制备新型毛细管电色谱整体柱 成为当前电色谱研究领域中十分重要的课题之一。然而，到目前为止这种关注 多集中在含有c h 键有机聚合物整体固定相方面，有关含氟聚合物毛细管电 色谱整体固定相的研究还未见报道。 本研究通过原位聚合的方法制备了两种新型的含氟聚合物整体柱，它们 都既含有c f 键和c h 键。一种是利用丙烯酸乙酯基全氟辛基磺酰胺 ( q g f 8 1 4 ) 、甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 和2 二甲基乙基胺甲基丙烯酸酯 ( d a m a ) 为单体，制备了毛细管电色谱整体固定相，这种整体柱表面有带 正电荷的铵基，可以产生由阴极到阳极的电渗流，实验考察了聚合物组成、 反应时间、反应温度等参数对整体柱孔结构，耐压性，通透性的影响，从而 确定了整体固定相的最佳制备条件；另外一种是利用三氟甲基丙烯酸( t f m a ) 和甲基丙烯酸丁酯( b m a ) 为单体，制备了毛细管电色谱整体固定相，由于 这种整体柱表面带有负电荷的羧基，可以产生由阳极到阴极的电渗流，实验 考察了聚合物组成、反应时间、反应温度等参数对整体固定相的影响，从而 初步确定了整体柱的最佳制备条件。 含氟整体固定相表面能低，可以减少非特异性吸附。另外，含氟聚合物 在很高的p h 值流动相中也不会溶解，适用的p h 值范围较宽，对某些有机化合 物，尤其是含氟化合物具有很高的选择性，有望在含氟药物及生物大分子分 析中发挥重要作用，对利用反相色谱快速分离疏水性大分子有机化合物具有 重要意义。 关键词：毛细管电色谱；含氟聚合物；整体固定相 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 a b s t r a c t c o n t e n t ： c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ( c e c ) i s a r e l a t i v e l y n e w m i c r o s e p a r a t i o nt e c h n i q u et h a t c o m b i n e st h e h i g he f f i c i e n c y o fc a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s a n dt h e h i g hs e l e c t i v i t y o f h i g h p e r f o r m a n c el i q u i d c h r o m a t o g r a p h y a c c o r d i n g l y , i th a sa t t r a c t e dm o r ea n dm o r ea t t e n t i o ni nr e c e n t y e a r s c u r r e n t l ym o n o l i t h i cc o l u m n s a r ec o n s i d e r e da st h em o s ts u i t a b l es t a t i o n a r y p h a s e sf o rc e c d u et ot h e i rs i m p l ep r e p a r a t i o np r o c e d u r e s ，u n i q u ep r o p e r t i e sa n d n on e e df o rf r i t s ，a n di th a sb e e nh i g h l i g h t e dt od e v e l o pn e wm o n o l i t h i cc o l u m n s i nt h er e s e a r c ho nc e c h o w e v e r , t h ev a s tm a j o r i t yo fp r e v i o u sr e p o r t so nc e c o n l yc o n c e r nt h ep r e p a r a t i o no fc o n t a i n i n gc - h b o n dm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e s p r e p a r a t i o no ft h ef l u o r i n e c o n t a i n i n gm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e sh a s n tb e e n r e p o r t e d i nt h i st h e s i s ，w ep r e p a r e dt w on e wt y p e so ff l u o r i n e - c o n t a i n i n gm o n o l i t h i c s t a t i o n a r yp h a s e sb yi n s i t up o l y m e r i z a t i o n ，a l lo ft h e mc o n t a i nc - f b o n da n dc - h b o n d o n eo fm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e sw a sp r e p a r e db yu s i n gt h em o n o m e r so f 2 - ( n e t h y l p e r f l u o r o o c t a n e s u l f o n a m i d o ) e t h y lm e t h a c r y l a t e ( q g - f 8 1 4 ) ，b u t y l m e t h a c r y l a t e ( b m a ) a n d2 - ( d i m e t h y l a m i n o ) e t h y lm e t h a c r y l a t e ( d a m a ) ，t h e p o s i t i v ec h a r g e da m i n eg r o u p so nt h es u r f a c eo ft h es t a t i o n a r yp h a s eg e n e r a t ea n e l e c t r o o s m a t i cf l o wf r o mc a t h o d et oa n o d e t h ee f f e c t so fp o l y m e r i z a t i o n c o n d i t i o n so nc o l u m n p e r f o r m a n c e sw e r ee x p e r i m e n t a l l ye x a m i n e d ，a n dt h e o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gt h ec o l u m n sw e r ee s t a b l i s h e d t h eo t h e ro f m o n o l i t h i cs t a t i o n a r y p h a s e sw a sp r e p a r e db yu s i n g t h em o n o m e r so fb u t y l m e t h a c r y l a t e ( b m a ) a n d2 - ( t r i f l u o r o m e t h y l ) 一a c r y l i ca c i d ( t f m a ) ，t h en e g a t i v e c h a r g e da c r y l i ca c i dg r o u p so nt h es u r f a c eo ft h es t a t i o n a r yp h a s e sg e n e r a t ea n e l e c t r o o s m a t i cf l o wf r o ma n o d et oc a t h o d e t h ee f f e c t so fp o l y m e r i z a t i o n c o n d i t i o n so nc o l u m np e r f o r m a n c e sw e r ee x p e r i m e n t a l l ye x a m i n e d ，a n dt h e o p t i m a lc o n d i t i o n sf o rp r e p a r i n gt h ec o l u m n sw e r ep r i m a r i l ye s t a b l i s h e d t h el o ws u r f a c ee n e r g yo ff l u o r i n e c o n t a i n i n gm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e s c a nr e d u c et h en o n s p e c i f l ca d s o r p t i o n i na d d i t i o n ，f l u o r o p o l y m e r sa r ei n s o l u b l ei n m o s tc o m m o ns o l v e n t sa n dc a nb eu s e di naw i d e rr a n g eo fp hv a l u e s t h e yh a v e 含氟聚合物毛细管电色谱整体i 叫定相的制各 h i g hs e l e c t i v i t yt os o m eo r g a n i cc o m p o u n d s ，e s p e c i a l l yt of l u o r i n e c o n t a i n i n g c o m p o u n d s ，a c c o r d i n g l yt h e s ef l u o r i n e c o n t a i n i n gm o n o l i t h i cs t a t i o n a r yp h a s e s n o to n l yh a v eg o o d p o t e n t i a l t ob e u s e df o rh i g h l ys e l e c t i v es e p a r a t i o n so f b i o m o l e c u l e sa n df l u o r i n e c o n t a i n i n gp h a r m a c e u t i c a l s ，b u ta l s ot h e ya r ei m p o r t a n t t o q u i c k l ys e p a r a t e h y d r o p h o b i cl a r g e m o l e c u l e s b yr e v e r s e d p h a s e c h r o m a t o g r a p h y k e y w o r d s ：c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ；f l u o r o p o l y m e r ；m o n o l i t h i cs t a t i o n a r y p h a s e s ； 含氟聚合物毛细管电色谱整体同定卡廿的制备 学位论文独创性声明 本人承诺：所呈交的学位论文是本人在导师指导下所取得的研究成果。 论文中除特别加以标注和致谢的地方外，不包含他人和其他机构已经撰写或 发表过的研究成果，其他同志的研究成果对本人的启示和所提供的帮助，均 已在论文中做了明确的声明并表示谢意。 学位论文作者签名： 毒 日期：2 0 0 8 岁 学位论文版权的使用授权书 本学位论文作者完全了解辽宁师范大学有关保留、使用学位论文的规定， 及学校有权保留并向国家有关部门或机构送交复印件或磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本文授权辽宁师范大学，可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库并进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。保密的学位论文在解密后使用本授权书。 学位论文作者签名：参电 5 7 指导教师签名： 日期：r 参箩鞠 2 口。雾主 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 第一章绪论弟一早珀t 匕 毛细管电色谱( c a p i l l a r ye l e c t r o c h r o m a t o g r a p h y ，c e c ) 是近年来发展十 分迅速的一种新型分离技术。它是通过色谱填料的填充、键合或涂覆到毛细 管内，制备成毛细管柱，以电渗流( e l e c t r o o s m o t i cf l o w ，e o f ) 作为流动相的 推动力，根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异和在电场中 迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术。c e c 可以看作是高效液 相色谱( h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ，h p l c ) 和毛细管电泳 ( c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 相结合的产物，因此c e c 具有h p l c 和c e 的双重 优点，它具有“三高一快”的特点( 即高柱效、高选择性、高分辨率、快速分 离) 。它一方面克服了c e 分离中性物质选择性差，另一方面大大提高了液相色 谱的分离效率，而且具有样品和试剂消耗量少等优点。因此，进入九十年代 以来，随着c e c 分离机理、柱制备技术、仪器设备的快速发展，c e c 受到越来 越广泛的关注，在此方面发表的文章每年呈指数增长，并在生物分析、环境 分析、药物分析、食品分析和法医鉴定等多个领域得到了广泛应用，其中电 色谱柱是整个毛细管电色谱系统的核心，本章将主要对毛细管电色谱的发展 简史以及整体固定相的研究现状等方面进行了综述。 1 1 毛细管电色谱的发展简史 毛细管电色谱的发展可以追溯到五十年代，m o u l d 币1 s y n g e 【l 2 】将电场应用 到薄层液相色谱中，利用电渗流分离了胶棉中的多糖成分。1 9 7 4 年， p r e t o r i o u s 3 】等人将电场引于l 毫米内径的玻璃填充柱中，首次证实了c e c 的可 行性。他们的研究表明，c e c 上的柱效明显高于h p l c ，显示以电渗流作为流 动相推动力进行分离的巨大优势，但由于当时石英毛细管尚未问世，该文章 未引起足够的关注。 1 9 8 1 年，j o r g e n s o n 衣l l u k a c s l 4 1 ，在1 7 0i l t m 内径的毛细管中填充了1 0p m 粒 径的o d s ，在电场作用下成功地分离了稠环芳烃，并获得柱效3 1 0 0 0 理论塔板 数每米。这篇文章被认为是毛细管电色谱发展史上具有里程碑意义的文献， 毛细管电色谱从此开始受到了人们的关注。19 8 2 年，t s u d a 等人【5 】在毛细管内 壁键合固定相，首次实现了开管毛细管电色谱( o t - c e c ) ，并对多环芳烃进行 了分离。随后，m a r t i n 等人【6 】对开管柱毛细管电色谱中的轴向扩散和峰展宽进 含氟聚合物毛细管电色谱整体同定相的制备 行了研究，从理论上证实了以电渗流作为流动相推动力的优越性。 1 9 8 4 年至1 9 8 8 年，k n o x 和g r a n t 【7 ，8 l 对毛细管电色谱的理论进行了研究。 不仅对以压力和电渗流作为流动相推动力的两个体系中的流型、区带展宽、 焦耳热效应进行了比较，还对毛细管电色谱中的双电层现象进行了系统的研 究，这些理论和实验都表明c e c 在柱效上明显优于h p l c 。 随着c e c 研究的全面开展和电色谱制备技术的进步，c e c 技术得到了长足 的发展。1 9 9 0 年，t s u d a 等人【9 1 发展了毛细管电色谱连续进样技术，利用柱系 统中同时存在的压力流和电渗流对柱内样品进行了富集和分离。1 9 9 1 年， v e r h e i j 等) k m 1 首次将c e c 和质谱( m s ) 联用起来。同年，k n o x 和g r a n t 1 l 】从理论 一讨论了填料粒径大小和流动相中电解质浓度与电渗流速度以及柱效间的关 系，对其发展的毛细管电色谱理论进行了完善。而p f e f f e 衍口y e u n g 【眩】利用毛细 管电色谱分离了电迁移行为十分接近的氨基萘磺酸类化合物，并与毛细管区 带电泳和高效液相色谱的分离结果进行了比较，显示出毛细管电色谱在分离 方面的巨大优势。l9 9 2 年，m a y e r 等k 1 3 】首次在毛细管电色谱开管柱上实现了 抗感染药物的对映体拆分。l i 等人【1 4 】于1 9 9 3 年利用0 【酸性糖蛋白作为固定相 在毛细管电色谱上分离手性化合物。1 9 9 4 年，s m i t h 和e v a n s l l 5 , 1 6 1 分别采用1 5 l a m 和3 “m 粒径的o d s 以及3 “m 的s c x 固定相进行了药物分离。r e b s c h e r 等人 d 7 首次提出毛细管电色谱填充柱中区带展宽因素的实验测量方法。而b a y e r 等 人【擂】利用高压液相色谱泵首次实现了毛细管电色谱的梯度洗脱，并用该技术 成功地分离了寡聚核苷酸。j a c o b s o n 等人【19 】也于同年制作了第一个毛细管电色 谱芯片。1 9 9 5 年，g u o 等人【2 0 】首次利用溶胶凝胶技术制备了开管毛细管电色 谱柱，分离了稠环芳烃。l o r d 等人【2 1 1 发展了毛细管电色谱与质谱的联用技术， 并将其应用于染料分析中。 1 9 9 5 年，y a h 等人【2 2 】使用填充9 0 o d s 和1 0 硅胶的1 5 0p m 内径毛细管 柱，通过激光诱导荧光检测分离了一系列多环芳烃，柱效高达4 0 0 0 0 理论塔板 数每米。s m i t h 等人【16 】用离子交换固定相分离酸性药物，取得了令人难以置信 的8 0 0 0 0 0 0 理论塔板数每米的柱效，展示了非常诱人的前景。同年，y a n 2 3 1 发 明了毛细管电色谱柱的电动填充技术，并获得了美国专利。1 9 9 6 年，y a n 等人 t 2 4 币u 用双电源实现了电压驱动下的流动相梯度洗脱，成功地分离了1 6 种多环 芳烃。 1 9 9 6 年，f u - m o t o 等人【2 5 】首次制备了硅胶基质毛细管整体柱。1 9 9 7 年， 2 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 h o r v f i t h 等人1 2 6 j 电色谱的电动力学进行了系统的研究，考察毛细管电色谱填充 柱中填充床和开管部分中不同的电渗流和电导。b a y e r - y - , - q a 【27 j 首次实现了c e c 与核磁共振联用。1 9 9 9 年，h o r v a t h 等人【2 8 】进一步发展了毛细管电色谱的动力 学理论，对毛细管电色谱和高效液相色谱中影响柱效的各种参数进行了比较。 p o p p e - 等人t 2 9 j 研究了大孔填料在毛细管电色谱填充柱中的性能和应用。 1 9 9 5 年以来，中国科学院大连化物所国家色谱研究分析中心一直开展毛 细管电色谱的研究工作f 3 m 3 2 】，是国内率先从事该领域研究工作的单位之一。 毛细管电色谱经历最近二十年的发展，其在理论、柱技术和应用等方面 有了很大的发展。目前已出现的大量毛细管电色谱的综述性文章、电色谱专 刊和商品化的毛细管电色谱仪( u n i m i c r ot e c h n o l o g i e s ，p l e a s a n t o n ，c a ，u s a ) 说 明毛细管电色谱仍是色谱研究的一个热点。随着这一技术的不断成熟和完善， 其必然在人们的生产和实践中发挥越来越重要的作用。 1 2 毛细管电色谱的柱制备技术 毛细管柱是电色谱分离分析的核心，毛细管柱的制备是毛细管电色谱的 关键。毛细管电色谱从固定相的方式来看，主要可分为开管柱、填充柱和整 体柱三类。另外，有关微流控芯片上毛细管电色谱分离模式的研究也有报导。 1 2 1 开管柱 毛细管电色谱开管柱( o t o c e c ) 是在毛细管管壁键合、涂覆固定相的一种 电色谱柱技术。最早的开管柱毛细管电色谱法是由t s u d a t 5 1 在1 9 8 2 年实现的， 他在3 0h m 内径的玻璃毛细管壁上键合上c 1 8 ，成功地对芳香烃类化合物进行 了分离，从而验证了开管柱毛细管电色谱的高分离效能。m a r t i n 等【6 1 则研究了 开管柱毛细管电色谱的轴向扩展及色谱峰展宽，从理论上证实了用电渗流推 动流动相的优越性。虽然开管柱电色谱具有柱效高的优点，但是因为内壁光 滑的毛细管柱的相比仅是填充柱的1 3 5 0 ，所以开管柱制备的关键是增大表面 积以制备相比大、柱容量高的色谱柱。在电色谱中使用的开管柱的主要制备 方法有涂覆、化学键合、交联和物理吸附等方法。 蚀刻是一种常用的增大毛细管柱内表而积的方法。由于石英毛细管的化 学惰性强、不易蚀刻，所以早期的开管柱毛细管都采用易于刻蚀的钠玻璃或 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 是硼玻璃【5 】，但是钠玻璃或硼玻璃毛细管柱比较脆、易断裂，因此没有得到推 广。 溶胶凝胶法( s 0 1 g e l ) 是近年来发展起来的一种较为流行的开管柱毛细管 电色谱柱的制备方法。其基本原理与键合多孔硅胶相似，但不需额外键合固 定相，从而简化了制备过程。该方法制备过程简单，同时也可以有效提高相 比。 除了以上的几种方法外，最近也有报导在毛细管管壁原位聚合上一多孔 聚合物以增大开管柱电色谱柱内表面积。h o r v , i t h 等在管壁上合成了含有c 1 2 的苯乙烯二乙烯基苯的多孔聚合物用于蛋白和肽的分离。r e g n i e r 等则在毛细 管的管壁原位聚合了含有天门冬氨酸的阳离子交换的多孔聚合物固定相，用 于蛋白质的分离。 开管柱避免了繁琐的颗粒填充过程，也免去了制备塞子的麻烦，具有柱 效高、不易产生气泡等优点，但其具有相比低、柱容量小以及检测灵敏度低 等缺点，因此目前开管柱发展缓慢。 1 2 2 填充柱 毛细管电色谱填充柱( p c e c ) ，就是在毛细管中填充色谱固定相的一种电 色谱模式。常用的填充方法有电动填充法【2 3 1 、拉伸法【7 1 和匀浆法【圳。其中， 匀浆法是最常用的方法。该方法操作简单、装填设备要求低，但是对于小粒 径的填料在填充过程中会受到压力的限制。该方法的关键是烧结塞子( f r i t ) ， 好的塞子要求有足够的机械强度，能够使色谱填料不会被冲出，同时又要保 持足够的通透性，使得流动相容易通过。 毛细管电色谱在其发展初期使用的填料均为液相色谱填料。种类繁多的 液相色谱填料给毛细管电色谱提供了多种固定相的选择空间。但是与液相色 谱所不同的是，色谱填料在电色谱中具有双重作用：不仅要作为色谱分离的 介质影响分离，而且还必须能产生足够大的电渗流。因为大多数填料以硅胶 为基质，其电荷来自于填料表面残余硅羟基的解离。在通常使用的流动相条 件下，硅羟基会离解而带负电，所以填充此类填料的电色谱柱中电渗流的方 向由阳极流向阴极。电色谱以电渗流为驱动力，电渗流的大小决定了分析时 间的长短。所以有些液相色谱填料由于不能产生足够大的电渗流，不能用于 4 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 电色谱中。一般而言，液相色谱填料所含的残余硅轻基量不是很大，为了满 足产生电渗流的需要，一些生产厂家( 如：w a t e r s ，h y p e r s i l 等) 也可提供不封尾 或是表面烷基键合量少的c 1 8 填料。然而，在以硅羟基的解离来产生电渗流的 体系中，电渗流的大小依赖于流动相的p h 值，p h 值越高时解离的硅羟基多， 电渗流大，反之则电渗流小。 填充柱电色谱由于具有高的分离效率和丰富的固定相资源，所以目前在 电色谱中应用最为广泛。但是由于电色谱毛细管柱填充和塞子制备的工艺对 操作者的要求比较高，另外，由于两端塞子的稳定性影响了柱子的稳定性， 这些因素正制约着电色谱的进一步发展，所以应用受到了一定的限制。 1 2 3 毛细管电色谱整体柱 毛细管整体柱( m o n o l i t h i cc o l u m n ) ，又称毛细管连续床( c o n t i n u o u sb e d ) 或 毛细管原位柱。毛细管整体柱电色谱是通过在毛细管内原位聚合或固化的方 法，制成具有均一、多孔结构的整体式的固定相，并以电渗流为驱动力的毛 细管电色谱技术。 1 2 3 1 整体柱的制备 毛细管电色谱整体柱按固定相制备方法及原料可以分为三类：有机聚合 物整体柱、硅胶整体柱和以颗粒固定化型的整体柱。 1 2 3 1 1 有机聚合物整体柱 毛细管电色谱聚合物整体柱的制备与液相色谱中整体柱的制备有些不 同：其一，在电色谱整体柱的表面需要引进带电的基团，用来产生电渗流； 其二，由于毛细管没有类似于高效液相色谱中的筛板，因此往往需要将聚合 物填料共价连接在石英毛细管的内壁上。所以，聚合反应液组成以及制备的 过程都不能简单的引用液相色谱整体柱的制备方法。毛细管电色谱整体柱典 型的制备过程如图1 1 所示，一般来说是将待聚合的反应混合物( 反应单体、 交联剂、致孔剂及引发剂) 用注射器移入毛细管中，通过加热或紫外光照射使 其在管内形成连续多孔的有机聚合物床层，当聚合反应完成后，用溶剂将未 反应的单体及致孔剂冲洗干净。 5 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 裸露的毛细管 上 硅烷化的毛细管 上 l 单枉，交联单体，致孔剂及引发剂等充满毛细管 u v 或热引发 1r 完成聚合反应 上 泵或电渗流冲洗 上 毛细管整体柱 图i 1 制备毛细管整体柱示意图 23 4 56 78 9 1 0 1 1 图1 2 多孔聚合物毛细管电色谱整体柱制备中常用单体和交联剂 6 礁弋厶 飞乙 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 有机多孔聚合物型电色谱整体柱也可根据反应所用单体的不同而分为： 聚丙烯酰胺整体柱【3 5 1 、聚苯乙烯整体柱【3 6 脚1 、聚甲基丙烯酸酯整体柱f 3 8 书1 等。 图l - 2 列出了有机多孑l 聚合物型毛细管电色谱整体柱制备中常用的单体和交 联剂。 1 2 3 1 1 1 聚丙烯酰胺类整体柱 丙烯酰胺是一种亲水性很强的单体，通常在水相中聚合制备凝胶，用于 凝胶电泳分离。电色谱整体柱的应用最早是在1 9 9 5 年，由f u j i m o t o 等t 4 0 】提出。 丙烯酰胺的水溶液注入毛细管后在柱内进行聚合反应，生成充满毛细管的连 续多孔介质，柱效可达1 5 0 ，0 0 0n m ，但出峰时间很长。后来f u j i m o t o 2 f l 又在 a n a l y t i c a lc h e m i s t r y 上著文指出初期的聚丙烯酞胺整体柱的作用机理仍是筛 分作用，而不是色谱所要求的溶质与固定相之间的相互作用。为此f u j i m o t o 将丙烯酰胺用疏水性更大的n 异丙基丙烯酰胺代替，在内壁已键合上双键官 能团的毛细管中进行聚合反应，得到了具有疏水性的毛细管电色谱整体柱。 同时，h j e r t e n 等t ”】也对交联丙烯酰胺聚合物整体柱作了报导。n j e r t e n 的 方法相对比较复杂，需要经过毛细管内壁的预处理、二次聚合反应及最后共 价键合官能团等反应步骤。后来他们又对上述方法作了改进【4 1 ，在表面活性 剂作为稳定剂条件下，将疏水性的甲基丙烯酸丁酯或甲基丙烯酸十八酯与亲 水性的乙烯基磺酸聚合生成含c 4 或c 1 8 疏水官能团的床层。由于磺酸基的存 在，所以可在较宽的p h 值范围内维持较大的电渗流。用类似的方法，他们还 合成了含有c l8 和季铵基的交联丙烯酰胺聚合物整体柱【4 2 】 f u j i m o t o 及h i e r t n 等人所提出的聚丙烯酞胺连续床毛细管电色谱柱的反 应都是在水溶液中进行的，为了能在聚合物中引入疏水官能团，其聚合反应 单体就必须在连续超声乳化下匀化，为l l t n o v o t n y 等【4 3 】提出了在有机相溶液中 ( n 甲基甲酰胺水溶液) 进行聚合反应的连续床毛细管柱的制备方法。根据要引 入的疏水官能团的不同，选用不同比例的有机相溶液。如单体为甲基丙烯酸 丁酯时，对应地在溶液中加入甲酞胺的体积比为5 0 ，而当单体为甲基丙烯 酸十二烷基酯时，所加入的甲酰胺比例为9 5 。h o e g g e r 等人【饨4 5 j 合成了具 有不同疏水基团的交联丙烯酰胺电色谱整体柱，并对其色谱性能进行了系统 的研究。 7 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制蔷 1 2 3 1 1 2 聚苯乙烯类整体柱 聚苯乙烯整体柱的制备一般选用苯乙烯或氯甲基苯乙烯为单体，二乙烯 基苯为交联剂。由于聚苯乙烯具有较强的疏水性，因此可直接用于小分子、 肽、生物大分子的反相色谱分离【3 6 】。然而苯乙烯表面无活性官能团，改性困 难。而氯甲基苯乙烯与二乙烯苯的共聚物不仅具有聚苯乙烯的机械强度和化 学稳定性，而且含有氯甲基活性官能团，易于改性。另外，通过调节氯甲基 苯乙烯的比例，可以改变配体的键合密度。h o r v 6 t h 等【了7 】报导了多孔刚性聚苯 乙烯二乙烯基苯基体的毛细管电色谱整体柱。他们用甲基丙烯酸三甲氧基硅 烷的二甲基甲酰胺溶液对毛细管内壁进行反应、引入双键，在毛细管中合成 了聚( 氯甲基苯乙烯二乙烯基苯) 的毛细管整体柱，然后由活性氯甲基基团与 叔胺反应，生成带正电荷的季胺官能团，电渗流的方向从阴极到阳极。x i o n g 等人【4 6 】以苯乙烯、二乙烯基苯、甲基丙烯酸为单体和交联剂，以甲苯为孔剂 一步合成的方法制备了苯乙烯二乙烯基苯为基体的电色谱整体柱，其中甲基 丙烯酸可用来产生电渗流。靳文海等人【4 7 】在此基础上，选用甲苯异辛烷为致 孔剂，发展了快速合成苯乙烯- 二乙烯基苯基质的电色谱整体柱的方法，整个 制柱过程在4h 内完成。 1 2 3 1 1 3 聚甲基丙烯酸酯类整体柱 由于甲基丙烯酸酯类聚合物在毛细管内原位合成后的机械强度较大而且 溶涨性能优于苯乙烯二乙烯基苯类聚合物，所以此类聚合物型毛细管电色谱 整体柱正引起越来越多的关注。f r 6 c h e t 等【4 8 】于1 9 9 7 年报导了此类毛细管电色 谱整体柱的制备及应用。根据他们的报导，整体柱可在未经处理的毛细管内 进行直接合成，而柱床不会移动。他们分别采用了热引发【4 缸5 4 】和紫外光引发 两种聚合方式$ 拍】。为了使连续床层能产生电渗流，在反应液中加入参与聚 合反应的2 丙烯酰胺2 甲基1 丙磺酸( a m p s ) 1 4 s - 5 0 1 ，这样可在较宽的p h 范围 内保持足够的电渗流。最近，他们还通过乙二醇二甲基丙烯酸( e d m a ) ，2 羟基乙基甲基丙烯酸( h e m a ) ，2 二甲基氨基乙醇甲基丙烯酸酯共聚制得具 有亲水作用固定相填充柱和新型整体柱毛细管电色谱研究亲水作用的电色谱 整体柱，并月由于正电荷的引入，可产生自阴极向阳极的电渗流【5 卜5 4 1 。h o r v i t h 等p7 j 以甲基丙烯酸缩水甘油酯( g m a ) 、甲基丙烯酸甲酯( m m a ) 和e d m a 为 8 含氟聚合物毛细管电色谱整体同定相的制备 单体和交联剂，采用丙醇和甲酰胺为致孔剂发生聚合反应，在反应完成后， 用乙基丁摹胺对其功能化，制得了片j 于蛋白质和多肽分析的毛细管整体柱。 b e d a i r1 3 8 等人以a m p s 和季戊四醇二甲基丙烯酸酯为单体和交联剂，以环己醇 乙二醇乙醚水为致孔剂合成了带有长烷基链c 1 7 的整体柱。其它用于反相、 离子交换及混合模式的聚丙烯酸酯基体毛细管电色谱整体柱的制备也有文献 报导【3 9 5 8 石o 】 吴仁安等人【6 1 】合成了带有c 4 ，c 1 2 和苯基的聚丙烯酸酯的非电荷型毛细管 整体柱并用表面活性剂对其进行了动态改性。这种方法不仅可以引入产生电 渗流的基团还可以通过改变表面活性剂的种类和用量来改变电渗流的方向和 大小。 1 2 3 1 1 4 分子烙印整体柱 分子烙印是合成对烙印分子具有预定分子识别能力的聚合物的一种方 法，近年来受到了越来越多的关注，有望外消旋体的拆分、基底选择性催化、 人工抗体合成等方面获得应用。采用常规方法制得的分子烙印聚合物 ( m o l e c u l a ri m p r i n tp o l y m e r ) 通常是块状的，在装柱前需研磨、筛分，所得颗粒 的均匀性和机械强度都较差，因此柱效不高。为了解决这一问题，k a r u b e 6 2 】 将模板分子、功能单体及交联剂在不锈钢柱内聚合而成分子烙印连续床。在 该技术发展的早期，分子烙印固定相，因此发展较为缓慢。直到1 9 9 7 年大孔 烙印整体柱的出现【6 3 西5 1 ，才使得该技术应用于毛细管电色谱，并成功地分离 了心安得、甲氧乙心安、r o p i v a c a i n e 的对映体。烙印整体柱的柱效一般不高， 寻找新型交联剂，提高分子烙印聚合物孔径的均匀性，以获得较高的柱效是 其今后研究的主要方向。 ， 在制备聚合物整体柱时，通常先采用双官能团试剂一甲基丙烯酸3 ( 三甲 氧硅烷) 丙酯对毛细管内壁进行处理，其甲氧基与毛细管内壁的硅羟基反应， 双键留在外面，单体在柱内聚合时，双官能团试剂的双键同时也参与了聚合， 从而问接地实现了整体固定相与毛细管管壁的键合。聚合时大多使用脂肪醇、 环己醇、聚环氧乙烷作为致孔剂，引发剂则通常采用偶氮二异丁腈、过硫酸 铵、过氧化甲酰。 虽然聚合物整体柱具有较好的重复性、化学选材范围广、易于制备、使 9 含氟聚合物毛细管电色谱整体同定相的制备 用的p h 值范围宽等优点，但其存在溶胀、受热变形，机械性能差等不足，并 且孔径及孔径分布难以控制。南自南基- j l 发聚合而成的整体柱重复性差；紫 外引发需紫外透明的毛细管，涂有聚四氟乙烯的石英管虽紫外透明，但聚四 氟乙烯与毛细管结合不紧密，毛细管易断鲫。硅胶整体柱则在孔径控制、机 械性能、耐溶剂等方面显示出一定的优越性。 1 2 3 1 2 硅胶整体柱 相对于有机聚合物整体柱，无机多孔聚合物整体柱的制备相对复杂一些。 无机多孔聚合物整体柱主要是指硅胶整体柱。t a n a k a 6 7 。7 0 和f u j i m o t o t 7 1 1 等通过 四甲氧基硅烷或四乙氧基硅烷的酸催化水解和缩聚反应，并经过老化和干燥 处理后形成具有中孔和大孔结构的多孔硅聚合物，它具有良好的机械强度， 可根据需要再在柱上进行进一步的衍生化反应，键合上不同的官能团。聚合 反应过程如下： 水解作用：( a ) s i ( o a ) 4 + h 2 0 一s i ( o h ) ( o r ) 3 + r o h 缩聚反应：( b ) s i 0 h + s i 0 h s i o s i + h 2 0 ( c ) s i - o h + s i o r s i o - s i + r o h 该方法制成的色谱填料具有两种孑l 结构，分别为微米( m ) 级的通孔 ( t h r o u g h p o r e ) 和纳米( n m ) 级的 孑l ( m e s o p o r e ) 。通孔的存在使得硅胶整体柱具 有优异的渗透性。改变反应物组成的比例，可独立控制通孔和中孔的孔径。 不同的反应条件可使硅胶整体柱分别具有颗粒聚集型结构 6 8 , 7 1 1 和网络结构 【7 2 1 。由于硅胶为紫外透明体，因此该类柱可以直接采用柱内检测。 最近硅胶类整体柱的制备又有新进展。t o y o o k a 等【7 3 7 5 1 发展了温和反应条 件下的溶胶凝胶技术，制备了蛋白质包埋的硅胶整体柱。d u l a y 等t 7 6 1 ：i 生3 6 5l l m 紫外线照射下，在毛细管中一步原位合成了多孔硅胶连续床。此柱表现出反 相色谱的特性，可用于低相对分子质量中性化合物的分离分析。e i r a s s i 等开 展了大量的相关工作，制备了含有羟基等键合基团的硅胶整体柱，成功地分 离了中性及带电化合物7 7 1 、核酸等天然极性成分【7 8 1 以及蛋白质【7 9 1 。 以硅胶为基质的无机整体柱，虽具有理想的机械强度，比表面积大，孔 结构易控制等优势，但也存在抗溶剂性能差，适用的p h 范围较小等缺点。 1 0 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 1 2 3 1 3 颗粒固定化型整体柱 在毛细管电色谱整体柱制备中除有机聚合物和无机硅胶聚合物外，还包 括一种特殊的整体柱形式：颗粒固定化整体柱( p a r t i c l e - f i x e dm o n o l i t h i c c o l u m n ) 。它是将传统固定相颗粒用溶胶凝胶技术【8 0 1 、烧结方法【8 1 8 2 1 或利用 有机聚合物聚合【8 2 】，使其固载到毛细管内形成颗粒固定化整体柱。这些方法 制备得到的整体柱同样具有聚合物型整体柱无塞的优点，但是这些方法都会 不可避免地使固定相表面受到影响。 1 2 3 2 整体柱的评价 1 2 3 2 1 整体柱的多孔性 整体柱不能像填充柱一样以颗粒大小来表征其物理性质，而是用孔隙率 来表征。贯穿整体柱的孔隙不仅可以允许流体通过，而且己有初步研究表明， 孔隙结构影响柱效等整体柱的色谱性能【4 8 ，5 3 l 。因此对整体柱孔隙结构的测定 非常重要。 整体色谱柱结构的表征主要有扫描电子显微镜( s e m ) 、压汞法和氮吸附法 ( b e t ) 等。s e m 可直观给出所观察整体柱床层截面的形貌及孔径情况，其缺点 为只能给出断面的局部结构信息，无法对整根柱子作出全面、综合的评价。 测量孔径及其分布的标准方法为压汞法和氮吸附法。但都是在毛细管干燥的 条件下测定的，而c e c 操作一般均是在毛细管溶剂化状态下进行的。尽管如 此，由于干燥状态下测定的毛细管的孔隙性质数据与色谱性能有相关性，所 以这些方法仍在使用。 对充满流动相的整体柱中填料的孔隙结构进行评价的方法共有三种：其 一为流动法( 采用t x - h p l c 系统) ，其二为电导率测定法( c e c 操作条件下) ，最后 一种为重量分析法。流动法采用一种示踪物去探测固定相的颗粒内部以及缝 隙间的空间。具体过程为：流动相流速由1 t h p l c 系统利用示踪物来测定，同 时测定体积流速，总孔径，按文献方法计算可得【82 1 。当多孔固定相不导电时， 可采用测定电导率的方法对整体柱总孔径进行估算。该法的具体过程为：分 别将整体柱和空管充满合适的电解质溶液，测定各自的电导率，然后通过计 算得到电导率比率的值f 3 7 】。最后一种方法为重量分析法，由干燥状态下和充 含氟聚合物毛细管电色谱整体固定相的制备 满丙酮时色谱柱的重量差计算孔径。 1 2 3 2 2 孔径的控制 美国加里福尼亚大学伯克币l j ( b e r k e l e y ) 分校的f r 6 c h e t 研究组【4 8 5 3 】自9 0 年 代以来一直从事各种模式的整体柱的研究，他们对聚甲基丙烯酸酯类的毛细 管整体柱的孔结构和孔径大小进行了比较深入的研究，并在整体柱多孔性的 控制方法上取得了很大进展。他们开发的三元致孔剂只须调节致孔剂中正丙 醇与l ，4 丁二醇的相对含量，就可以在很宽的范围内( 2 5 0 1 3 0 0n m ) 控制该类整 体柱的多孔性能。f r 6 c h e t 等疆4 】认为多孔聚合物的形成过程与致孔剂、单体和 生成的聚合物三者的极性有关：致孔剂与单体的极性接近，才能作为单体的良 溶剂。致孔剂极性与聚合物极性的差异越大，相分离越早出现，则聚合物孔 径越小。但相分离出现得过晚，孔径也小。孔径的大小由聚合反应混合物中 交联剂和致孔剂的比例、组成以及由反应温度和引发剂种类和浓度决定的反 应速度等聚合反应的条件决定。由于改变混合物中交联剂的比例会改变聚合 物的化学组成，增加致孔剂的比例会增加孔体积并降低硬度，结果只有致孔 剂的组成和反应速度( 受温度、引发剂种类和浓度的影响) 常被用来调整孔径。 使用致孔剂通常要遵循以下的原则：( 1 ) 致孔剂体系要能在低于或等于聚合反 应温度下完全溶解单体混合物；( 2 ) 致孔剂对于单体和柱子而言是惰性的，并 易除去；( 3 ) 致孔剂的比例应使聚合反应产生合适的相分离。 对填充柱来说，c e c 和h p l c 一样，柱效均随着填料粒度的减小而增加。 但对整体柱来说，与柱效相关的则是柱中孔径的大小。s v e c 等人在分离硫脲 及烷基苯混合物考察整体柱柱效时发现，在孔径4 5 0n m 及5 5 0 7 5 0i l m 范围分 别出现了两个柱效极大点。尽管整体柱的孔径与柱效之问并无简单的关系， 但仍能提供一些有用的信息。文献中常常通过测定不保留物质的柱效来作为 评价柱质量的方法。当硫脲作为不保留标记物时，孔径分别为7 5 0l l m 和4 6 0n m 的整体柱具有相似的柱效，分别为1 1 0 0 0 0 和9 9 0 0 0 理论塔板数每米。但考察保 留性更强的戊苯时，这两根柱的柱效却显示了非常明显的差异，分别为3