（微生物学专业论文）新型隐球酵母中高亲和性铜转运因子cnctr4的功能鉴定.pdf

摘要 c t r 4 对碳源利用的影响。 当在含有去甲肾上腺素的培养基上生长时， oc t r 4的黑色素形成能力与野生型一致，没有发生明显的变化。而 在以非发酵性碳源为主要碳源的培养基上生长时，oc i r 4菌株的生 长较野生型菌株缓慢，长成小菌落。显然是受到了铜离子含量减少 的影响。 c t r 4 对c u . z n - s o d i 酶活力的影响。 在含有 i r g m l 维生素k的 y n b培养基上进行培养，与野生型的新型隐球酵母相比，oc t r 4的 生长受到很大的抑制。 c t r 4 对英膜厚度的影响。通过倒置显微镜， 观察经过墨汁染色的方 法处理的菌体，ac t r 4 的荚膜明显要比野生型菌体的英膜要小。 c t r 4 对在3 7 下的生长能力的影响。 将梯度稀释过的三株菌在3 7 1c 的培养基上进行培养， 4 - 5 天后， 对比发现， 介 甲 的生长非常缓慢， 长成小菌落。 关键词:新型隐球酵母高亲和性铜转运蛋白 原子吸收光谱 毒性因子 漆酶 英膜 人b s t 门口 ab s t r a c t a s a p a t h o g e n i c f u n g u s 江,ry p t o c o c c u s n e o f o r m a n s c a n i n f e c t t h e c e n t r a l n e r v o u s s y s t e m t o c a u s e m e n i n g o e n c e p h a l i t i s 山 a t i s u n i f o r m l y f a t a l i f u n t re a t e d . t h e o r g a n i s m i s l a r g e l y a n o p p o r tu n i s t i c p a t h o g e n a ff l i c t i n g p a t i e n t s w h o h a v e a c o m p r o m i s e d i m m u n e s y s t e m a s a c o n s e q u e n c e o f h i v i n f e c t i o n , s t e r o i d t h e r a p y , c h e m o t h e r a p y i n c a n c e r p a t i e n t s o r t h e r a p y t o c o m p r o m i s e t h e re j e c t i o n o f t r a n s p l a n t e d s o l i d o r g a n s . h o w e v e r , i t i s a l s o a p r i m a ry p a t h o g e n i n a s m a l l c o h o rt o f p a t i e n t s w i t h n o a p p a r e n t i m m u n e s y s t e m d e f e c t s . r e c e n t l y , r e s e a r c h e r s h a v e f o u n d t h e c o n n e c t i o n s b e t w e e n t h e c o p p e r m e t a b o l i s m s a n d v i r u l e n c e f a c to r s i n c r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s . a s i t i s k n o w n t o a l l , c o p p e r i s a n e s s e n t i a l t r a c e e l e m e n t i n t h e c e l l . v i r t u a l l y , a ll o r g a n i s m s re q u i r e c o p p e r a s a c a t a l y t i c c o f a c t o r f o r b i o l o g i c a l p r o c e s s e s s u c h a s r e s p i r a t i o n , i ro n t r a n s p o r t , o x i d a t i v e s t r e s s p r o t e c t i o n , p e p t i d e h o r m o n e p r o d u c t i o n , p i g m e n t a t i o n , a n d n o r m a l c e l l g r o w th a n d d e v e l o p m e n t . i n o u r r e s e a r c h , w e m a d e a t a r g e t e d k n o c k o u t o f a h i g h a ff in i t y c o p p e r t r a n s p o rt e r c t r 4 g e n e v i a h o m o l o g o u s r e c o m b i n a t i o n . t h e n , w e i n v e s t ig a t e d t h e c o n s e q u e n c e s o f i n t h e v i r u l e n c e f a c t o r b i o s y n t h e s i s a n d o t h e r p h e n o t y p e s . 玩t h i s t h e s i s , w e p r o v e d a c a n d i d a t e c t r 4 m u t a n t w i t h s o u t h e rn b l o t f i r s t w e r e c o n s t i t u t e d 。 a c o m p l e m e n ta ry s t r a in o f a c tr 4 . d u r in g th e f o l lo w in g e x p e r im e n t s , w e c o m p a r e t h e p r o p e r t i e s a n d p h e n o t y p e s o f t h e t h r e e s tr a i n s i n d i ff e r e n t a s p e c t s . t h e r e s u l t s a r e d e s c r i b e d b e l o w . 1 . t h e e x p re s s i o n o f g e n e c t r 4 w a s c o n t r o ll e d 勿t h e l e v e l o f c o p p e r i n t h e m e d i u m . w e e x t r a c t e d t h e t o t a l r n a o f s tr a i n r e s p e c t i v e 卜c u lt u r e d i n c o p p e r d e p l e t i o n , re p l e t i o n a n d n o r m a l c o n d it i o n s . r t p c r s h o w e d t h a t t h e c t r 4 e x p r e s s i o n w a s i n d u c e d i n c o p p e r d e p l e t i o n s it u a t i o n w h i l e n o e x p r e s s i o n o b s e r v e d i n c o p p e r r e p l e t i o n c o n d i t i o n . 2 . t h e ， u p t a k e o f c o p p e r i n m u t a n t w a s i m p a i r e d . u s i n g a t o m ic a b s o r p t i o n s p e c t r u m , w e d e t e r m i n e d t h e c o p p e r u p t a k e f o r t h e s e t h r e e s tr a i n s b y m e a s u r i n g t h e c e l l u l a r c o n c e n t r a t i o n o f c o p p e r . t h e r e s u l t s a r e 2 .0 1 i tg / 1 0 8 c e l ls in h 9 9 ( w i ld ty p e ) , 0 .6 6 p g / 1 o s c e ll i n o c tr 4 a n d 1 .4 1 h g / 1 0 8 c e l ls i n a c tr 4 : : c t r 4 . t h e u p t a k e o f c o p p e r in o c tr 4 d e s e a s e d m c o m p a r e d w i t h th a t o f w i l d t y p e s t r a i n t h e s u b c e l l u a l r l o c a l i z a t i o n o f c t r 4 i n t h e c e l l w a s i n v e s t i g a t e d . i n t h i s r e s e a r c h , w e c o n s t r u c t e d a p l a s m i d - p b s - c t r 4 - g f p w h i c h w a s t r a n s f o r m e d i n t oc n e o f o r m a n s . w e e x a m in e d t h e g f p e x p r e s s i o n i n t h e l a s e r s c a n n i n g c o n f o c a l mi c r o s c o p e a n d f o u n d t h a t t h e fl u o r e s c e n c e g a t h e r e d o n t h e c e l l p e r i p h e ry m e m b r a n e . t h u s , w e c o n c l u d e d t h a t t h e p r o t e i n e n c o d e d b y t h e c t r 4 g e n e o u g h t t o b e a m e m b r a n e p r o t e i n . m e l a n i n p r o d u c t i o n in oc t r 4 h a d n o c h a n g e . t h e m u t a n t s h o w e d a s im i l a r a b i li ty o f p r o d u c i n g m e l a n i n a s t h e wt s t r a i n d o e s w h e n w e c u l t u r e d t h e m i n t h e p r e s e n c e o f n o r e p i n e p h r i n e ( n e ) , t h o u g h ac t r 4 g r o w m o re s l o w l y t h a n wt s t r a i n . t h e f u n c t i o n o f c u , z n - s o d i e n z y m e i n ac t r 4 w a s d e m o l i s h e d . t h e m u t a n t s h o w e d a s e v e re g r o w th d e f e c t o n t h e y n b p l a t e c o n t a i n i n g 1 g g / m l vit a m i n k ( m e n a d i o n e ) c o m p a r e d t o w t a n d t h e c o m p l e m e n t s tr a i n , i n d i c a t i n g o f t h e d e f e c t o f c u , z n - s o d i e n z y m e a c t i v i t y i n c t r 峨 c a p s u l e b i o s y n t h e s i s w a s i m p a i r e d i n ac t r 4 a s m e a s u r e d b y i n d i a i n k m i c ro s c o p y . o c t r 4 s c a p s u l e i s c o n s i d e r a b l y s m a l l e r t h a n wt s . t h e g r o w th r a t e i n 3 7 0c d e c r e a s e d d r a m a t ic a l l y . c e l l w e r e s e r i a l l y d i l u t e d a n d a p p l i e d o n t o y p d a l o n e a t 3 7 -c f o r 4 d a y s . oc t r 4 s h o w e d a tt e n u a t e d g r o w t h a t t h i s t e m p e r a t u r e . k e y w o r d s : c r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s , h i g h a ff in i ty c o p p e r t r a n s p o r t e r , a t o m i c a b s o r p t i o nv i r u le n c e f a c t o r l a c c a s e c a p s u l e 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全了 解南开大学关于收集、 保存、 使用学位论文的规定， 同意如下各项内容:按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本;学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并 采用影印、缩印、 扫描、 数字化或其它手段保存论文; 学校有权提供目 录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务: 学校有权按有关规定向国 家有 关部门或者机构送交论文的 复印件和电 子版; 在不以 赢利为目 的的前 提下，学校可以 适当复制论文的部分或全部内 容用于学 术活动。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 眼落 a 哟 年 ， 月 才 日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名: a al 学位论文作者签名: 谬 t 法 解密时间:年月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下: 内 部 5 年 ( 最长5 年， 可少于5 年) 秘密1 0 年 ( 最长1 0 年， 可少于1 0 年) 机密2 0年 ( 最长2 0 年，可少于2 0年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明: 所呈交的学位论文， 是本人在导师指导下， 进行 研究工作所取得的 成果。 除文中已 经注明引用的内 容外， 本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、 已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的 研究工作做出贡献的其他个人和集 体， 均己 在文中以明确方式标明。 本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学 位 论 文 作 者 签 名 : 31 t c, , 帅年1 月 n日 第一章 前言 第一章 前言 第一节 新型隐球酵母的研究进展 新型隐 球酵母 ( c r y p t o c o c c u s n e o f o r m a n s ) 是一种 致病真菌， 感染中 枢 神经系 统并引 发致命性脑膜炎 1 ,z 3 1 。 新型隐 球酵 母的 主要 受感染者是存在免 疫力缺陷的人群， 通常是h i v感染， 类固醇药物治疗， 癌症，化疗，或者进 行了 器官移植排异反应治疗的人群。 治疗新型隐球酵母感染的药物十分有限， 并且存在毒副作用， 而抗药性也是阻止有效治疗的重要方面。 新型隐球酵母是一种担子菌， 因此在进化上面有别于一些子囊菌， 如模 式酵母， 酿酒酵母( s a c c h a ro m y c e s c e r e v i s i a e ) ， 裂 殖 酵母( s c h iz o s a c c h a r o m y c e s p o m b e ) ，以及其他一些存在于人体的致病真菌，白色念珠菌 ( c a n d i d a a l b i c a n s ) ， 烟曲 菌 ( a s p e r g i l l u s 户 m ig a t u s ) , 英膜组织胞浆菌 ( h is t o p l a s m a c a p s u l a t u m ) , 粗球抱子菌( c o c c id i o i d e s i m m i t is ) ， 卡式肺抱子虫( p n e u m o c ) s t is c a r i n i i ) 。 然而， 新型隐球酵母更接近于其他的担子菌， 如玉米和谷类植物真 菌 病原菌， 玉米黑 粉菌( u s t i l a g o m a y d i s ) 和大 麦坚黑粉菌( u s t il a g o h o r d e i ) , 银耳 ( t r e m e l l a ) 腐木真菌，以 及其他蘑菇 模式菌株， 灰盖鬼伞 ( c o p r i n u s c in e r e u s ) 和白 参( s c h iz o p h y l l u m c o m m u n e ) . 酿酒酵母和新型隐 球酵母在5 亿 年前就己 经独自 进化，因此， 对这两株菌的研究既可以 揭示这两株菌在分子 机制上保守 性，同时也可以查明是什么原因 使得它们之间存在区别. 新型隐球酵母具有一套清晰的生命循环系统， 包括出芽生殖的营养生长 阶段以 及进行 丝状二 型转换1 i 。 在 环境中 新型隐 球酵母 是以 单倍体出 芽生 殖 的方式存在，并且存在两种交配型:a和a 。 在适当的限制营养条件和交配 激素的 作用下， 两 种交配 细胞形成 联合体， 然 后 细胞进行融合5 ,6 ,7 .0 1 。 与模 式 酵母中 核融合立即 发生相反 19 1 ， 在担子菌中 核配 过程被 推迟， 形成的 异核体 会以丝状真菌生存状态存在， 后形成担子，随后在担子表面形成抱子。a 交 配型的细胞也可以对限制氮源的条件和千燥条件做出反应。 mf a 性激素通过 单倍体繁殖的方式进行信号传导和分化， 这一过程中既包括分生菌丝也包括 袍 子 形 成 p o.n l 新型隐球酵母在自 然环境中普遍存在， 但是人们更多的是在鸟类的粪便 第一章 前言 每种物质的原子都具有特定的原 子结 构和外 层电子排列，因 此不同的原 子被激发后， 其电 子具有不同的 跃迁，能 辐射出不同波长光，就是说，每种 元素 都有其特征的 光谱线。由 于谱线的强 度与元素的含量成正比，以 此可 测 定元素的含晕，作定量分析。 当 某种元素被激发后， 核外电 子从基态 e o激发到最接近基态的最低激 发态e 1 叫做共 振激发。当 其又回到e剧一发出的辐射光线即为共振线。而 基态原子吸收共振线辐射也可以从基态上升至最低激发态，由于各种元素的 共振线小相同， 并具有一定的 特征 性， 所以原子吸收仅能在同种元素的一定 特征波长中 观察到，当 光源发射的 某一 特征波长的光通过待测样品的原子蒸 气时，原子中的外层电子将选择性地吸收其同种元素所发射的特征谱线，使 光源发出的 入射光减弱， 可以 将特征谱线因吸收而减弱的 程度用吸光度a表 示，a与被测样品中的待测元素含量成正比;即基态原子的浓度越大，吸收 的 光量就越多， 通过测定吸收的光 量，就 可以求出样品中待测的金属及类金 属物质的含量，对于大多数金属元素而言，共振线是该元素所有谱线中最灵 敏的谱线，这就是原子吸收光谱分析法的原理，也是该法之所以有较好的选 择性可以测定微量元素的根本原因。 1 .4 . 2原子吸收光谱分析仪器 原子吸收光谱分析仪器的原理是通过火焰、石墨炉等将待测元素在高温 或是化学反应作用下变成原子蒸气，由光源灯辐射出待测元素的特征光，在 通过待测元素的原子蒸气时发生光谱吸收，透射光的强度与被测元素浓度成 反比， 在仪器的光路系统中， 透射光信号 经光栅分光，将待测元素的吸收线 与其他谱线分开。 经过光电 转换器， 将光 信号转换成电信号，由 电路系统放 大、 处 理， 再由c p u及外部的电 脑分析、 计算， 最终在屏幕上显示待测样品 中 微量及超微量的多 种金属 和类金属元素的 含量和浓度，由 打印机根 据用户 要求打印报告单。 仪器主要由5 部分组成: 光源、原子化器、光路系统、电路系统、电脑系 统.仪器主要由5部分组成:光源、原子化器、光路系统、电路系统、电脑 系统。 第五节 研究目的和意义 第一章 前言 产 荚 膜担 子菌 酵 母 一新型隐 球酵母 ( c ry p to c o c c u s n e o f o r m a n s ) 是临 床主要 病源真菌之一，过去十多年，对其致病机制的研究取得了较大进展.研究表 明 三种毒性因 子( v i r u l e n c e f a c t o r s ) 对其致病过程至关重要，即:1 . 产生一种 多 酚类氧化酶 ( p o l y p h e n o l i c o x i d a s e - 漆酶( l a c c a s e ) : 2 . 高温下 ( ) 3 7 c ) 的 生 长 能 力 ; 3 . 产 生 高 分 子 多 聚 糖 英 膜 ( c a p s u le ) 。 其 中3 7 下 生 长 是 受 到 与c a z + 信号有关的c a l c i n e u r i n蛋白的影响。但是漆酶以 及英膜直接或者间接的受到 c u 2 + 水平的影响。 漆酶属于铜蛋白， 而铜离子是 漆酶的 一个重要的 激 活子. 通过随机插入突变的方法获得了一株氯离子通道 ( c h l o r i d e c h a n n e l ) 缺失菌 株， 在这个菌株中， 漆酶的活性降低， 颜色变化消失， 而且荚膜也不能生成。 而在另一个突变株内，将铜应答转录因子进行敲除，发现漆酶的活性基本消 失，而英膜却会变大。以上的现象说明，铜离子的内稳态与这两个毒性因子 存在很大的联系。 本次研究的主要对象就是c t r 4塞近 鼠 它负责编码新型隐球酵母体内高 亲和性 转运蛋白 ( h i g h a f f i n ity c o p p e r t r a n s p o rt e r ) ， 而这个蛋白 的 主 要功能 就是 负责将铜离子从体外转运到酵母体内。本次研究的主要目的就是通过同源重 组的方法将新型隐球酵母的c t r 4 基因进行敲除，然后研究在高亲和性铜转 运因子缺失的条件下，新型隐球酵母的毒性因子的变化，从而进一步揭示铜 离子水平对漆酶以及英膜的调控情况。 新型隐球酵母的致病性很强， 感染人群比较广泛， 但是现今的治疗手段不 是很多.由 于铜离子与新型隐球酵母的致病因子之间的密切联系， 所以通过 本实验可以为今后的治疗提供一定的理论基础。而且作为一和研究真核细胞 的模式菌株，研究新型隐球酵母铜离子运输途径对于今后研究真核细胞铜离 子的内稳态有启示作用。 第二章 材料和方法 第二章 材料和方法 第一节 实验材料 2 . 1 . 1菌种 大肠杆菌d h 5 a , c . n e o j o r m a n s h 9 9 ; 2 . 1 . 2质粒 p b c s k ( + / - ) ; c i p 3 , p b s - h y g , 2 . 1 . 3培养基 1 ) 固体l b培养基: 酵母粉 na cl 蛋白脉 蒸馏水 琼脂粉 p h 2 ) 液体l b培养基: 酵母粉 na cl 蛋白膝 蒸馏水 p h 3 ) s o c培养基: 胰蛋白陈 na cl 酵母粉 加去离子水8 0 0 m l , 搅拌溶解后， 加 加去离子水至总体积1 0 0 0 m l , 0 . 1 m p a , 0 . 5 g 1 . 0 g 1 . 0 g 至 1 0 0 m l 1 . 5 g 7 . 4 0 . 5 g 1 . 0 g 1 . 0 g 至 1 0 0 ml 7 . 4 2 0 g 0 . 5 g 5 g 1 0 m l 2 5 0 m m o u l k c l ， 调p h至7 .4 , 1 2 1 灭菌2 0 m i n ， 该溶液在使用前 第二章 材料和方法 加5 m l 灭 菌 后的2 m o l/ l m g c 12 溶液 和2 0 n il 经 过 滤灭 菌的1 m o l/ l 葡 萄 糖溶 液 ( 1 8 g / 1 0 0 m l ). 4 ) 液体y e p d培养基: 酵母粉 葡萄糖 蛋白陈 蒸馏水 p h 5 )固体y e p d培养基: 酵母粉 葡萄糖 蛋白陈 蒸馏水 p h 琼脂粉 6 )固体y p g培养基: 酵母粉 甘油 蛋白 陈 . 蒸馏水 p h 琼脂粉 7 )固体y p e培养基: 酵母粉 无水乙醇 蛋白陈 蒸馏水 p h 琼脂粉 8 )液体a s n 培养基 ( 2 %葡萄糖) 天门冬氨酸 kh2 p o 4 l o g 2 0 g 2 0 g 至 1 l 6 . 0 l o g 2 0 g 2 0 g 至 1 l 6 . 0 2 0 g l o g 3 0 m 2 0 g 至 1 l 6 . 0 2 0 g l o g 2 0 m1 2 0 g 至 1 l 6 . 0 2 0 g gg 内 第二章 材料和方法 990909 1二凡j22 l 991 19292020至1.7559209209红6.2 葡萄搪 蒸馏水 p h 9 )固体a s n 培养基 ( 2 %葡萄糖) 天门冬氨酸 k h 2 p o 4 葡萄糖 琼脂粉 蒸馏水 p h 1 0 )固体a s n + n e培养基 ( 0 . 1 % 葡萄糖) 天门冬氨酸 k h 2 p 氏 葡萄糖 琼脂粉 蒸馏水 去甲肾上腺素 ( n o p h 1 1 ) 麦芽糖培养基 木豆蛋白 陈 酵母粉 麦芽糖 琼脂 蒸馏水 1 2 )液体y n b培养基: y n b( 不含氨基酸硫酸钱) 硫酸钱 葡萄糖 琼脂 蒸馏水 p h 2 . 1 . 4 试剂 至 1 l 6 . 5 1 g 3 g i g 2 0 g 至 1 l l 0 0 m g 6 . 5 第二章 材料和方法 本 实 验所 用限 制 性内 切 酶、 r t a q d n a _聚 合酶、 t 4 d n a 连 接 酶、 d n t p , x / h i n d i i i d i g e s t d n a m a r k e r 、同 位素 标试剂盒r a n d o m p r i m e r d n a l a b e l i n g k it v e r s i o n 2 .0 均购自 大连宝生物工程公司; 质粒小题试剂盒、一步 祛r 1 ， 一 p c r 试剂盒购自 天根 生 化科技 ( 北京) 有限 公司; b i o s p i n e 胶回收 试剂盒、 b i o z o l总r n a提取试剂 购自 杭州博日 生化禾 滋有限公司; 质粒中提试剂 盒、 d e p c购自 博大泰克生化科技有限公司。 r n a s e a酶、 t r i s ,氨节青霉素、氯霉素、 潮霉素b , t r i s 酚、水饱和酚、 牛血清白蛋白组份 v 、十二烷基磺酸钠、琼脂搪、酵母粉、卜天门冬酞胺、 蛋白脉、 大豆蛋白 陈、麦芽搪、y n b均购自 北京鼎国生物试剂有限公司;维生素k , 去甲 肾 上腺素( n o 、 b a t h o c u p r o i n e d i s u l f o n i c a c i d ( b c s ) 试剂 购自s i g m a 公 司。 其余生化及化学试剂购自 生科院库房，均为分析纯。 2 . 1 . 5 引物 p c r引物均由北京奥科生物技术有限责任公司合成，见表2 . 1 . 引物名称 g f p - 5 - b a mh i g f p - 3 - s p e i ct r 4 - rt5 引物序列 gat ccat gagt aaaggagaag tp门七t at aott c at cc at o c g a c c t c t a c ga c a ac g ac ct c c aa aagac gc gcaa t h9 9 - c tr 4 - xb a i h9 9 - ctr 4 - x h o i gagat gt c c c att gcg c t gat a c t r 4 - xh o ct r 4 - xb a tt agccct agtt gt ccctt gtatc t gt cggt gtt aacggt gagc c tr 4 - 3 - b a m h i c tr 4 - 5 - s p e i c c c t gc c g aa c a g c at g t ag g c ac t ag t g at ac tt g t g g c g g ag g at 注: b a m h i 位点 为g g a t c c 妙 i 位 点 为a c t a g t , x b a i 位 点 为t c t a g a , x h o 1 位点为c t c c g a g 2 . 1 .6 仪器 仪器厂家 5 4 1 5 d高速台式离心机e p p e n d o r f t o l - 1 6 g高速台式离心机上海安亭科学仪器厂 第二章 材料和方法 n e o f u g e 2 3 r冷冻离心机 h v e - 5 0 灭菌锅 d y y - 8 c电泳仪及电泳槽 my c y c l e r p c r仪 7 5 2 n紫外分光光度计 h p x - 9 1 6 2 mb e电热恒温培养箱 h l 2 0 0 0 杂交炉一紫外交联仪 c h e m id o c t m x r s凝胶成像系统 b t x电转化仪 原子吸收光谱 l r h - 2 5 0 - z振荡培养箱 s w- c j - z f d超净台 b h 一显微镜 酸度离 子测定仪p h 2 1 i c 水浴锅 力新仪器 hi rayama 北京六一仪器厂 b i o - r a d公司 上海精科科学仪器有限公司 上海博迅科学仪器公司 u v p公司 b i o - r a d公司 b t x公司 广东省医疗器械厂 苏州净化 o l y mp u s公司 h a n n a公司 天津市中环实验电炉有限公司 第二节 实验方法 2 . 2 . 1大肠杆菌质粒提取 1 )从大 肠杆菌平板中挑取一个单菌落， 接种到含有抗生素的5 m l 液体培养 基， 3 7 振荡过夜。 2 )柱平衡步骤: 向 吸附柱c b 3 中( 吸附柱放入收集管中) 加入5 0 0 11 1 的平 衡 液b l , 1 2 , 0 0 0 r p m ( - 1 3 ,4 0 0 x g ) 离 心 i m in ， 倒掉 收 集 管中 的 废液， 将吸附柱重新放回收集管中。 3 )取 1 - 5 m 1 过夜培养的菌液，加入离心管中，使用常规台式离心机， 1 2 , 0 0 0 r p m ( - 1 3 ,4 0 0 x g ) 离心i m i n ， 尽 量吸除上清。 4 )向留有菌体沉淀的离心管中加入2 5 0 r 1 溶液p 1 ( 使用前加入r n a s e a ) , 使用移液器或者漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀是，然后向离心管中就如 2 5 0 11 1 溶液2 ,温和地上下翻转4 -6 次使菌体充分裂解。 第二章 材料和方法 5 )向 离 心 管中 加 入3 5 0 ti 1 溶 液p 3 , 匀， 此时将出 现白 色絮状沉淀。 此时在离心管底部形成沉淀。 立即温和地上下翻转6 -8 次，充分混 1 2 , 0 0 0 r p m (1 3 , 4 0 0 x g ) 离心 l o m i n , 将上清转移至吸附柱 c b 3中， 尽量不要吸出 沉淀，室温放置 1 - 2 m i n , 1 2 ,0 0 0 r p m (1 3 ,4 0 0 x g ) 离 心3 0 - 6 0 秒， 倒 掉收 集管中 的 废 液， 将吸 附 柱重新放回到收集管中。 向吸附柱 c b 3中加入 7 0 0 1 1 1 漂洗液 p w ( 使用前加入无水乙醇)， 1 2 ,0 0 0 r p m (1 3 ,4 0 0 x g ) 离 心3 0 6 0 秒， 倒 掉收 集管中 的 废 液， 将吸 附 柱重新放回到收集管中. 向 吸 附 柱c b 3 中 加入5 0 0 11 1 漂洗 液p w , 1 2 ,0 0 0 r p m ( - 1 3 ,4 0 0 x g ) 离 心 3 0 - 6 0秒， 弃掉收集管中的 废液， 然后重新放回到收集管中，1 2 ,0 0 0 r p m (1 3 ,4 0 0 x g ) 离心2 m i n ，目 的 是 将 吸附 柱中 的 残余的 漂 洗液 去 除 。 将吸附柱 c b 3置于一个干净的离心管中，向吸附膜的中间部位滴加 5 0 - - 1 0 0 u 1 的洗脱缓冲液e b ，室ip n 放置l m i n , 1 2 , 0 0 0 r p m ( - 1 3 ,4 0 0 x g ) 离心2 m i n 将质粒溶液收集到离心管中。 2 .2 . 2大肠杆菌的转化和，组子的鉴定 2 . 2 . 2 . 1 大肠杆菌感受态细胞的制备及电转化 1 )挑 取 单 菌 落 ( d h 5 a 或d b 3 0 1 ) ， 接种 于5 m l l b 培 养基中( 接2 管) ， 3 7 -c , 2 0 0 r p m过夜 2 )第二天早晨转接初培养物( 1 %的转接量) 到2 0 0 m 1 l b ( 5 0 0 n il 三角瓶) ， ( 共5 瓶) ， 3 7 c , 2 0 帅m震 荡 培 养 3 )以 新鲜l b 培养基作为 参比 液测定 培 养物的o d 6 0 0 ，当o d 6 0 0 = 0 .3 5 - 0 .4 时，收集菌体 4 )冰浴菌 液1 5 - 3 0 m i n ( 在任何一步要保 证菌体 温度低于4 c， 离心 机、 离 心 管提前预冷) 5 ) 4 c, 5 0 0 0 r p m , 1 5 m i m离心菌体， 倒去培养液， 用等体积(c 2 0 0 m l ) 冰 冷 第二章 材料和方法 的纯水 ( 超纯水灭菌-a d h 2 0)重悬沉淀 6 ) 4 0c , 5 0 0 0 r p m , 1 5 m i m离心菌体， 倒去培养液， 用1 / 2 体积 ( l o o m ) 冰 冷的1 0 % 甘油重悬沉淀 7 ) 4 1c , 5 0 0 0 r p m , 1 5 m i n 离心菌体， 倒去培养液， 用1 / 5 。 体积 ( i o m l ) 冰 冷的 1 0 % 甘油重悬沉淀 ( 倾倒培养液时要小心，1 0 % 甘油中的细菌沉淀 附着力降低) 8 ) 4 0c , 5 0 0 0 r p m , 1 5 m im离心菌体， 小心倒掉上清液， 尽量吸去残留 液体， 加l m l 冰冷的g y t 培养液重悬沉淀 ( 最好轻柔摇动， 不要用吸管吹打或 振荡) ( 1 l 菌液溶缩3 m l )。 9 ) 1 0 0 倍稀释上 述悬液后 测定o d 6 0 0 。 用冰冷的g y t 培养液将其稀释至浓 度为2 x 1 0 0 - 3 x 1 0 0 个 细胞 / m l ( 1 . 0 o d 6 0 0 = 2 .5 x 1 0 0 个细 胞/ m l ) ， 按照调整好的稀释比例，再稀释感受态细胞。 1 0 )将稀释好的 悬液s o w分装一 管 ( 每一次 转化用感受 态细胞4 0 1 c ) , - 7 0 -c 冰箱保存备用。 1 1 ) 取感受态 细胞( 4 0 匹) 于室 温下溶解后， 转移至冰上， 同时 预冷转化杯。 取1 - 2 匹质 粒d n a加入到感受 态细胞中， 轻轻混匀， 冰上静置5 m i n e 1 2 )将加有d n a 的 感受态细胞悬浮液转移至转化杯中， 轻轻晃动使之落入转 化杯底部， 将转化杯装入电 转化仪的滑动池中， 按照电 转化仪说明调整- 参数，按动操作按钮进行电击. 1 3 ) 迅速加1 m l 预热至3 7 的s o c 溶液，并转移至离心管中，3 7 保温 1 6 0 r p m, 3 0 - 6 0 m i n . 1 4 ) 将培养液涂布于筛选平板上. 2 . 2 . 2 . 2重组子的筛选和鉴定 1 )挑取疑似菌落，转接到加有相 应抗生素的液体培养基中，体积约为1 m 1 , 然后在3 7 过夜培养. 2 ) 1 2 ,0 0 0 r p m 离 心约i m i n ， 弃去 液体培养 基， 尽可能 少的 在离心管 壁留 下 液 体， 沉淀悬于2 0 11 1 预冷的溶液i ( 溶液i : 1 0 m m o l / l t r i s h c i , 1 m m o 1 / 1 e d t a ,高温高压灭菌)中，混匀，室温放置1 - 2 m in . 第二章 材料和方法 3 )加4 0 1 1 1 溶液1 1( 溶液1 1 : 0 .2 m o l / l n a o h , 1 % s d s ， 新鲜配制) 颠倒离 心管2 - 3 次，使溶液充分混匀，直至溶液变清，冰上放置5 m i n e 4 )加3 0 11 1 溶液i i i ( 溶液1 11 : 3 m o l / l k a c . 1 .8 m o u l h a c ) ， 震荡混匀， 室 温放置1 - 2 m i n 后，1 2 , 0 0 0 r p m 、室温离心1 0 m i n . 5 )取1 0 11 1 上清液， 在琼脂 糖 凝胶上 进行点样， 跑胶结束后在凝胶成 像中 进 行观察，寻找在质粒较大的疑似样品进行继续操作。 6 )取 上 清， 再 加 等 体 积 酚 一 氯 仿 ， 颠 倒 混 匀 ， 离 心 1 0 m in . 1 2 0 0 0 r p m ， 反 复 操作两次。加入1 / 1 0 体积的3 . 5 m o u l n h 4 a c ，加入2 . 5 倍体积的预冷的无 水乙醇，- 2 0 保存1 5 m i n . 7 ) 1 2 0 0 0 r p m 离心 5 - 1 0 m i n ， 倒掉上清， 加1 0 0 11 1 7 0 % 乙 醇洗涤， 3 7 1c 温 箱 干燥5 m i n ， 然后溶于1 0 0 11 1 含1 0 n g / w i . r n a s e a 的 t e 中， 在3 7 中消化 半小时，以消除r n a. 8 )苯酚 / 氯 仿 / 异 戊 醇 抽 提 2 次。 上 清加 2 - 3 倍 体 积的 预 冷无 水乙 醇、 1 / 1 0 体 积 的3 m o l/ l n a a c ，- 2 0 c静置i o m i n 以上。 9 ) 1 2 ,0 0 0 r / m in 、 离 心1 5 m i n ， 弃 上 清. 沉淀 用 7 0 % 酒 精 漂 洗， 离 心、 干 燥 后 溶于1 0 - 2 0 匹t e . 1 0 ) 取出 得到的 质粒， 采用合 适的内 切酶进行酶切 验证. 2 .2 . 3 d n a凝胶回收 1 )配0 . 7 % 琼脂糖凝胶， 点 样孔中加入待回收的 d n a 样品， 采用较低的电 压， 电泳结束后，在暗箱中切胶 2 )将含有目 的 d n a 片 段的 琼 脂 糖凝胶切下， 并 放入2 .0 m l 离心管中。 按1 : 3的比例 ( 凝胶质量毫克数: 融胶液体积微升数) 加入e x t r a c t i o n b u ff e r . ( 每次加入的 e x t r a c t i o n b u ff e r 最大体积不宜超过1 .2 m l )。 3 )于 恒温水浴或金属 浴中 5 5 c 孵育， 直到凝 胶融化， 孵育过程中 每隔 2 - 3分 钟混匀一次。 4 )将混 合 液全 部