（植物学专业论文）小羽藓属haplocladium植物遗传多样性及其与环境因子关系分析.pdf

论文题目：小羽藓属( h a p l o c l a d i u m ) 植物遗传多样性及其与环境因子关系分析 学科专业：植物学 学位申请人：李倩影 指导老师：曹同教授 摘要 苔藓植物结构简单，没有真正的根和维管束组织，表面积大，其独特的生理 和代谢特征有利于环境中污染物质在体内的富集，对环境污染有较强的指示性， 被世界各国广泛应用于检测环境，特别是应用于检测重金属污染。以往关于苔藓 的重金属研究主要集中在环境指示、生理生化响应等方面，有关苔藓植物在重金 属污染环境条件下的遗传多样性仅有少数报道。近年来，曹同等筛选出抗污染性 强的小羽藓( h a p l o a d i u m ) ，用于指示上海市的重金属污染和时空变化，取得了 很好效果，为了深入探讨遗传多样性与不同环境因子的相关性，本文以小羽藓为 材料，运用r a p d 技术分析不同环境因子，特别是不同重金属浓度下小羽藓遗传 多样性差异，为深入探讨苔藓植物对环境的指示和响应机理提供科学依据。主要 研究结果如下： ( 1 ) 比较三种提取植物基因组d n a 的方法，得出改良的c t a b 法是提取高 浓度和高纯度的小羽藓植物基因组d n a 的较好的方法。 ( 2 ) 对上海市九个样点的小羽藓植物样品的采集及其植物体内的c d 、c r 、 c u 、p b 、z n 五种重金属元素含量的测定，并对照安丽2 0 0 6 年测定的数据分析发 现，近年来上海市c l l 、c r 、c d 三种重金属的含量有不同程度的增加，p b 、z n 的含量有所减少，其中c r 在三种上升的重金属元素中上升速度最快。增长速率 从快到慢依次为；c r 、o u 、c d ；而z n 含量降低的速率大于p b 。 ( 3 ) 对不同生境( 石生，土生，树生) 的小羽藓植物进行r a p d 分析结果 表现出一定的遗传差异，说明小生境对小羽藓的遗传多样性有一定的影响。 ( 4 ) 在分析小羽藓植物体重金属含量的基础上，利用随机扩增多态d n a 标 记技术对不同浓度重金属污染下的小羽藓居群的遗传多样性和遗传分化进行了 初步分析小羽藓种群表现出较高的遗传多样性。居群闻的变异程度远远大于居 群内的变异程度。将各个样点居群的s h a n n o n 信息指数同重金属含量做相关性分 析得出，s h a n n o n 信息指数的增加同c r 含量呈明显正相关，表明c r 胁迫对小羽藓 种群的遗传分化有较大程度的影响 本研究结果说明小羽藓属植物是指示环境重金属污染的良好指示物种，同时 得出在重金属胁迫环境选择下，小羽藓种群发生了一定程度的分化与微进化，小 羽藓较高水平的遗传多样性可能是植物适应重金属胁迫环境的基础。 关键词：苔藓植物小羽藓重金属污染r a p d 遗传多样性 论文类型：应用研究 s u b j e c e t ：g e n e t i cb i o d i v e r s i t yo fm o s sg e n u sh a p l o c l a d i u ma n di t sr e l a t i o n s h i p 研也t h ee n v i r o n m e n t a lf a c t o r s m a j o r ：b o t a n y a b s t r a c t o w i n gt os i m p l es t r u c t u r ew i t h o u tr e a lr o o t sa n dv a s c u l a rt i s s u e ，l a r g es u r f a c ea r e a , a n dt h eu n i q u ep h y s i o l o g i c a la n dm e t a b o l i cc h a r a c t e r i s t i c s ，b r y o p h y t e sh a v eh i g h a d s o r p t i v ea b i l i t yo fh e a v ym e t a l sa n dh a v eb e e nw i d e l yu s e da s b i o l o g i c a li n d i c a t o r f o rm o n i t o r i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n , e s p e c i a l l yh e a v ym e t a lp o l l u t i o ni nt h ew o r l d m a n yp r e v i o u s s t u d i e sh a v ef o c u s e do ne n v i r o n m e n t a l i n d i c a t o r s ，s u c h 私 p h y s i o l o g i c a la n db i o c h e m i c a lr e s p o n s e ，b u tt h e r ew e r eo n l yf e wr e s e a r c ha n dr e p o r t s o ng e n e t i cd i v e r s i t yo ft h em o s sp l a n t su n d e rh e a v ym e t a lp o l l u t i o n i nr e c e n ty e a r s ， c a oe ta 1 s e l e c t e dt h em o s sh a p l o a d i u ma sag o o di n d i c a t o rt oh e a v ym e t a lp o l l u t i o n a n dt h d rs p a t i a la n dt e m p o r a lc h a n g e sd u r i n gp a s t4 0y e a ri ns h a n g h a i ，a n da c h i e v e d 9 0 0 dr e s u l t s i no r d e rt of u r t h e re x p l o r eo ft h er e l a t i o n s h i p sb e t w e e ng e n e t i cd i v e r s i t y a n dh e a v ym e t a lp o l l u t i o n , w eu s e dh a p l o a d i u ma se x p e r i m e n t a lm a t e r i a lt oa n a l y s e g e n e t i cd i v e r s i t yo ft h em o s sp l a n t su n d e rd i f f e r e n th a b i t a ta n dh e a v ym e t a lp o l l u t i o n c o n d i t i o nb yr a p d t e c h n i q u e t h em a i nr e s e a r c hr e s u l t sa r e 嬲f o l l o w s ： ( 1 ) b yc o m p a r i n gt h r e ek i n d so fm e t h o d so fp l a n tg e n o r n i cd n ae x t r a c t i o n ，t h e i m p r o v e dc t a bm e t h o dw a ss e l e c t e dt ob ea9 0 0 dm e t h o df o rd n a e x t r a c t i o no fm o s sh a p l o c l a d i u m t l u sm e t h o d 啪e x t r a c th i g hc o n c e n t r a t i o n a n dh i 曲p u r i t yd n a ( 2 ) f o r h e a v ym e t a la n a l y s i s ，t h ep l a n ts a m p l e sw e r cc o l l e c t e df r o mn i n ed i f f e r e n t s i t e si ns h a n g h a ia n dt h ec o n t e n t so fc d ，o r , c u , p b ，z ni nt h ep l a t sw e r e d e t e r m i n e db yi c p c o m p a r e dt h ed a t ai n2 0 0 6b ya n ，p r e s e n tr e s u l t ss h o w e d t h a tt h ec u , c r ，c ac o n t e n t si n c r e a s e d ，w i t hi n c r e a s i n gr a t ec r c u c d , w h i l et h ep hz nc o n t e n t sd e c r e a s e d ，w i n ld e c r e a s i n gr a t ez n p b ( 3 ) t h eg e n e t i cd i v e r s i t yo fh a p l o a d i u mf r o md i f f e r e n th a b i t a t sw e r ea n a l y z e db y t h em e t h o do fr a p d t h er e s u l ts h o w e dt h a tp l a n t so fh a p l o c l a d i u mf r o m d i f f e r e n t h a b i t a t sh a v e g e n e t i cd i f f e r e n c e s , i n d i c a t i n g t h a tn i c h eo f h a p l o e l a d i u mh a v es o m ee f f e c to ni t sg e n e t i cd i v e r s i t y ( 4 )b a s e do na n a l y s i so fm e t a lc o n t e n t si nt h ep l a n t s ，u s i n gr a n d o ma m p l i f i e d p o l y m o r p h i c d n am a r k e r s ( r a p d ) ， g e n e t i c d i v e r s i t ya n dg e t i c d i f f e r e n t i a t i o n so ft h ed i f f e r e n tp o p u l a t i o n sw e r ea n a l y z e d t h er e s u l ts h o w e d t h ep l a n t so fh a p l o c l a d i u mh a v eh i l g l l g e t i cd i v e r s i t y t h ed e g r e eo f v a r i a t i o na m o n gt h ed i f f e r e n tp o p u l a t i o n si s 缸g r e a t e rt h a nt h ed e g r e eo f v m a t i o nw i t h i np o p u l a t i o n s c o r r e l a t i o na n a l y s i sb e t w e e nc o n t e n t so fh e a v y m e t a l sa n d s h a n n o ni n f o r m a t i o ni n d e xo ft h ed e f e r e n tp o p u l a t i o n ss h o w e dt h a t i n c r e a s eo ft h es h a n n o ni n d e xw a sp o s i t i v e l yc o r r e l a t e dt oi n c r e a s eo ft h ec r c o n t e n t ( 5 ) t h er e s u l t sd e m o n s t r a t e dt h a th a p l o c l a d i u mi sa9 0 0 di n d i c a t i o ns p e c i e sf o r m o n i t o r i n ge n v i r o n m e n t a lh e a v ym e t a lp o l l u t i o n u n d e rt h eh e a v ym e t a ls t r e s s ， h a p l o c l a d i u mp o p u l a t i o n ss h o w e ds o m ed e g r e eo fd i f f e r e n t i a t i o n a n d m i c r o - e v o l u t i o n t h eh i g hl e v e lo fg e n e t i cd i v e r s i t yo fh a p l o c l a d i u mm a yb e t h eb a s i sf o r t h eh a p l o c l a d i u ma d a p tt oh e a v ym e t a ls t r e s s k e y w o r d s ：b r y o p h y t e s ，h a p l o c l a d i u m , h e a v ym e t a lp o l l u t i o n , r a p d ，g e n e t i c d i v e r s i t y t h e s i st y p e ：a p p l i c a t i o nr e s e a r c h 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了特别 加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成果。其他同 志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了谢j 论文使用授权声明 作者签名：李侑韶 日期：卅口夕7 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即o 学校有权保留送 交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部分内容，可以 采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：杏儒彩 嚣轹中冈 日期：研宇。婶 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 第一章文献综述 本论文小羽藓属( h a p l o c l a d i u m ) 植物遗传多样性及其与环境因子关系分析 属于植物分子生态学的薪研究领域。此外，本研究选取苔藓植物中羽藓科 ( t h u i d i a c e a e ) 的小羽藓属( h a p l o c l a d i u m ) 植物为材料，重点分析不同种的遗传多 样性差异和环境因子，特别是重金属污染与小羽藓遗传多样性的关系。据此，主 要对分子生态学的概念，内容和技术方法以及苔藓植物分子生态学研究进展，用 苔藓植物指示重金属污染的研究动态以及小羽藓属( h a p l o c l a d i u m ) 植物的研究概 况作文献综述。 1 1 分子生态学产生的背景 近2 0 年分子生物学无论是理论上还是技术上取得突飞迅猛的发展，其中利用 分子生物学的理论与方法解决生态学领域问题的过程中，一个崭新的研究领域二 一分子生态学应运而生。1 9 9 2 年，英国生态学学会主办的国际性杂志分子生态 学( m o l e c u l a re c o l o g y ) 的创刊( b u r k e1 9 9 2 ) ，是分子生态学诞生的主要标 志。分子生态学一产生便引起了人们广泛的重视。它作为一门微观基础学科，是 由其他学科发展演化而来。群体遗传学、生态遗传学和进化遗传学这三门分支学 科为分子生态学的形成奠定了基础。其中生态遗传学可能是分子生态学的最直接 来源。 1 1 1 分子生态学概念和主要研究内容 分子生态学是多学科交叉的复合学科，它所覆盖的不少领域的研究早在2 0 世纪 5 0 年代后期开展，并用近4 0 年的时间形成了一个综合的理论、技术、分析体系。 不同的学者从各自不同的研究背景出发，对分子生态学的定义有不同的理解， b u r k e ( 1 9 9 2 ) 等在分子生态学的发刊词中提出的分子生态学的定义为：应 用分子生物学方法为生态学和种群生物学各领域提供革新见解。这个概念注重动 植物和微生物的个体或群体与环境的关系，并认为分子生态学是分子生物学与生 态学有机结合的很好的一个界面。m o r i t z ( 1 9 9 4 ) 认为，分子生态学是用线粒体 d n a ( ( m i t o e h o n d d a ld n a ，m t d n a ) 的变化来帮助和指导种群动态的研究。 b a c h m a n ( 1 9 9 4 ) 把分子生态学定义为运用分子生物学的方法研究生态和种群生 物学的新兴学科。向近敏等( 1 9 9 6 ) 认为分子生态学是研究细胞内的生物活性分 子特别是核酸分子与其分子环境关系的，分子生态学不只是以分子生物技术解 第一章文献综述i ：海大学硕士学位论文 决生态学的问题，而是生态学和分子生物学融合成的一个新学科。目前对分子生 态学概念较为一致的看法是：分子生态学是应用分子生物学的原理和方法来研究 生命系统与环境系统相互作用的机理及其分子机制的科学黄勇平( 2 0 0 3 ) 。 ( m o l e c u l a re c o l o g y ) 杂志界定的所发表有关分子生态学的文章的范围为： 分子环境遗传学：种群生态学及基因流、重组生物体环境释放的生态学问题，自 然环境中的遗传交换；分子群体生物学：种群遗传学和进化遗传学、行为生态 学和保护生物学；分子适应：遗传分化及生理适应、环境对基因表达的效应， 以及一些方法和技术等。这些方面可以理解为分子生物学的主要研究内容，当然， 分子生物学的研究内容不仅仅局限于此，正如s m i t h ( 1 9 9 3 ) 在( m o l e c u l a r e c o l o g y , ) 第二期首卷的社论中解释：分子生态学不是分子技术在生态学问题中 的简单应用，而是代表着一个新兴的学科，具有着生态学和分子生物学相互交叉 的强大活力。 1 1 2 植物分子生态学主要研究方法 目前植物分子生态学的研究方法归纳起来可分为两大类，即蛋白质水平上的研 究和d n a 水平上的研究。 蛋白质水平的研究方法包括蛋白质免疫法和蛋白质电泳法，其中蛋白质电泳 法即同工酶( i s o z y m e ) 分析方法最为常用。该项技术于1 9 7 5 年由a l l a r d 等用于 植物群体的研究，采用这种方法所获得的多位点等位酶资料，可以用来分析基因 的变异情况，并由此可以得出如遗传多样性和遗传分化等一些有价值的理论，但 由于蛋白质的变异力有限、进化速率较缓慢以及采样时通常对个体造成损伤，同 时同工酶电泳技术只能检测编码酶蛋白的基因位点，因此所检测的位点数目也受 现行酶电泳和染色方法所限而不能很多( 最常见的酶系统一般在3 0 个左右) ， 从而阻碍了该技术在许多物种中的有效利用( 周才权，2 0 0 5 ) 。同工酶技术是最早 应用于苔藓植物的遗传标多样性研究的分子标记技术( c r o p b e r gn 1 9 9 7 ；d a n i e l s r e1 9 8 5 ；d e r d a gs1 9 9 0 ：d e r d a gs1 9 9 9 ；w y a t t r1 9 8 9 ) 。目前的研究以d n a 标记的同时，辅以同工酶标记，相互印证，可以更好地揭示生物变异的生态学意 义。 d n a 技术手段是植物分子生态学现阶段的主要研究方法，在研究中占很大 的一部分。d n a 水平上的研究方法包括d n a 分子标记。d n a 分子标记有三种 2 上海师范大学硕士学位论文 第一章文献综述 类型，即细胞核d n a 标记( n u c l e a rd n a ) 、线粒体d n a 标记( m i t o c h o n d r i a ld n a ， 即m td n a ) 和叶绿体d n a 标记( c h l o r o p l a s td n a ，即c p d n a ) 。从功能和组成 特点划分，d n a 分子标记包括编码区( c o d i n gr e g i o n ) 、非编码区( n o n - c o d i n g r e g i o n ) 、微卫星d n a ( m i c m s a t e l l i t ed n a ) 和小卫星d n a ( m i n i s a t e l l i t ed n a ) 等。在苔藓植物分子生态学研究中，经常采用标记基因有n a d 5 ( m t d n a ) 、i t s 序 列( r d n a ) 和r p s 4 、p s b t - h 、t m l f 、t r n g 等叶绿体d n a 基因。细胞核d n a 标 记还包括微卫星d n a 和小卫星d n a 标记( s s r ) 、a f l p 和r a p d 标记。相对 于蛋白质分子标记，d n a 分子标记具有不受环境因素影响、不受基因表达与否 的限制、取样不受组织器官的限制、数量几乎是无限的以及许多是共显性标记等 优点。d n a 水平上的研究方法还包括d n a 杂交、d n a 指纹分析、p c r 法、 d n a 序列分析法等。 1 1 2 1 随机扩增多态性( r a p d ) 随机扩增多态性( r a p d ) 技术是1 9 9 0 年由w i l l i 锄( 1 9 9 0 ) 和w e l s h ( 1 9 9 0 ) 等人利用p c r 技术发展起来的检测d n a 多态性的方法黜心d 技术建立于 p c r 技术基础上，它是利用一系列( 通常数百个) 不同的随机排列碱基顺序的寡聚 核苷酸单链( 通常为l o 聚体) 为引物，对所研究基因组d n a 进行p c r 扩增。扩增 的产物通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，经染色剂染色来检测扩增产物 d n a 片段的多态性。r a p d 实验的基本流程包括d n a 的提取、p c r 扩增、扩 增产物的电泳分离、鉴定与分析。由于r a p d 使用的引物为随机引物，在总基 因组扩增中不需要预先知道总基因组的序列信息。对于任何一个引物，同基因组 d n a 序列有特定的结合位点，如果基因组在这些结合区域发生d n a 片段的插 入、缺失或碱基突变，就有可能导致引物与这些区域的结合位点分布发生相应的 改变。每条r a p d 引物可能会出现多个多态位点或单态位点( h a d r y sh1 9 9 2 ) 。 r a p d 具有以下优点：( 1 ) r a p d 分析只需少量d n a 样品，n g 级水平即可 扩增；( 2 ) 技术简单，检测速度快，不涉及放射自显影等其他技术：( 3 ) 成本较低， d n a 样品不需高度纯化：( 4 ) 不依赖于种属特异性和基因组结构，一套引物可用 于不同生物基因组分析。但同时r a p d 也存在一些缺点：( 1 ) r a p d 标记是显性 标记，不能鉴别杂合子和纯合子；( 2 ) 电泳鉴定时存在共迁移问题。凝胶电泳只 能分开不同长度d n a 片段，而不能分开那些分子量相同但碱基序列组成不同的 d n a 片段；( 3 ) r a p d 技术中影响因素很多，所以实验的稳定性和重复性差。 第一章文献综述 上海大学硕士学位论文 r a p d 对反应条件要求较严，必须对从模板d n a 提取和纯化、r a p d 反应 体系和反应程序以及p c r 产物鉴定的整个实验流程严格标准化，选用适当的引 物，才能获得信息量大、清晰、稳定的扩增结果。 r a p d 技术作为一项成熟的分子标记技术，广泛应用于遗传多样性、连锁图的 构建、物种间亲缘关系、基因定位、辅助选择、种质评估、基因克隆以及杂种优 势研究等领域。 苔藓植物的种数较多，仅次于种子植物，具有丰富的生物多样性，r a p d 技 术在研究苔藓植物的遗传多样性方面也得到了长足的发展。张安世等( 2 0 0 9 ) 藓 为材料建立和优化了苔藓植物的r a p d 反应体系，在此基础上对11 种苔藓植物 进行遗传多样性分析，研究结果表明，通过r a p d 方法得到的聚类分析结果 与传统的形态分类结果基本一致说明了不同标记系统间得的结论有很大的同一 性，同时也说明r a p d 分子标记技术可以较好的运用到苔藓植物的遗传多样性 研究中，具有一定的理论和实际应用价值。 1 1 2 2 限制性片段长度多态性( r f l p ) 限制性片段长度多态性标记( r e s t r i a i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 是由b o s t e i n l 9 8 0 年首先建立并发展起来的一种分子遗传标记。也是最早用于群 体遗传多样性分析的d n a 分子标记技术( n a g a o k at1 9 9 7 ) 。该技术是利用限 制性内切酶位点专一性的特点，指用限制性内切酶切割不同个体基因组d n a 后， 由于目的片段内切酶位点的差异，而表现出来的酶切片段在长度上的差异。这种 差异可以通过特定的探针进行分子杂交，然后放射自显影或荧光标记而显示出 来。 它的技术路线： 4 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 不目个细n a 曲魏 峙_ 一： 蠢材 u l 敝 u 垛i u 蹦h 般 弋l 一- , ；g q i 谳i 一； - - - - 一一- - - - _ 一- 一一- 一一j r f l p 技术的优点：( 1 ) 标记数目可以是无限的：r f l p 揭示的是d n a 水 平自然变异，其数目几乎是无限的。( 2 ) 任何生育期都可预测，不受环境影响： d n a 分子水平标记没有发育阶段或器官的特异性，不受环境条件及基因互作的 影响。( 3 ) 部分标记为共显性：表现r f l p 的位点一般是单一序列，每个位点 通常有两个等位基因( 其显性) 。遵循孟德尔式遗传，因而r f l p 标记图也可用 传统的基因标图方法来构建。( 4 ) 高度变异性：每一植株都会有大量的多态性。 通常只要有一次有性杂交，一个作图群体就能构建一个较丰富的r f l p 图谱：但 r f l p 图谱的可利用程度依赖于其饱和水平，即片段数目和这些片段在染色组分 布水平与所表现出的多态性水平，同时还要求某一多态性特征与某一期望的表现 型相连锁。r f l p 作图计划的目标之一是建立“饱和图 ，所有染色体每隔1 0 2 0 个交换单位( c m ) 就有r f l p 标记，一个饱和图要包含1 5 0 个左右间隔均匀的 标记，即必须用数以百计的探计作图，才有可能达饱和水平，所以这项技术费用 昂贵及放射性同位素标记存在问题，是目前r f l p 技术普遍应用的局限性。但用 生物素或酶标记的d n a 探计，费用将会降低。 5 第一章文献综述j ：海大学硕i ：学位论文 1 1 2 3 简单重复序列( s s r ) 和锚定微卫星( i s s r ) d n a 简单重复序列( s s r ) 也称微卫星d n a ，通常指重复单位的核苷酸长度 为1 - - - 6 个的d n a 序列，如( a t ) n 、( g t t ) n 、( a t i t ) n 等，它以这些单元 组成串联重复，并在真核生物基因组的许多位点广泛分布( t a u ：t zd1 9 8 4 ) 。微 卫星d n a 主要表现为重复单位拷贝数的变化，主要突变机制是复制滑动错位 ( 陀p l i c a t i o ns l i p p a g e ) 。微卫星标记在单个基因位点上可以检测到多达3 0 5 0 个 等位基因( a m o sb1 9 9 3 ) ，在分子生态学中，微卫星d n a 标记越来越广泛的被 应用。在特定位点上按孟德尔方式分离的微卫星d n a 提供了高变的、选择中性 的、共显性的分子标记，这些特点使微卫星d n a 标记可用于植物种问以及种内 居群的大小、个体间的多态性分析。 微卫星d n a 标记的实验流程包括：d n a 分离与提纯、基因组d n a 的限制性 酶切消化与产物的电泳分离、分离片段在滤膜( 或干胶) 上变性与印迹、膜( 或 干胶) 与放射性( 或非放射性) 探针杂合、杂交指纹通过放射学那个自显影或非 放射性途径检测以及最后指纹的比较分析。微卫星d n a 标记的优点在于：( 1 可方便快捷建立s s r 富集文库：( 2 ) 只需设计合成s s r 一侧引物序列( 张增 翠，2 0 0 4 ) ；( 3 ) 实验结果重复性好；( 4 ) 共显性方式遗传；( 5 ) 可以检测 到很高的遗传变异( p a ds2 0 0 0 ) 。它的主要缺点是从基因文库建立一套适合于 某物种的微卫星引物非常耗时而且费用极高。 有关s s r 分子标记在生态学研究中的应用实例，例如r o s s e t t o 等( r o s s e t t o m 2 0 0 4 ) 对雨林濒危植物e l a e o c a r p u sw i l l i a m s i a n u s 的研究，他们分别利用s s r 标记和r a p d 标记研究了7 个位点的1 7 0 个独立的个体，研究结果得出该物种 在多数位点只有单一无性繁殖系，而仅在一个位点上具有两种遗传型。随着p c r 技术的发展和逐渐成熟，基于p c r 的s s r 指纹分析方法应用的更为普遍， z i e t l d e w i c z 等提出了锚定s s r 策略( z i e t l d e w i c ze19 9 4 ) ，这种s s r 指纹实际 上是用改进的s s r 引物来扩增重复序列之间的区域，因此又称i n t e rs s r ，简称 i s s r 。它提供了新的指纹途径，用于物种的分类和系统学比较，推测物种的进 化关系，用于品种鉴定或种群遗传学研究，也是构建遗传图谱的工具( 邹喻苹， 2 0 0 1 ) 。这种方法的实验流程一般包括：s s r 位点的筛选、引物的设计与合成、 p c r 扩增、扩增产物的电泳分离与检测以及标记指纹的分析与数据处理等。i s s r 6 上海师范大学硕士学位论文第一章文献综述 标记的目的序列很丰富，可以得出比r a p d 更丰富的多态性条带( e s s e l m a nej 1 9 9 9 ；f a n gd q1 9 9 7 ) 。i s s r 引物的开发和s s r 引物相比，它不需要测序获 得s s r 两侧的单拷贝序列，开发费用降低。同时i s s r 引物可以在不同的物种间 通用，不像s s r 标记一样具有较强的种特异性，与r a p d 和r f l p 相比，i s s r 揭示的多态性较高，可获得几倍于r a p d 的信息量，精确度几乎可与r f l p 相 媲美( n a g a o k at1 9 9 7 ；t s u m u r ay1 9 9 6 ) ，检测非常方便。 1 1 2 4 测序 在d n a 一级结构水平上检测多态性最直接、最充分的方法是进行d n a 序列 分析，即d n a 测序( d n as e q u e n c i n gt e c h n o l o g y ) 。目前用于测序的技术主要 有s a n g e r 等( s a n g e rf19 7 7 ) 发明的双脱氧链末端终止法和m a x a m 和g i l b e r t ( 1 9 7 7 ) 发明的化学降解法。 s a n g e r 双脱氧链末端终止法是利用2 ，3 双脱氧核苷三磷酸( d d n t p ) 可特 异性终止d n a 链延长的特点实现的。在d n a 合成过程中，在正常d n a 模板、 引物、dn t p 的基础上，利用一种d n a 聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的 引物。直到掺入一种链终止核苷酸为止。每个反应含有所有四种脱氧核苷酸三磷 酸( d n t p ) ，并混入限量的一种不同的双脱氧核苷三磷酸( d d n t p ) 。由于d d n t p 缺乏延伸所需要的3 - o h 基团，使延长的寡聚核苷酸选择性地在g 、a 、t 或c 处终止。使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起 始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳分离大小不同 的片段，凝胶处理后可用x 光胶片放射自显影或非同位素标记进行检测。 m a x a m - g i l b e r t 化学法基本过程为化学试剂处理末段d n a 片段，造成碱基的特 异性切割，产生一组具有各种不同长度的d n a 链的反应混合物，经凝胶电泳分 离。化学切割反应：包括碱基的修饰修饰的碱基从其糖环上转移出去在失去碱基 的糖环处d n a 断裂。 近年来d n a 序列分析除了经典的测序方法在技术环节上有很多新的改进外， 还发展了一些新的d n a 测序方法。目前新发展的d n a 测序方法主要有两大类： 一类被称作“e v o l u t i o n a r yi m p r o v e m e n t ”，即以凝胶电泳分离为基础的d n a 序列 分析技术，如阵列毛细管凝胶电泳法、毛细管凝胶电泳法、超薄层板凝胶电泳法； 一类为“r e v o l u t i o n a r ym e t h o d s ，即直接测序方法，包括质谱法、杂交法、原子 7 第一章文献综述上海大学硕士学位论文 探针显微镜法、流动式单分子荧光检测法等( 郜虹，2 0 0 1 ) 。在分子生态学研究 过程中，往往将d n a 序列分析与其他多种手段技术相结合，来寻求问题的答案。 几种常见分子标记特点归纳见表： r f l p ( 限制性 标记名 r a i d ( 随即扩 s s r ( 微卫星i s s r ( 锚定 同工酶分析片段长度多态 称增多态性)分析)微卫星) 性) 限制性内切酶 细胞内酶和使用特定使用带有锚 使用随t i p j 1 物 消化整个基因 蛋白质p c r 引物扩定序列的的 方法程( 一般l o b p )组，然后以特 进行凝胶电增核或细胞引物扩增微 序在整个基因组定d n a 片段为 泳和组织器中的卫星卫星序列或 中进行扩增探针进行分子 化学染色d n a 序列侧接区域 杂交 核心技 电泳电泳及p c r电泳分子杂交电泳及p c r电泳及p c r 术 以2 一，3 一， 探针或 4 一核苷酸为 特定序列d n a 引物来9 - 1 0 随l l p z 3 1 物特异引物基元的不同 探针 源 的重复次数 作为引物 技术难 中较高中高较高 度 多态性 中等较高中等高高 水平 可靠性中中 高 高 高 8 上海师范大学硕： ：学位论文第一章文献综述 1 2 苔藓植物分子生态学研究进展 苔藓植物是高等植物中的一个以孢子进行繁殖，配子体发达并在生活史中占优 势的重要类群。全世界记录苔藓植物1 9 1 科，8 5 4 属，大约2 1 ，0 0 0 种。中国是 苔藓植物最丰富的国家，有苔藓植物1 2 5 科，5 7 2 属，3 4 6 0 种，分别占世界科属 和种的6 5 4 ，4 6 4 和1 6 3 ( c a oe t 以2 0 0 6 ) 在植物界的系统演化中，苔藓代 表着从水生生活逐渐过渡到陆生生活的类型。在植物界的系统演化中，代表着从 水生生活逐渐过渡到陆生生活的类型。苔藓植物分布广泛，热带雨林、沼泽、荒 漠等恶劣环境，甚至南极洲都有苔藓植物的踪迹，几乎遍及世界的各个角落。苔 藓植物又是环境变化良好的指示物，由于其没有真正的根和维管束组织，表面积 大，对环境的反应灵敏度是种子植物的1 0 倍，所以常被用为环境变化的指示物。 随着工商业的发展，大气污染日益严重，使得一些常见的苔藓植物变得十分稀少， 甚至有些种类的苔藓植物已经灭绝，传统的研究苔藓植物生物多样性及其功能的 方法很难对其进行深入的研究，现代分子生态学的研究方法和技术的引入为研 究苔藓植物注入了新的力量，促进了近年来苔藓植物各个方面的深入研究。 1 2 1 种群遗传多样性研究 研究物种及种群的遗传多样性是植物分子生态学的重要研究内容之一。苔藓 植物具有丰富的遗传多样性，地钱( m a r c h a n t i a p o l y m o r p h a ) 是第一个被测定叶绿 体基因核苷酸序列的植物( o h y a m ak e ta 1 9 8 6 ) 。2 1 世纪以来苔藓植物遗传多 样性酶学方面的研究承接成熟的技术得到进一步发展。c r o n b c r g ( 2 0 0 0 ) 对来 自欧洲前冰川期和非冰川期的三个主要区域的附生苔藓植物白齿藓( l e u c o d e n s c i a r o i d e s ) 进行了酶学方面的研究，得出前冰川期的白齿藓遗传变异性较差， 物种容易受大气污染影响而逐渐消失。t h i n g s g a a r d ( 2 0 0 1 ) 用同工酶电泳法研究了 泥炭藓( s p h a g n u ma 妒n e ) 的1 9 个种群的遗传多样性，a m o v a 分析结果表明， 此种在洲际间没有明显的分化，并且随着纬度的增加，遗传多样性有明显的减少 趋势。c r o n b e r g 和n a t c h e v a 等( 2 0 0 2 ) 结合同工酶标记法和形态学观察研究了瑞 典南部四个种群的两种泥炭藓( s p h a g n u mc a p i l l i f o l i u m 和& q u i n q u e f a r i u m ) ，在 其中三个种群中均发现重组体，说明有杂交现象。同年c r o n b e r g ( 2 0 0 2 ) y 用同工 酶的方法研究了波罗的海岸高地上塔藓( h y l o c o m i u ms p l e n d e n s ) 的遗传分化 和遗传变异情况。b u c z k o w s k a ( 2 0 0 4 ) 采用同工酶方法对波兰和德国2 4 个种群的 第一章文献综述上海大学硕士学位论文 护蒴- 苔( c a l y p o g e i a $ s s a ) 进行了研究，分析它们的亲缘关系，其中来自波兰和德 国的并为一支，波兰的另一个类群归为一支。 近十年来，随着d n a 技术的不断发展和完善，从d n a 水平上对苔藓植物 的物种及种群的遗传多样性研究也取得了长足的进展。v e l d e 等( 2 0 0 1 ) 用微卫星 标记技术研究了台湾金发藓( p o l y t r i c h u mf o r m o s u m ) 的无性系结构及其亲子关 系，得出台湾金发藓有较高的基因型多样性的结论。s k o t n i c k i 等( 2 0 0 2 ) 利用r a p d 和d n a 测序技术研究发现黄丝瓜藓( p o h an u t a n s ) 有较低水平的遗传多样性。 w i l s o n 等( 2 0 0 3 ) 用微卫星标记的方法研究了生境遭到破坏的和没有破坏的大金 发藓自然种群，研究结果表明完全被破坏的泥炭藓沼泽的大金发藓( p o l y t r i c h u m c o m m u n e ) 种群遗传多样性的值( o 7 2 9 ) 比没有遭到破坏的泥炭地低( o 8 8 0 ) 。， 认为受破碎生境的影响，基因漂流已经影响泥炭地苔藓植物的遗传多样性。 n i n h a m 等( 2 0 0 4 ) 用r a p d 技术和d n a 测序技术对南极大陆、亚南极赫德岛、 麦夸里岛和大洋洲四个区域的角齿藓( c e r a t o d o n p u r p u r e u s ) 遗传多样性进行了 研究。结果表明。亚南极赫德岛、麦夸里岛和南极大陆三个区域的角齿藓种群有 较高的遗传多样性。d n a 测序表明，a n t a r c t i c a 的跨海区域的种群跟c a s c y 和麦 夸里岛的种群关系最为接近，来自赫德岛的一个群体跟欧洲的一个群体最为接 近。同年，s k o t n i c k i 等( 2 0 0 4 用r a p d 方法和d n a 测序调查了南极地区苔藓 植物的遗传多样性。h a s s e l ( 2 0 0 5 ) 等于2 0 0 5 年采用i s s r 技术比较了瑞典高山 区域的齿边小金发藓( p o g o n a t u md e n t a t u m ) 种源群落和低洼区域的新移入种群 的遗传差异，遗传变异的指数表明，两个区域的种群有相似的遗传多样性。s h a w 等( 2 0 0 5 ) 通过全球多样性分子数据分析苔藓植物在全球分布的多样性，得出苔 藓植物在南半球的多样性较高，北半球较低，热带地区处于中间水平的结论。 z a r a n a n 等( 2 0 0 6 ) 采用a f l p 技术对扁萼苔( r a d u l a f l a c c i d a ) 进行研究，认为 实验性的破碎生境增加了连锁不平衡但是不影响遗传多样性和种群结构。近年来 我国苔藓植物工作者在苔藓植物的遗传多样性研究方面也开展了工作。侯义龙、 曹同( 2 0 0 4 ) 选用1 5 种东北藓类植物进行r a p d 分析，结果从分子水平上进一 步验证了1 5