（微生物学专业论文）山东链霉菌的扩大发酵与抗菌活性物质的提纯分析.pdf

原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导 下，独立进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容 外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的科 研成果。对本文的研究作出重要贡献的个人和集体，均已在文 中以明确方式标明。本声明的法律责任由本人承担。 论文作者签名：耋当! 塑! 日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定， 同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本 ， 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：遨导师签 山东大学硕士学位论文 摘要 从土壤中筛选抗生菌的过程中，得到一株产广谱、高活性抗真菌物质的链霉 菌2 4 # ，通过测定抗菌谱，发现其对3 0 余种植物病原真菌有显著拮抗作用，其 次生代谢产物对病菌菌丝有断裂、扭曲、缢缩等致畸效应。根据1 6 sr d n a 序列 分析和菌株形态特征、培养特征、细胞壁化学组分及生理生化特性等实验结果， 将该菌株命名为：山东链霉菌( s t r e p t o m y c e st h e r m o c a r b o n x y d u sv a r s h a n d a e n s i s ) 本文对山东链霉菌进行扩大发酵试验及大鼠急性毒性试验和对其所产抗真 菌活性成分进行提纯和理化性质分析首先对山东链霉菌进行扩大发酵，按照低 成本高活性的原则，进行培养基优化，确定最适培养基组成，同时进行中试发酵， 检测中时发酵的各项指标，为实际生产奠定了理论基础。 通过大鼠急性毒性试验，采用霍恩氏法以1 0 0 0 0 m g k g b w 灌胃染毒，1 4 天 后大鼠正常生长，无一死亡，按照现行农药标准属于低毒物质，按照实际加样量， 属于无毒物质。 同时进行了山东链霉菌所产抗真菌活性成分的提纯与理化性质分析。首先通 过有机溶剂萃取试验对活性成分进行粗提，然后通过硅胶柱层析进行除部分里去 除色素。在根据抗菌素活性成分的酸碱性特点采用阴离子树脂d e a e s e p h r o s e 浓度梯度洗脱，获得了有效组分的盐溶液。溶液在通过半透膜透析试验后大体估 测了抗生素活性成分分子大小，利用g - 2 5 分子筛除盐精制收集活性物质。经过 h p l c 测定，获得峰形左右对称的单蜂。经真空低温冻干，获得淡黄色粉末纯品， 经过红外、紫外、质谱、核磁共振、元素分析等光谱仪器分析了其结构组成及分 子式。 关键词：山东链霉菌，抗真菌活性，条件优化，急性毒性试验，理化性质，分离 纯化 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i ns c r e e n i n gp r o c e s so fa g r i c u l t u r ea n t a g o n i s t i cs t r a i n s ，s t r e p t o m y c e ss t r u m2 4 # w a si s o l a t e df r o ms o i l ，w h i c hw a sf o u n dt ob es t r o n g l ya n t i b i o t i ct oa b o u t3 0p l a n t p a t h o g e n i cf u n # ，s u c ha sh e i n t i n t h o s p o r i u ms o r o k i n u m , f u s a r i u mg r a m i n e a r u m s c h w ，g a e u m a n o m y c e sg r a m i n i s ， e a l s am a l i , e t c t h es e c o n d a r ym e t a b o l i t e s p r o d u c e db yt h es t r a i nh a dm a l f o r m a t i o ne f f e c to nt h e s ep l a n tp a t h o g e n i cf u n g i t h e 1 6 sr d n as e q u e n c ea n a l y s i sa n dt h et r a d i t i o n a li d e n t i f i c a t i o nm e t h o d sw a su s e dt o i d e n t i r yt h es w a i n b a s e d0 1 1t e s tr e s u l t s ，t h i ss t r a i nw a si d e n t i f i e da ss t r e p t o m y c e s t h e r m o c a r b o n x y d u sv a rs h a n d a e n s i s t h i sa r t i c l ec a r r i e so nt h ee x p a n d e df e r m e n t a t i o ne x p e r i m e n ta n dt h eb i gm o u s e a c u t et o x i c i t yt e s ta n dt oi t sp r o d u c e st h ea n t i f u n g u sa c t i v ec o n s t i t u e n tt oc a l t yo n t h ed e p u r a t i o na n dt h ep h y s i c sa n dc h e m i s t r yn a t u r ea n a l y s i st os t r e p t o m y c e s t h e r m o c a r b o n x y d u sv a t s h a n d a e n s i s f i r s tc a r r i e so i lt h ee x p a n s i o nt ot h es h a n d o i l g c h a i nm o l dt of e r m e n t , a c c o r d i n gt ot h el o wc o s th i g ha c t i v ep r i n c i p l e ，c a r r i e so nt h e c u l t u r em e d i u mt o o p t i m i z e ，d e t e r m i n e d t h em o s ts u i t a b l ec u l t u r em e d i u m c o m p o s i t i o n , s i m u l t a n e o u s l yc a r r i e s o i lt h ee x p e r i m e n t a lf e r m e n t a t i o n , i nt h e e x a m i n a t i o nw h e nf e r m e n t se a c h t a r g e gh a sl a i dt h er a t i o n a l e f o rt h ea c t u a l p r o d u c t i o n p a s s i n gt h eo v e r s i z e dm o u s ea c u t et o x i c i t yt e s t ，u s e st h el a wt o1 0 0 0 0 m g k g b w t of i l lt h es t o m a c hc o n t a m i n a t i o n , a f t e r1 4d a y sb i gm o u s en o r m a lg r o w t h ，d o e sn o t h a v ead e a t h , b e l o n g st ot h el o wp o i s o n o u sm a t t e ra c c o r d i n gt ot h ep r e s e n t a g r i c u l t u r a lc h e m i c a l ss t a n d a r d ，a c c o r d i n gt o t h ea c t u a lc a n a d i a nt y p eq u a n t i t y , b e l o n g s t ot h en o n - t o x i cm a t t e r s i m u l t a n e o u s l yc a r r i e do ns t r e p t o m y c e st h e r m o c a r b o n r y d u sv a ts h a n d a e n s i st o p r o d u c et h ea n t i - f u n g u sa c t i 、e c o n s t i t u e n tt h ed e p u t a t i o na n dt h ep h y s i c sa n d c h e m i s t r yn a t u r ea n a l y s i s f i r s t c a r r i e so nt h r o u g ht h eo r g a n i cs o l v e n te x t r a c t e x p e r i m e n tt ot h ea c t i v ec o n s t i t u e n tt h i c k l yr a i s e s ，t h e nc a r r i e so nt h r o u g ht h es i l i c a g e lc o l u m nc h r o m a t o g r a p h i ca n a l y s i se x c e p tt h ep a r ti nr e m o v e st h ep i g m e n t i nu s e d 山东大学硕士学位论文 t h ea n i o nr e s i nd e a e - s e p h r o s ec o n c e n t r a t i o ng r a d i e n t a c c o r d i n gt ot h ea n t i b i o t i c a c t i v ec o n s t i t u e n ta c i da n da l k a l ic h a r a c t e r i s t i ct oe l u t e ，h a so b t a i n e dt h ee f f e c t i v e c o m p o n e n ts a l tb r i n e t h es o l u t i o ni nh a dr o u g h l ye s t i m a t e da f t e rt h ed i a l y s i s e x p e r i m e n tt h ea n t i b i o t i ca c t i v ec o n s t i t u e n tm e m b e rs i z e ，p u r i f i e st h ec o l l e c t i o na c t i v e m a t e r i a lu s i n gt h eg - 2 5m o l e c u l a rs i e v ed e s a l i n i z a t i o n a f t e rt h eh p l cd e t e r m i n a t i o n , o b t a i n st h ep e a ks h a p et h eb i l a t e r a ls y m m e t r ys i n g l ep e a k a f t e rt h ev a c u u ml o w t e m p e r a t u r ef r e e z i n ga n dd r y i n g , o b t a i n st h ef a i n ty e l l o wp o w d e rt ob ep u r e ，p a s s e d t h r o u g hi n f t a r e d u l t r a v i o l e t , s p e c t r u mi n s t r u m e n t a la n a l y s i si t sg n r a c t u r ec o m p o s i t i o n a n dt h em o l e c u l a rf o r m u l aa n ds oo nm a s ss p e c t r u m ，n u c l e a rm a g n e t i cr e s o n a n c e ， u l t i m a t ea n a l y s i s k e yw o r d s ：s t r e p t o m y c e st h e r m o c a r b o n x y d u av a rs h a n d a e n s i s ，a n t i - f u n g u s a c t i v e n e s s ，t h ec o n d i t i o no p t i m i z e s ，a c u t et o x i c i t yt e s t , p h y s i c sa n dc h e m i s t r y 1 a t u r e ， s e p a r a t i o np u r i f i c a t i o n 5 山东大学硕士学位论文 1 植物病源真菌的危害 前言 真菌 f u n g i ) 在自然界中分布极广，目前已有记载的估计约有1 0 万种以上， 大部分是腐生的，少数可以引起植物及人、畜的病害。植物病原真菌侵害几乎所 有的农作物，造成一些主要农作物的严重减产，甚至绝收，如水稻、小麦、花生、 棉花、苹果等据统计，苹果烂果9 0 是由真菌引起的，而小麦赤霉病一项就给 欧洲农业带来一亿多美元的经济损失。且这些植物病害呈逐年上升趋势。因此， 在植物病理学中，植物病原真菌是十分重要的。这里将几种主要的植物真菌病害 的情况综述如下： 水稻稻瘟病：其病原菌为稻梨孢菌( p y r i c u l a r i ao r y z a e ) ，属半知菌亚门有 性世代为稻郛孢球腔菌( m y c o s p h a e r e l l a ) 属子囊亚门。稻瘟瘸是水稻三大重要 的病害之一，广泛分布于世界各稻区我国南北稻区每年都有不同程度发生。流 行年份一般减产1 0 - - 2 0 ，严重的达4 0 - - 5 0 在水稻生长前期，如果叶瘟严 重发生，稻株在孕穗期前枯死，全田呈火烧状；有些稻株虽不桔死，但抽出的新 叶不易生长，植株萎缩，不抽穗。在水稻抽穗期。如果节瘟和穗瘟劲瘟严重发生， 则招致大量白穗和半白穗，损失很大由于为害的时期和部位不同，可分为苗瘟、 叶瘟、节瘟、穗颈瘟和谷粒瘟。一般以叶瘟，节瘟和穗颈瘟危害较大。 水稻纹桔病：病原菌为佐佐木薄膜革菌( p e l l i c u l a r i as a s a k i i ) , 属于担子菌 亚门；无性世代称丝核菌( r h i z o c t o n i a $ o l a n i ) ，属半知菌亚门。水稻纹桔病在我 国各稻区都有发生但以长江流域一带和南方稻区发生较普遍，为害性也大，成 为水稻主要病害之一 小麦赤霉病：引起麦类赤霉病的病原菌有很多在我国主要是玉蜀赤霉菌 ( g i b b e r e l l az e a e ) 。属于子囊菌亚门；其无性世代称禾谷镰刀菌( f u s a r i u m g r a m i n e a r u m ) 麦类赤霉病是影响买麦类生产的主要病害之一。主要发生于淮河 以南及长江中下游一带，特别是在滨湖沿江地区常年严重发生，可减产四、五 成。此病在我国北方造成的危害一般较南方为轻，但东北春麦区在个别年份也很 严重。在华北各地。此病过去很少发生，但近年为害有逐年增加的趋势。被害麦 穗早期拈死，籽粒小，不仅大量减产，而且品质变劣，出粉低。病粒做种作用时 山东大学硕士学位论文 发芽率下降尤其是受害麦粒中产生致呕毒素及类雌性毒素，对人畜健康影响极 大赤霉病从幼苗到抽穗均可发生，引起苗桔、穗腐、基腐或杆腐，其中穗腐发 生普遍严重。 小麦全蚀病：病原菌为禾顶囊壳菌( g a e u m a n o m y c e sg r a m i n s ) 属于子囊菌 亚门，存在不同的变种，在小麦上的变种称为小麦全蚀病菌( g a e u m a n o m y c e s g r a m i n i st r i t i c i ) 小麦全蚀病在国内于1 9 4 3 年在云南最早发现，1 9 5 6 年前后在 江苏、四川等省有零星发生，近年来在华北，西北，长江中下游等十六各省相继 发生，以山东省烟台地区发病面积大，受害严重。小麦受害后成穗率低，千粒重 下降，一般发病地块减产1 0 - - 2 0 ，重者减产为5 0 以上甚至无收。麦l i t d , 麦 从零星发病到成片死亡，通常仅需三年左右。小麦全蚀病不仅危害重，而且蔓延 快，是一种毁灭性病害目前在国内尚属局部发生，已列为检疫对象 棉花枯萎病：病原菌为尖镰孢萎焉专化真菌( f u s a r i u mo x y s p o r u m ，印v a m n f e c t u m ) ，属于半知菌亚门。棉花枯萎病最早发生于1 9 8 2 年美国阿拉巴 马州发生，以后逐渐扩展蔓延到欧洲、亚洲、非洲等许多国家。我国在解放前由 于从美国病区引进了棉种，因而在1 9 3 4 年第一次于江苏南通农学院农场发现此 病，1 9 3 6 年又陆续在南京及上海发现，以后随着棉种的调运，病区日益扩大， 危害严重解放后，为了更好的控制和消灭此病于1 9 7 2 年成立了全国棉花枯、 黄矮病综合防治研究协作组，广泛开展防治研究，取得了很大成就但是近年来 植物检疫制度执行不严，重病区虽得到压缩，而轻病区和零星区仍然有所扩大。 根据1 9 7 5 年调查，全国枯、黄萎病面积约占棉田总面积l l 棉枯萎病造成前 期大量死苗，后期叶片大量脱落，甚至桔死。重病田发病率可高达7 0 一8 0 ， 一般减产2 0 - - 3 0 ，纤维品质下降。不少棉花原种场因此病危害而不能繁育良 种。 棉花黄萎病：病原菌有两种，一种为大丽花轮枝孢菌( v e r t i c i l l i u md a h l i a e ) ， 另一种为黄萎轮枝孢菌( v e r t i c i l l i u ma l b o - a t r u m ) ，属于半知菌亚门。据河北鉴定， 我国可能主要是前一种。棉黄萎病是我国棉花上危害最严重的病害之一，被列为 我国植物检疫对象。此病1 9 3 5 年由美国引种时传入我国。目前已传播到多数产 棉省，除甘肃、贵州单纯黄萎病区外，其他病区都是枯、黄萎病混生区。黄萎病 主要分布在我国北方棉区和特早熟棉区，南方棉区较少。棉花发生黄萎病后，虽 山东大学硕士学位论文 然不如发生枯萎病后枯死严重，但所致的损失也很大，发病后病株较健株一般减 产2 0 - - 6 0 ，纤维品质下降。近年由于重病区推广了抗枯萎品种，因此枯萎病 有所减轻，而黄萎病却有发展的趋势 苹果腐烂病：俗称烂皮病，是一种真菌性病害，此病主要以溃疡型为主，病 部初呈红褐色，组织松软，有酒糟味，多烂至木质部，逐渐变为黑褐色干斑，易 剥落。另一种类型为枯杖型，多发生在衰弱树和小枝上。苹果腐烂病菌( v a l s am a l l m i y a d e e l y a m a d a ) 是北方苹果产区发生普遍、危害严重的一种病害，大发生时可 使全园覆灭。 西瓜炭疽病：其病原菌属真菌半知菌亚门刺盘孢菌属。该病又名黑斑病，是 我国西瓜生产中的主要病害炭疽病不仅危害西瓜，而且还危害甜瓜，在生长季 节和储运过程中均可发病，造成大量烂瓜，往往给瓜农造成很大的经济损失。其 病原菌属真菌半知菌亚门刺盘孢菌属。 2 抗真菌生物农药的研究进展 对于植物病源真菌的防治一般采用化学农药跟生物农药即农用抗生素两种 手段农药作为一种重要的生产资料，对农业保持稳产、丰产起到了很大作用， 现在生产上应用的农药品种已有l o o 多种 传统化学农药的长期使用带来了种种弊端，如有害生物抗药性的产生、残留 毒性以及环境污染等等。目前，许多高毒性、高残留、持久性农药已被禁止使用。 公众对农药的认识己发生了深刻的变化，人们普遍认为2 1 世纪的农药将成为一 种“环境和谐农药”。社会的发展、公众的需要，促使科研人员寻求对人类健康 和生态环境安全的新型有害生物控制剂一一生物农药。生物农药是由微生物产生 的次级代谢产物。生物农药与化学农药相比，其有效成分来源，工业化生产途径， 产品的杀虫防病机理和作用方式等诸多方面，有着许多本质的区别。生物农药更 适合于扩大在未来有害生物综合治理策略中的应用比重。概括起来生物农药主要 具有以下几方面的优点。 ( 1 ) 选择性强，对人畜安全。目前市场丌发并大范围应用成功的生物农药产品， 它们只对病虫害有作用，一般对人、畜及各种有益生物( 包括动物天敌、昆虫天 山东大学硕士学位论文 敌、蜜蜂、传粉昆虫及鱼、虾等水生生物) 比较安全，对非靶标生物的影响也比 较小 ( 2 ) 对生态环境影响小生物农药控制有害生物的作用，主要是利用某些特殊 微生物或微生物的代谢产物所具有的杀虫、防病、促生功能。其有效活性成分完 全存在和来源于自然生态系统，它的最大特点是极易被日光、植物或各种土壤微 生物分解，是一种来于自然，归于自然正常的物质循环方式。因此，可以认为它 们对自然生态环境安全、无污染。 ( 3 ) 可以诱发害虫流行病。一些生物农药品种( 昆虫病原真菌、昆虫病毒、昆虫 微孢子虫、昆虫病原线虫等) ，具有在害虫群体中的水平或经卵垂直传播能力， 在野外一定的条件之下，具有定殖、扩散和发展流行的能力。不但可以对当年当 代的有害生物发挥控制作用，而且对后代或者翌年的有害生物种群起到一定的抑 制，具有明显的后效作用。 ( 4 ) 可利用农副产品生产加工。目前国内生产加工生物农药，一般主要利用天 然可再生资源( 如农副产品的玉米、豆饼、鱼粉、麦麸或某些植物体等) ，原材料 的来源十分广泛、生产成本比较低廉。因此，生产生物农药一般不会产生与利用 不可再生资源( 如石油、煤、天然气等) 生产化工合成产品争夺原材料的矛盾，有 利于人类自然资源保护和永久利用。 ( 5 ) 生产设备通用性较好。生物农药的工业生产一般采用液体深层发酵，所用 设备为通用设备，一般主要包括：种子罐、发酵罐、浓缩、过滤系统、有效成分 的分离提取和干燥装置等。该类设备一般可以满足适于对不同微生物或微生物代 谢产物进行大规模工业化生产的要求。设备用途的多样化，有利于企业根据市场 需求变化，从事开展生物农药或其绝农业徽生物产品的系列化开发。 ( 6 ) 产品改良的技术潜力大。对传统生物农药产品，可以利用常规技术基因 工程技术和微生物发酵工程技术改良菌株的生产性能；优化发酵工艺流程；提高 9 山东大学硕士学位论文 单位体积有效生物活性成分的发酵水平；缩短发酵生产周期：减少原材料消耗； 降低生产使用成本；改进产品性能及提高防治效果的稳定性、速效性和持效性等。 技术改进的途径多，发展潜力巨大。 ( 7 ) 开发投资风险相对较小掘国外研究分析，耳j ； 国外新化学农药开发成功 的机率，已经由过去的1 5 0 0 0 降低到目前的1 2 0 0 0 0 1 8 0 0 0 0 。在研究资金投 入方面，开发一种生物农药约需投入2 0 0 万4 0 0 万美金，而开发一种新的化学 农药，需要投资4 0 0 0 万8 0 0 0 万美元，两者经费投入比约为1 2 0 ，其中开发成 本中的商品注册费大约l ：1 0 0 ，两者的产品开发周期比约为l 2 l 3 。投资开 ， 发生物农药的市场风险相对较小。而且，利用天然的微生物资源一般难以受到技 术专利法规的控制，可以在前人大量研究工作基础之上，得到创新启示，后来居 上，往往能够节省人力和物力的投入，缩短产品的研究开发周期。 正是由于生物农药具有诸多方面的优点，扶植生物农药工业无论从促进科学 技术创新发展，还是从国家投入产出的经济利益方面考虑，都完全吻合今后产业 生态革命的方向。无公害生物农药是人类实现可持续发展和保障食品安全生产的 高新技术突破口之一。因此，确定了生物农药在未来全球农药产业结构中的特殊 地位 由于微生物农药具有这些特点，以及人们对环境与健康问题的日益关注，开 发无公害的微生物农药将成为世界农药市场的发展趋势，这也是实施生产安全优 质的无公害食品这一农业战略目标的主要内容。 世界上一些著名的企业都在微生物农药领域投入了大量人力、物力开发微生 物农药，如美国的d u p o n t 公司、r o k u o & h a s s 公司、德国b a s f 公司、拜尔公 司、英国的z e n e e a 公司等、美国农业部与一些高校联合开发微生物农药，德国 g b f 近年来也在积极丌发几丁质酶、生物农药等新产品并取得了明显进展。 i o 山东大学硕士学位论文 3 抗真菌生物农药的应用现状及开发动向 3 1 抗真菌生物农药的应用现状 农用抗生素是一种随着医用抗生素的研究和实施病虫害综合防治及可持续 农业发展的需要应运而生且日益受到人们重视的生物农药农用抗生素大多数是 由链霉菌产生的次级代谢产物，对于农业有害生物如病原微生物、昆虫、杂草具 有特异性药理作用本世纪2 0 - 4 0 年代，科学家们相继发现青霉素、链霉素等抗 生素，并在治疗人类疾病上获得了巨大的成功。在此启发和推动下，植物病理学 家开始尝试利用抗生素来防治农作物病害最初，用于防治农业有害生物的抗生 素大多是医用抗生素及其混合剂，如链霉素、土霉素及其混配的。农霉素”等 由于农作物病害与人类疾病在病原，发生条件等方面明显不同。因此，针对农业 有害生物筛选、研制专用抗生素势在必行，农用抗生素作为抗生素工业的一个分 支也就应运而生4 0 年代，英、美、苏、日先后研制出毛菌素、抗霉素、灰黄 霉素等农用抗生素，在防治农作物病害上起到一定作用 c h a n d r a ( 1 9 8 2 ) ；尹萃耘( 1 9 8 4 ) 等都相继报道农用抗生素大都是土壤链霉菌的 次级代谢产物，在农用生态环境中分解快，不易在动、植物体内长时间积累，因 此，抗生素在防治农作物病、虫害上表现出高效、低毒，低残留，大面积使用对 人、畜安全，不污染环境等优点。、 6 0 7 0 年代，随着抗生素专业知识和研究技术水平的提高，农用抗生素迅速 发展为一种重要的杀菌剂，为减少使用剧毒化学农药，防治农业有害生物，促进 农业的丰产丰收发挥了重要作用。5 0 - 6 0 年代后期，日本率先研制成功用于防治 水稻三大病害( 稻瘟病、纹枯病、白叶枯病) 的抗生素一灭瘟素s 、舂日霉素、多 氧霉素并实现了产品的工厂化生产，推动了世界农用抗生素的发展。到1 9 6 8 年， 日本新农抗应用已占全部杀菌剂的6 8 1 9 7 2 年。以上四种新农用抗生素年产量 达4 8 ，7 7 4 吨，成为日本防治水稻病害的当家品种。日本在农用抗生素的研究和 应用方面的成就，引起全世界对农用抗生素的兴趣，为减少大量使用化学农药造 成的环境污染，促进农用抗生素向工业化、实用化方向发展提供了范例。据估计， 7 0 年代初世界抗生素产量约3 5 ，0 0 0 - 4 3 ，0 0 0 吨( 不包括中国) ，其中植保、畜牧兽 医用的抗生素及食品保鲜、防腐用抗生素约为2 5 ，0 0 0 - 4 3 ，0 0 0 吨；约占总产量的 山东大学硕士学位论文 7 5 我国自5 0 年代开始农用抗生素的研究，6 0 7 0 年代，先后研制了“5 4 0 6 一。 春雷霉素、和农抗1 2 0 等多个农用抗生素品种8 0 年代初研制成功了多效霉素、 公主岭霉素和井冈霉素9 0 年代，武夷菌素、中生菌素、宁南霉素j 杀枯肽等 新农抗又相继研制成功，并在农用抗生素关键技术研究上取得了重大进展，推动 我国生物防治的进步 。 3 2 抗真菌农用抗生素的开发动向 发展农用抗生素是可持续发展的需要，进入二十一世纪，全球环境意识增强， 其中消除化学农药带来得危害已成为各国政府关注的课题，相继采取了限制化学 农药和大力发展生物农药的计划和措施1 9 9 2 年召开的世界环境和发展大会上通 过了全球可发展框架性文件 2 1 世纪议程。其中，第2 l 条决议提出，要在全 球范围内控制化学农药的销售和使用，使生物农药产量以每年1 0 2 0 的速度 并占有越来越多的份额许多世界著名跨国公司都看好生物农药领域，认为天然 产物是未来农药的重要源泉。美国的杜邦公司和孟山都公司、国的拜耳公司、瑞 士汽巴嘉基公司、丹麦n o v o 公司、日本住友公司等化学农药公司和生物技术 公司都纷纷投资开展生物农药研究与开发。我国也先后将农作物病虫害防治内容 列入国家“七五”、“八五”和“九五”科技攻关项目专题。在中国2 1 世纪议 程中将生物农药和绿色食品的研究和开发，列入首批重点项目计划。可以预料， 2 l 世纪的生物农药有良好的发展前景，在有害生物的综合防治中将发挥越来越 重要的作用。在这种大趋势下，农用抗生素也必将迎来一个更为广阔的发展空间 和更为光明的发展前景，为我国的环境保护和可持续发展作出应有的贡献。 纵观农业抗生素的发展历程，农用抗生素只有在有效性、经济性、安全性方 面优于化学农药，实现产品的工业化生产，才能在竞争中立于不败之地。6 0 年 代，防治稻瘟病的农用抗生素灭瘟素、春雷霉素替代了化学农药一有机汞制剂， 8 0 年代，化学农药一三环唑又替代了灭瘟素和春雷霉素，这一现象表明：农用抗 生素除了发挥自身特点外，还必须降低成本，提高防效，才能在农业生产中发挥 更大的作用。 ， 选育高产菌株是农用抗生素向工业化生产方向发展中有待解决的关键问题。 山东大学硕士学位论文 自从5 0 年代我国开始农用抗生素菌种超过1 0 0 多种，其中完成室内测定和田间 小区试验的品种也有5 0 多种，但真正在农业生产上发挥作用的品种并不多，其 中直接原因就是抗生素产生菌效价较低，成本高，难于生产推广应用。井冈霉素 是国内为数不多的能在农业生产上获得长期、大面积推广应用的农用抗生素品种 之一自7 0 年代至今，2 0 多年问井冈霉素一直是防治水稻纹枯病的主要农药品 种。沈寅初( 1 9 9 8 ) ；林德沂( 1 9 9 6 ) 报道，目前在全国已有专业化生产厂3 0 多家， 年产含量5 的井冈霉素达3 ，5 0 0 - 4 ，0 0 0 吨，占据了9 0 以上防治稻纹枯病用药 的市场其成功的主要原因在于通过菌种选育，大幅度提高了产生菌的效价，从 野生菌种最初的几十单位，提高到2 0 ，0 0 0 - 3 0 , 0 0 0 单位，大大降低生产成本，实 现了产品工业化生产，达到大面积推广应用。 农用抗生素研究中的优良菌种选育一直是国家攻关项目的重要内容，目前， 以阿维菌素为代表的农用抗生素研究已被许多国家列为生物农药发展中的重点、 优先开发的项目筛选新菌种，提高产生菌效价和筛选新农抗是国家。七五”、 。八五”和。九五”科技攻关中农用抗生素关键技术研究的重要内容，因此，采 用传统育种技术与现代生物技术相结合的方法，提高农用抗生素的效价，是解决 其继续发展的重要课题。 另外，熊宗贵0 9 9 5 ) 认为虽然农用抗生素资源丰富、潜力大、种类多，但在 实际应用中还存在一些问题需要解决：1 、农用抗生素质量标准。如何确定毒效规 格，经济而又高效的确定施药量急待解决2 、开展增效剂的研究。研究提高生 物农药活性和毒力的物质，这种物质最好具有填充剂和粘着剂的功效。3 、农用 抗生素的安全性鉴定问题由于大多数抗生素和微生物的其它代谢产物混在一 起，化学分析困难，需要创造新技术去解决毒性及残留量的鉴定问题 总之，目前国家级正式农药登记防治植物真菌病害的药剂9 9 以上为化学农 药，登记的生物农药不足l ，而获得临时登记的防治真菌病害的抗生素类农药 不过十种，因此，急需开发出具有低毒、高效、选择性强、残留时间短、无三致 和无公害等特点的新型农用抗生素。而农用抗生素的研制所面临的主要问题是： ( 1 ) 利用原生质体融合或分了生物学技术，将不同菌株进行基因重组来改 良和培养新菌株特别是种自j 的基因重组，获得效价更高、抑菌谱更广的菌株 ( 2 ) 农用抗生素作为一种生物制剂，其产业化最关键的因素是获得高效高 山东大学硕士学位论文 产菌株后，其发酵条件的优化任何工业发酵过程的研究，都要进行实验室规模 最佳培养基和培养条件的筛选，而后要进入中试及大规模生产。 ( 3 ) 随着公众对生态环境的关注，特别是中国加入w t o 以来，为加大中 国农药在世界市场上的份额，开发出具有自主知识产权、高效低毒、无污染、无 残留的农用抗生素，并实现产业化，其前提就是要获得纯品农用抗生素并确定其 化学结构，这对农用抗生素进行工业化合成、分子结构的改造、研制出新农药， 建立新化合物文库具有不可估量的作用。 ( 4 ) 开展农用抗生素的作用机理研究，明确其作用方式及作用位点，这对 于克服耐药性，提高筛选效率和靶目标的针对性，延长农用抗生素的使用寿命， 进行有效成分的检测等提供必不可少的先决条件 4 抗真菌农用抗生素的作用机理 随着农用抗生素的开发与利用，农用抗生素作用机制的研究也取得了不少进 展。关于抗生素的抗菌作用机制是很奇妙的，也是十分诱人的，它吸引着科学界 的注意。因为，如能弄清抗生素在改变寄生菌细胞代谢作用与增强抗病性的关系， 就将对作物的人工免疫开辟一条新的途径。从农抗对病原菌的形态、生理生化、 分子等不同水平进行了研究。现将研究得比较清楚的农用抗生素的作用机理综述 如下： 4 1 作用于植物病原真菌细胞壁 多氧霉素、n i k k o m y c i n 是作用于病原真菌的抗生素e n d o ( 1 9 7 0 ) ， i s h i z a k i ( 1 9 7 4 ) 等报道多氧霉素对真菌的呼吸作用、d n a 、r n a 、蛋白质和磷脂 的合成影响很小，但引起敏感菌生长菌丝的尖端形成膨胀泡而破裂。o h t a 等 ( 1 9 6 9 ) 报道多氧霉素d 抑制4 c 葡萄糖胺掺入植物病原菌c o c h l i o b o l u s 所咖b e a n u s 的细胞壁几丁质中m i s a t o ( 1 9 6 9 ) 报道多氧霉素抑制由几丁质合成酶 催化的，由尿二磷一n 一乙酰葡萄糖胺到几丁质这一步反应，并通过酶的动力学 研究，说明多氧霉素d 是几丁质合成酶的竞争性抑制剂h o d 等( 1 9 7 4 年) 报道 多氧霉素d 与几丁质合成酶催化的底物尿二磷- - n - - 乙酞葡萄糖胺结构类似，从 而竞争性的抑制该酶活性。导致敏感细胞凡丁质不能合成而起到杀菌作用。 山东大学硕士学位论文 m a h a d e v a l l ( 1 9 9 7 ) 报道的w y e c 1 0 8 ：f i e d l e r ( 1 9 8 2 ) ；d u l l i l ( 1 9 7 6 ) 报道n i k k o m y e i n 是具有与多氧酶素d 相同作用机理的另一种农用抗生素。 5 4 2 作用于菌体细胞膜 ， 细胞膜是一种半透性膜，是细胞的选择屏障，有些抗生素作用于细胞膜，从 而破坏其选择性屏障功能。匹马霉素等多烯类抗生素作用于真菌细胞质膜，与质 膜中含有的麦角固醇作用，损伤细胞质膜，造成细胞内物质的渗漏，细胞破裂死 亡，从而起到杀菌的作用。但这类抗生素选择性小，毒性比较大( 田中信男，1 9 7 7 ) 。 4 3 作用于蛋白质合成系统 作用于蛋白质合成系统的农用抗生素很多，其作用机理也研究的比较深入。 杀稻瘟菌素一s ，春臼霉素、放线酮，链霉素、氯霉素等是其中的主要放研究者。 蒋细良等( 1 9 9 7 ) 采用同位素标记d n a 、r n a 、蛋白质合成的前体物胸腺嘧啶核 苷、尿嘧啶核苷、亮氨酸研究了中生菌素的作用机理，发现中生菌素是一种广谱 性的农用抗生素，它对菌体形态、细胞膜无明显的影响，对菌体细胞内r n a 、 d n a 的合成无明显的影响，而对蛋白质的合成有显著的抑制作用，说明中生菌 素的作用机制是使病原菌的蛋白质的合成受阻。从而使细胞内的大分子物质主要 是r n a 、d n a 合成所必需的酶类及有关蛋白质因子不能及时补充，导致d n a 、 r n a 不能继续合成而起到杀菌的作用。 4 4 作用于能量代谢系统 有效霉素是目前应用量最大的农用抗生素，主要用来防治水稻纹枯病。在一 般条件下，有效霉素体外对病原菌的作用不大，只能在一定条件下引起菌丝尖端 的异常分枝，然后进一步抑制其发育关于有效霉素的作用机理，w a k e 等( 1 9 7 5 ) 认为是抑制肌醇的生物合成。肌醇是真菌正常生长和致病性不可缺少的因子。实 验证明，有效霉素a 能显著抑制黄瓜猝倒病菌中的肌醇合成。加入肌醇后可使 黄瓜猝倒病菌的致病性得到恢复。y a m a g u c h i ( 1 9 9 0 ) 研究发现，有效霉素对纹枯 病菌的主要储存糖一海藻糖的酶的活性有强烈的抑制作用( 海藻糖酶能分解海藻 糖为葡萄糖，使其能在菌丝体内运输) 。故有效霉素能有效的阻止纹枯病菌从菌 1 5 山东大学硕士学位论文 丝基部向顶部输送养分( 葡萄糖) ，从而抑制病菌生长和发育 l a r d y ( 1 9 6 9 ) ；h a t e f t ( 1 9 6 2 ) 等相继报道了多抗霉素a 是呼吸链电子传递的抑 制剂，它能够抑制细胞色素b 与细胞色素c 之间的电子传递。 4 5 作用于细胞分裂 灰黄霉素是作用于真菌的抗生素，其作用特征是在较低浓度下完全抑制病菌 生长浓度时可引起菌丝螺旋形成等异常发育，因此称为“卷曲因子”在试管内 该抗生素能阻止作为细胞骨架的维管蛋白二聚体组装为微管，有人认为 这一作用是由于灰黄霉素结合于微管附属蛋白，但y a m a k u c h i ( 1 9 9 0 ) 认为灰黄霉 素是直接结合于微管蛋8 - 聚体，使纺锤体形成受阻，从而影响细胞的有丝分裂。 早期研究认为其作用于几丁质的合成，后来发现具有几丁质细胞壁的真菌如黑曲 霉，粗糙脉孢菌等都对灰黄霉素不敏感，说明并不是作用于几丁质。m c n a l l 发现， 加嘌呤、嘧啶及其核苷酸可部分抵消灰黄霉素对皮肤真菌的抑制作用。 e l - n a k e e b 等证明灰黄霉素抑制1 4 c 一尿嘧啶和胸腺嘧啶掺入核酸，但不影响4 c 一氨基酸掺入蛋白质，故陈玉梅1 1 9 7 9 ) 认为灰黄霉素抑制核酸生物合成也是其作 用机理之一 4 6 通过提高植物的抗病力而防病治病 农抗1 2 0 是一种防治西瓜枯萎病的非常有效的农用抗生素，但朱昌雄( 1 9 9 0 ) 认为在植物体外农抗1 2 0 对西瓜枯萎病的作用并不很强，不及化学农药双效灵 等，而体内农抗1 2 0 的作用明显强于双效灵。孔建等( 1 9 9 3 ) 研究表明用农抗1 2 0 浸种西瓜种子或西瓜幼苗灌根，都能显著增强西瓜幼苗抗西瓜枯萎病菌毒素致萎 的能力。研究表明农抗1 2 0 能显著提高西瓜幼苗体内的过氧化氢酶活性，而过氧 化氢酶活性的高低与西瓜抗枯萎病能力成正相关。因此说明农抗1 2 0 是通过提高 植物自身的免疫抗病能力而起到防病治病作用的。 4 7 抑制病菌的某些酶系统 酶是一种生物催化剂，有些酶能被某些抗生素所抑制，使其失去活性。陈国 h ( 1 9 8 2 ) 报道灭孢素就是通过阻碍菌体呼吸系统的三羧酸循环上琥珀酰辅酶a 山东大学硕士学位论文 的脱氢作用，使三羧酸循环上的a 一酮戊二酸不能按正常途径转化为琥珀酸，使琥 珀酰辅酶活性降低。这主要是由于灭孢素具有与琥珀酸相似的构造，能以其一 n h 2 基置换- o h 基和甲氧基的抗菌力，使琥珀酰辅酶a 不能进行脱氢氧化。沈 寅初( 1 9 9 8 ) 报道井冈霉素分子中的井冈胺是一个很强的海藻糖抑制剂，而纹枯病 菌菌丝伸长及许多昆虫飞翔的能源是由海藻糖酶分解海藻糖成为葡萄糖雨供应 的，抑制海藻糖的活性将使纹枯病菌丝不能伸长，昆虫不能飞行。 有些金属离子是某些酶类的组成成分或是酶的活性所必需的。土霉素、金霉 素、四环素、青霉素等都具有与金属离子结合的能力，从而夺取酶上的金属离子， 抑制了病原菌的相关的酶的活性。 4 8 改变病原菌的形态 在农用抗生素中，有的具有改变病菌形态的作用。如春日霉素对稻瘟病菌的 抗菌作用，它能抑制菌丝的正常发育，使菌丝肥大起来，呈畸形发展状态，并且 使菌丝细胞质颗粒化，造成菌丝停止生长，从而达到防治作用。这种抑菌的生化 活性在酸性条件下表现显著，能使抗生素迅速向稻体内浸透渗入，传导至植物各 部，对稻瘟病菌产生强烈的抗菌活性作用。 4 9 阻碍菌体的糖代谢 一般菌体的代谢过程都要经过三羧酸循环，抗霉素是通过阻碍琥珀酸氧化为 延胡索酸，由于这种抑制作用，使菌体不能进行正常的糖代谢，以致造成菌体生 长受到抑制。链霉素也是通过抑制丙酮酸与草酰乙酸的缩合而起到杀菌的作用。 总之，医用抗生素作用机理的研究，导致医用抗生素筛选方法的改良。农用 抗生素作用机理的研究，也将为农抗筛选制定出新的筛选模型。随着农抗作用机 理研究的深入，农抗筛选模型将不断改进和出现新的筛选模型。从而提高筛选的 效率和针对性。同时农抗作用机理的研究，将为农抗的化学合成、分子改造、耐 药性的克服等提供理论指导。 5 放线菌产生抗生素的研究 已知放线菌所产生的抗生物质种类桐当多，占了所有抗生物质f l 勺三分之二 山东大学硕士学位论文 ( h a y a s h i d e ae ta 1 ，1 9 8 8 ；k e i n a t h ，1 9 9 4 ) 依c o o p e r 及