（植物学专业论文）水稻硫酸盐转运蛋白ossultr11基因功能的研究.pdf

l 一 关于学位论文使用授权的声明 本人同意学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的印刷 件和电子版，允许论文被查阅和借阅；本人授权山东大学可以将 本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采 用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：衄导师签名：盔銎缱日 期：翌丝兰：兰2 iii11 81 l 1 ：! 4 5 ! ； ； 9 l2 1 2 1 4 2 依赖于硫的调控1 3 1 4 3 碳与氮的供给对硫酸盐调控的影响1 5 1 4 4 硫酸盐吸收的转录后水平调控1 7 1 4 5 硫响应基因信号转导途径的研究1 8 1 5 本研究的目的及意义2 2 第二章材料与方法2 4 2 1 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ；1e d n a 全长的克隆2 4 2 1 1 材料2 4 2 1 2 实验方法2 6 2 2 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ；1 的基因表达分析3 0 2 2 1 材料3 0 2 2 2 实验方法31 2 3 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ：1 的亚细胞定位3 3 2 3 1 材料3 3 2 3 2 实验方法。3 3 2 4 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ：l 在酵母中的表达3 7 2 4 1 材料。3 7 2 4 2 实验方法3 9 2 5a m i r n a 载体的构建4 3 2 5 1 材料4 3 2 5 2 实验方法4 6 2 6o s s u l t r l ；1p r o m o t e r - g u s 载体的构建及水稻愈伤组织的农杆菌转化5l 2 6 1 材料5l 2 6 2 实验方法5 2 第三章结果与分析5 5 3 1 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ；1c d n a 全长的克隆5 5 3 1 1o s s u l t r l ；1c d n a 全长的克隆5 5 3 1 2o s s u l t r l ；1c d n a 全长的测序结果5 6 3 2 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ；l 的基因表达分析5 7 3 2 1 无硫胁迫条件下o s s u l t r l ；1 基因的表达分析5 7 3 2 2 低硫胁迫条件下o s s u l t r l ；1 基因的表达分析5 8 3 3 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ：1 的亚细胞定位5 8 3 3 1o s s u l t r l ；1 丌放阅读框序列的高保真扩增5 9 山东大学硕十学位论文 3 3 2u b i ：o s s u l t r l ；1 g f p 重组表达载体的验证 3 3 3u b i ：o s s u l t r l ；1 g f p 在洋葱表皮细胞中的瞬时表达 3 4 水稻硫酸盐转运蛋白o s s u l t r l ：1 在酵母中的表达 3 4 1o s s u l t r l ；1 开放阅读框序列的高保真扩增 3 4 2o s s u l t r l ；1 p y e 2 2 m 重组表达载体的验证 3 4 3 酵母重组子鉴定 3 4 4 酵母突变株的功能互补表达结果 3 5a m i r n a 载体的构建及水稻愈伤组织的农杆菌转化 3 5 1a m i r n a 目的片段的克隆 3 5 2 重组表达载体的验证 3 5 3 阳性质粒转化农杆菌后的菌体p c r 验证 3 5 4 水稻愈伤组织的农杆菌转化 3 6o s s u l t r l ；1p r o m o t e r - g u s 载体的构建及水稻愈伤组织的农杆菌转化6 7 3 6 1o s s u l t r l ；1 启动子序列的克隆6 7 3 6 2 伪舰l t r l ；1p r o m o t e r - g u s 重组表达载体的验证6 8 3 6 3o s s u l t r l ；1p r o m o t e r - g u s 重组表达载体转化农杆菌后的验证6 9 3 6 4 水稻愈伤组织的农杆菌转化。7 0 第四章讨论7 1 参考文献7 4 致谢8 4 山东人学硕十学位论文 中文摘要 硫是植物生长必需的中量营养元素，主要s 0 4 2 形式被植物根系从土壤中 吸收，参与含硫氨基酸、蛋白质、维生素和多种次级代谢产物的合成，并对植物 的生长、解毒、防卫和应对各种生物及非生物胁迫方面起重要调节作用。 植物依靠根细胞质膜上的质子硫酸盐协同运输体来吸收土壤中的硫酸盐， 这是硫酸盐吸收的第一步，是由第一亚族的高亲和性硫转运体介导完成的。 水稻是全世界最重要的粮食作物之一，也是我国的主要粮食作物。随着分子 生物学技术的飞速发展和水稻基因组测序的完成，水稻成了单子叶植物基因组研 究的模式植物。研究水稻硫酸盐转运蛋白在硫酸盐运输过程中的功能及调控机制 对深入认识硫在作物生长发育、产量及品质等方面的作用，进而改良作物的硫缺 乏，降低土壤缺硫对作物的危害具有重要意义。 本研究克隆了水稻硫酸盐转运蛋白基因伪勋l t r l ；1 的全长c d n a 序列，全长 为1 9 8 9 b p 。半定量r t p c r 分析表明，硫缺乏条件下o s s u l t r l ；1 在根部特异性 表达，而且其表达受到硫缺乏的诱导，表达量随着缺硫胁迫时间的延长而逐渐增 加；低硫限制条件下，o s s u l t r l ；1 在根部的表达与环境中硫酸盐浓度负相关，其 表达量随着应答培养液中硫酸盐浓度的降低而逐渐上升。利用基因枪技术，将 u b i ：o s s u l t r l ；1 g f p 重组表达载体转化到洋葱表皮细胞进行瞬时表达分析，发现 g f p 信号集中在细胞质膜上，说明o s s u l t r l ：1 是一种定位于细胞质膜的转运蛋白。 将o s s u l t r l ；1 的开放阅读框序列( o r f ) 连接到酵母表达载体p y e 2 2 m 中，获得 重组表达载体o s s u l t r l ；1 p y e 2 2 m ，并转化自身硫酸盐转运系统缺失的酵母突变 菌株c p l 5 4 7 a 进行酵母功能互补验证，结果发现o s s u l t r l ：l 在低浓度硫酸盐营 养条件下能够拯救突变体的缺陷表型，说明o s s u l t r l ；1 具有硫酸盐转运的功能， 暗示o s s u l t r l ；1 是一种高亲和性水稻硫酸盐转运蛋白。同时，构建了o s s u l t r l ；1 p r o m o t e r - g u s 表达载体，可用于后续的伪勋l t r l ；1 组织器官表达定位分析。 关键词：水稻；硫酸盐转运蛋白；o s s u l t r l ；1 ；功能分析 山东大学硕上学位论文 a b s t r a c t s u l f u ri sa ne s s e n t i a lm a c r o n u t r i e n tf o rp l a n t sw h i c h ，p l a y sc r u c i a lr o l e si nt h e p r o c e s so fg r o w t hr e g u l a t i o n ，d e t o x i f i c a t i o n ，d e f e n c ea n dr e s p o n s et ov a r i o u sa b i o t i c a n db i o t i cs t r e s s e s ，a n di sa l s or e q u i r e df o rt h eb i o s y n t h e s i so fs e v e r a ls - c o n t a i n i n g a m i n oa c i d s ，p r o t e i n s ，v i t a m i n sa n da v a r i e t yo fs e c o n d a r ym e t a b o l i s mp r o d u c t s s u l p h a t ei st h em a j o rf o r mo fs u l p h u rt h a tp l a n t sc a na b s o r bf r o mt h es o i l p r o t o n s u l p h a t ec o t r a n s p o r tw h i c h m e d i a t e db yt h eg r o u p1h i g h - a f f i n i t ys u l f a t e t r a n s p o r t e r si nt h ep l a s m am e m b r a n eo fr o o tc e l l si st h ef i r s ts t e pf o rt h eu p t a k eo f s u l p h a t ef r o mt h ee n v i r o n m e n t r i c ei so n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf o o dc r o p si nt h ew o r l d ，e s p e c i a l l yi nc h i n a , a n di th a sa l s ob e c o m eam o d e lp l a n tf o rm o n o c o tc e r e a lg e n o m er e s e a r c ha n d m o l e c u l a rb r e e d i n g ，w i t ht h e c o m p l e t i o no fw h o l eg e n o m es e q u e n c i n ga n d d e v e l o p m e n to fb i o t e c h n o l o g y t h ec h a r a c t e r i z a t i o no fs u l f a t et r a n s p o r t e r sa n da b e t t e ru n d e r s t a n d i n go ft h e i rr e g u l a t i o nm e c h a n i s m su n d e r l y i n gs u l f u ri n e f f i c i e n c y w i l lb eh e l p f u lf o ri n v e s t i g a t i n gt h er o l e so fs u l f u rn u t r i e n ti nd e v e l o p m e n t ，y i e l da n d q u a l i t y o fc r o p s ，a n da l s ow i l lp r o v i d er e s o u r c ef o rg e n e t i ci m p r o v e m e n to f c r o p s i nt h i sw o r k ，t h e19 8 9 b po f f u l l l e n g t hc d n as e q u e n c eo fo s s u l t r l ；1w a sc l o n e d f r o mr i c er o o t s e m i - q u a n t i t a t i v er t - p c ra n a l y s i si n d i c a t e dt h a tt h eo s s u l t r l ；1g e n e s p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di nt h e r o o to ft h ep l a n ta n dt h ea b s e n c eo fs u l p h u ri n c r e a s e dt h e e x p r e s s i o no fo s s u l t r l ；1 ；t h em r n aa b u n d a n c e ss h o w e dl i n e a rr e l a t i o n s h i pw i t ht h e p e r i o do fs u l p h u ra b s e n c e m o r e o v e r ，t h ee x p r e s s i o no fo s s u l t r l ；1s h o w e dn e g a t i v e c o r r e l a t i o nw i t ht h ec o n c e n t r a t i o no fs u l f a t ea n dt h ea b u n d a n c eo fo s s u l t r l ；1m r n a w a sg r a d u a l l yi n c r e a s e df o l l o w i n gt h ed e c r e a s eo fs u l f a t ec o n c e n t r a t i o ni nm e d i u m t h et r a n s i e n te x p r e s s i o na n a l y s i so fu b i ：o s s u l t r l ；1 - g f pi no n i o ne p i d e r m a lc e l l s u s i n gt h eb i o l i s t i cb o m b a r d m e n tt r a n s f o r m a t i o nm e t h o di n d i c a t e dt h a tt h eg f ps i g n a l o ft h ef u s e dp r o t e i nw a s m a i n l yv i s u a l i z e do nt h ep l a s m am e m b r a n e ，w h i c hs u g g e s t e d t h a to s s u l t r l ；1i sap l a s m am e m b r a n e - l o c a l i z i n gt r a n s p o r t e r i no r d e rt oe l u c i d a t et h e i nv i v of u n c t i o no fo s s u l t rl ；1 ，w ec o n s t r u c t e day e a s tr e c o m b i n a n te x p r e s s i o nv e c t o r 2 山东大学硕上学位论文 o s s u l t r l ；1 一p y e 2 2 ma n dt r a n s f o r m e di ti n t ot h ey e a s t ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) m u t a n tc p15 4 7 aw h i c hd e f e c t ss u l f a t e t r a n s p o r t i n gs y s t e m f o rf u n c t i o n a l c o m p l e m e n t a t i o na n a l y s i s t h er e s u l t ss h o w e dt h a to s s u l t r l ；1w a sa b l et o c o m p l e m e n tt h el o s so fs u l f a t eu p t a k ea c t i v i t yo fc p15 4 - 7 au n d e rl o ws u l f a t e c o n c e n t r a t i o n ，w h i c hp r o v e dt h a to s s u l t r l ；1c o u l da c ta sah i g ha f f i n i t ys u l f a t e t r a n s p o r t e ri nr i c e w ea l s oc o n s t r u c t e dao s s u l t r l ；1p r o m o t e r - g u se x p r e s s i o nv e c t o r f o rf u r t h e re x p l o r a t i o no ft h et i s s u el o c a l i z a t i o no ft h i sp r o t e i n k e yw o r d s ：r i c e ；s u l f a t et r a n s p o r t e r ；o s s u l t r l ；1 ；f u n c t i o n a la n a l y s i s 3 山东大学硕上学位论文 符号说明 a b b r e v i a t i o n s 2 , 4 一d a b a a p r a p s a t p s c y s d t t d e p c e d t a e b g f p g s h g u s i a a m o p s o a s o a s t l p e g 丫- e c s 印m r t p c r s a t s i r s o t t - d n a s 4 e n g l i s hn a m e 中文名称 2 , 4 一d i c h l o r o p h e n o x y a c e t i ca c i d 2 , 4 - 二氯苯氧乙酸 a b s c i s i ca c i d 脱落酸 a p sr e d u c t a s ea p s 还原酶 a d e n o s i n e 一5 - p h o s p h o s u l f a t e 腺嘌呤5 磷酸硫酸 a t p s u l f u r y l a s e a t p 硫酸化酶 c y s t e i n e 半胱氨酸 d l d i t h i o t h r e i t o l二硫苏糖醇 d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e焦碳酸二乙脂 e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d 乙二胺四乙酸 e t h i d i u mb r o m i d e 溴化乙啶 g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n绿色荧光蛋白 g l u t a t h i n e谷胱甘肽 1 3 - g l u c u r o n i d a s e 。 d 葡萄糖苷酸酶基因 i n d o l e 3 a c e t i ca c i d吲哚乙酸 3 - m o r p h o l i n ep r o p y ls u l p h o n i ca c i d 3 一吗啉丙磺酸 o a c e t y l s e r i n e o 乙酰丝氨酸 o a c e t y l s e r i n et h i o l l y a s e o 一乙酰丝氨酸硫醇裂解酶 p o l y e t h y l e n eg l y e o l 聚乙二醇 1 , - g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e f - 谷酰半胱氨酸合酶 r e v o l u t i o np e rm i n u t e每分钟转数 r e v e r s et r a n s c r i p t i o np c r反转录p c r s e r i n ea c e t y l t r a n s f e r a s e丝氨酸乙酰基转移酶 s u l f i t er e d u c t a s e亚硫酸盐还原酶 s u l f o t r a n s f e r a s e磺基转移酶 t r a n s f e r r e dd n a转移d n a t r i ( h y d r o x y m e t h y l ) 一a m i n o m e t h a n e 三羟基氨基甲烷 ( l e g g e t ta n de p s t e i n1 9 5 6 ) 。自然界中的硫大多数以还原态存在，因此，在植物的 生长过程中经常会出现硫酸盐的缺乏。为了应对这些环境胁迫，植物从土壤中吸 收微摩尔浓度的硫酸盐，并在细胞中将其浓缩至毫摩尔浓度，以满足植物生长发 育的需要。很多植物生理学和分子学研究证明大多数高等植物中存在高亲和性和 低亲和性的硫酸盐转运体以完成植物根对硫酸盐的吸收( s m i t h e ta 1 1 9 9 5 a ；s m i t h e ta 1 19 9 7 ；t a k a h a s h ie ta 1 19 9 7 ；t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 0 ；h a w k e s f o r d2 0 0 3 ) 。 大量实验研究发现，无论是土壤中硫酸盐的吸收，还是细胞内硫酸盐的运输 都离不开硫转运蛋白的作用，因而，硫转运蛋白的表达会直接影响整个植物中硫 的生物学作用( s u n a r p i1 9 9 6 ；f i t z g e r a l de ta 1 2 0 0 1 ：t a b ea n dd r o u x2 0 0 1 ) 。 1 1 植物硫吸收同化途径概述 随着对拟南芥基因组测序的完成，拟南芥变成了研究硫吸收的模式植物，在 分子克隆中长期被使用( h e l le ta 1 1 9 9 4 ；s e t y ae ta 1 1 9 9 6 ；n o j ie ta 1 1 9 9 8 1 。实验 结果表明在拟南芥中硫吸收途径具有高度的复杂性。在所有参与硫吸收途径的蛋 白中研究最清楚的是硫转运蛋白家族( y o s h i m o t oe ta 1 2 0 0 3 ；k a t a o k ae ta 1 2 0 0 4 a ； k a t a o k ae ta 1 2 0 0 4 b ) 。研究结果表明，每一个硫转运蛋白都具有特殊的定位、对 硫酸盐的亲和性差异以及不同的调控特点，说明它们具有不同的生物学功能。 对于植物而言，主要的硫源是无机硫酸盐，但是植物也可以利用大气中还原 态的硫复合物，例如二氧化硫和硫化氢( l e u s t e ke ta 1 2 0 0 0 ) 。硫转运体对细胞和 植物中硫的吸收和分布是以整体的形式进行的。 细胞内的硫酸盐会进一步代谢形成大量不同的初级代谢产物和次级代谢产 物。为了同化形成半胱氨酸，硫酸盐必须运输到质体内，通过腺苷化作用形成腺 5 a 1 2 0 0 0 ；k o p r i v aa n dk o p r i v o v a2 0 0 3 ) 。s a t 和o a s t l 在半胱氨酸的合成中形成 多酶复合体( h e l le ta 1 2 0 0 2 ) 。半胱氨酸可以直接参与蛋白质和多肽形成，例如谷 胱甘肽( g s h ) ，它是最丰富的低分子量硫醇，在植物防御压力、氧化还原调控 和硫储存与转运多方面具有功能。另外，半胱氨酸还可以进一步参与代谢，作为 还原态硫的供体合成甲硫氨酸、铁硫簇、多种辅酶和次级代谢产物。硫酸盐同 化途径的中间产物亚硫酸盐可以代谢形成叶绿体膜的必需成分硫酸酯( s a n d ae t a 1 2 0 0 1 ) 。硫酸盐的还原只存在于质体中，但是半胱氨酸在蛋白质合成的三个场 所：质体、线粒体和液泡中都可以合成( l e u s t e ke ta 1 2 0 0 0 ) 。 硫在植物代谢中也以氧化态的磺基形式存在，修饰碳水化合物、蛋白质和很 多自然产物。已知的大部分硫酸盐代谢产物在植物抵御生物和非生物胁迫方面起 着不同的作用。一个研究较深入的化合物就是芥子甙，其在芸苔中参与抵御草食 动物和病原体( m i k k e l s e ne ta 1 2 0 0 2 ) 。该化合物对十字花科蔬菜的味道起一定作 用，而且它的降解产物异硫氰酸酯具有抗癌的活。 生( f a h e ye ta 1 2 0 0 1 ；m i t h e n 2 0 0 1 ) 。另一种在药用方面具有作用的大基团硫酸盐复合物是硫酸盐类黄酮，有 2 5 0 多种，分3 2 个家族( b a r r o ne ta 1 1 9 8 8 ) ，它们参与活性氧的解毒和植物生长 的调控( v a r i ne ta 1 1 9 9 7 ) 。另外几种硫酸盐复合物直接参与植物对病原体的防御， 例如在拟南芥中鉴别的由硫酸盐派生而来的茉莉酸( g i d d ae ta 1 2 0 0 3 ) ，以及硫酸 盐d 1 ，3 葡聚糖( m e n a r de ta 1 2 0 0 4 ) 。磺基基团的转移，例如硫酸盐化作用，是 由磺基转移酶( s o t ) 催化的( k l e i na n dp a p e n b r o c k2 0 0 4 ) 。s o t 的反应需要3 磷酸腺苷57 磷酰硫酸( p a p s ) 作为硫酸盐的供体，需要一个有自由羟基的复合 物作为受体。在高等真核生物中发现了很多s o t 的亚型，因为它们的硫酸盐基 团受体的结构是不同的( k l e i na n dp a p e n b r o c k2 0 0 4 ) 。p a p s 的合成是由a p s 激酶 催化的a p s 的磷酸化( 见图1 1 ) 。在质体中a p s 可以从最初的硫酸盐同化途 6 图1 1 植物硫同化吸收途径 合成途径， s i r 只存在 1 ) 。 最近的研究为硫酸盐同化途径又增添了一个复杂性。第一，在植物中发现了 将亚硫酸盐氧化为硫酸盐的亚硫酸盐氧化酶( e i l e r se ta 1 2 0 0 1 ) 。这个酶参与动物 线粒体中含硫代谢物的分解( k i s k e re ta 1 1 9 9 7 ) 。在植物中，该酶位于过氧化物酶 体中，虽然在硫酸盐同化途径中分离到了该酶，但是它的功能还是未知的( y o w a k e ta 1 2 0 0 4 ) 。第二，在小立碗藓中发现了在酵母、真菌和肠细菌中将p a p s 还原 为亚硫酸盐的p a p s 还原酶( k o p r i v ae ta 1 2 0 0 2 a ) 。 e d n a 序列的可获得性使得我们可以方便地在分子水平上进行拟南芥中硫酸 盐代谢的研究。许多报道强调了硫酸盐同化基因m r n a 积累的改变；例如 t a k a h a s h i 等研究表明2 天的硫酸盐缺乏可以强烈地诱导低亲和性的硫转运蛋白 a t s u l t r 2 ；1 和a p r 与s a t 的一个亚型( t a k a h a s h ie ta 1 1 9 9 7 ) ，h a r a d a 等证明硫酸盐 的吸收受到荣莉酮的调控( h a r a d ae ta 1 2 0 0 0 ) 。但是，还是需要在酶活性、m r n a 、 7 蛋白质、代谢产 验是用光来控制 规律：在光照4 d 活性的改变涉及 主要在转录水平 水平对a p r 活性的调控( b i c ke ta 1 2 0 0 1 ) 。上述这些实验的焦点都是a p r ，因为这 个酶长期受到不同环境因子、营养和胁迫的调控( b r u n o l d1 9 9 0 ) 。研究发现将拟 南芥的根用硫醇处理，只会减少a p r ，而a t p s 、s i r 和o a s t l 不会减少，因此可 以通过用”5 0 4 2 一控制输出来定量a p r 对硫酸盐同化的作用( v a u c l a r ee ta 1 2 0 0 2 ) 。 从内部的硫酸盐开始，a p r 的输出控制效应为0 7 0 9 ( 相当于总量的7 0 和9 0 ) ， 说明该途径受至i j a p r 的强烈控制。但是，因为硫酸盐的吸收更多受到g s h 的抑制， 所以a p r 与硫酸盐吸收系统共同控制硫的输出。a p r 确实是硫酸盐还原途径的关 键酶( v a u c l a r ee ta 1 2 0 0 2 ) 。这个结论由t s a k r a k l i d e s 等进一步进行了证明，他证 明细菌a p r 在拟南芥中的表达会导致硫酸盐吸收途径的紊乱，硫醇和其他还原态 硫复合物的积累，例如硫代硫酸盐( t s a k r a k l i d e se ta 1 2 0 0 2 ) 。 1 2 根部硫酸盐的吸收 植物依靠根细胞质膜上的质子硫酸盐协同运输体从土壤中吸收硫酸盐，这 是硫酸盐吸收的第一步。进入植物体后，硫酸盐是运输和储存的主要形式。硫酸 盐在质体中的同化、在液泡中贮存以及为满足源库需求而在器官问进行的长距 离运输，这些过程都需要特异性硫酸盐转运蛋白的参与。酵母功能互补实验和膜 囊泡研究证实质膜硫酸盐主动运输是一种依赖于跨膜质子梯度的质子硫酸盐协 同运输( l a s sa n du l l n c h e b e r i u s19 8 4 ；h a w k e s f o r de ta 1 19 9 3 ；s m i me ta 1 19 9 5 ) 。 早期已有学者从生理水平和功能水平对硫酸盐穿过质膜进入细胞的机理进 行了研究，研究发现，在植物中硫酸盐的吸收可分为饱和高亲和阶段和不饱和低 亲和阶段( l e g g e ra n de p s t e i n1 9 5 6 ；e p s t e i n1 9 6 6 ) 。自从s m i t h 用酵母功能互补的 方法从柱花草( s t y l o s a n t h e sh a m a t a ) 中首次克隆得到植物硫酸盐转运体c d n a 丌 始，就发现植物硫酸盐转运体可以分为高亲和性和低亲和性两类，之后更多的实 验研究发现，初始阶段硫酸盐进入植物根系的过程主要是由高亲和性硫酸盐转运 山东人学硕上学位论文 体负责的( s h i b a g a k ie ta 1 2 0 0 2 ；y o s h i m o t oe ta 1 2 0 0 2 ；m a r u y a m a n a k a s h i t ae ta 1 2 0 0 3 ) 。 植物根部从环境中吸收硫酸盐是由第一亚族的高亲和性硫转运体介导的。在 不同的植物中对高亲和性硫转运体的分子特性进行了研究( s m i t he ta 1 1 9 9 5 ； s m i t he ta 1 1 9 9 7 ) ，研究结果与早期生理学研究中测定的硫酸盐吸收动力学是一 致的。另外，当植物受到硫酸盐缺乏胁迫时，高亲和性硫转运体的m r n a 会在根 部积累。拟南芥中分离到的基因也表现出相似的特征( m a r u y a m a - n a k a s h i t ae ta 1 2 0 0 3 ) 。拟南芥中，第一亚族的成员s u l t r l ；1 和s u l t r l ；2 编码高亲和性硫转运体，二 者在吸收硫酸盐时表现出高亲和性动力学特征，主要表达于根毛、根表皮和根的 皮层细胞中，而且在硫缺乏时会大量积累。在独立质膜膜囊实验( h a w k e s f o r de ta 1 1 9 9 3 ) 和完整植株( l e e1 9 8 2 ；c l a r k s o ne ta 1 1 9 8 3 ) 发现，外界营养环境中硫的缺 乏会刺激植物硫酸盐吸收能力的加强，同时伴随着第l 亚族成员在m r n a 和蛋白 质水平上的表达变化( c l a r k s o ne ta 1 1 9 9 2 ；h a w k e s f o r da n dw r a y2 0 0 0 ) 。在硫营养 充足时，a t s u l t r l ；2 会大量表达，对拟南芥根部硫酸盐的吸收起重要的作用 ( m a r u y a m a n a k a s h i t ae ta 1 2 0 0 3 ) 。当a t s u l t r l ；2 被敲除时，植物整体的硫状况会受 到影响，硫酸盐的吸收能力也会降低，最终会诱导与硫同化相关酶和氧化胁迫响 应基因的表达。当硫酸盐缺乏，鳓t s u l t r l ；2 被敲除时，a t s u l t r l ；1 的m r n a 被高 度诱导表达。a t s u l t r l ；1 与a t s u l t r l ；2 在植物根部的同一细胞层共同表达，但是 a t s u l t r l ；l m r n a 的上调表达并不能恢射t s u l t r l ；2 被敲除引起的硫酸盐吸收能力 的降低( m a m y a m a n a k a s h i t ae ta 1 2 0 0 3 ) 。 1 3 真核生物中的硫酸盐转运蛋白基因家族 在植物中，第一个被克隆到的编码高亲和性硫酸盐转运蛋白( h a s t ) 的 c d n a 来自热带豆类植物s t y l o s a n t h e sh a m a t a ( s m i t he ta 1 1 9 9 5 ) 。第一个模式植 物拟南芥基因组测序的完成，加速了硫酸盐转运蛋白基因家族的研究。研究发现， 拟南芥中，该家族是由1 4 个基因组成的多基因家族。根据蛋白序列的相似性可 将这1 4 个硫酸盐转运蛋白基因分为5 个亚族( h a w k e s f o r d2 0 0 3 ) 。第一亚族包括 三个成员：a t s u l t r l ；1 ，a t s u l t r l ；2 和a t s u l t r l ；3 ，第二亚族包括两个成员：a t s u l t r 2 ；1 和a t s u l t r 2 ；2 。其余的三个亚族分别是第三亚族( a t s u l t r 3 ；1 至a t s u l t r 3 ；5 ) 、第四 9 山东大学硕士学位论文 亚族( a t s u l t r 4 ；1 和a t s u l t r 4 ；2 ) 以及第五亚族( a t s u l t r 5 ；1 和a t s u l t r 5 ；2 ) 。 同 源分析表明在其他物种如油菜、玉米和水稻中也分离到了相似的基因( h o p k i n se t a 1 2 0 0 4 ；t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 6 ；k o r a l e w s k ae ta 1 2 0 0 7 ；k o r a l e w s k a ae ta 1 2 0 0 7 ) o 拟南芥和水稻中编码硫酸盐转运蛋白的氨基酸序列的系统发生关系如图1 2 所示 ( h a w k e s f o r d2 0 0 3 ；b u c h n e re ta 1 2 0 0 4 ；t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 6 ) 。 拟南芥中，第一至第四亚族的成员在一个复杂的网络系统中相互作用，以维 持硫酸盐的动态平衡，包括硫酸盐的吸收( a t s u l t r l ；1 和a t s u l t r l ；2 ) ( t a k a h a s h ie t a 1 2 0 0 0 ；v i d m a re ta 1 2 0 0 0 ；s h i b a g a k ie ta 1 2 0 0 2 ；y o s h i m o t oe ta 1 2 0 0 2 ) ，帮助硫酸 盐至韧皮部的运输( a t s u l t r l ；3 ) ( y o s h i m o t oe ta 1 2 0 0 3 ) ，硫酸盐从根到茎的转移 ( a t s u l t r 2 ；1 和a t s u l t r 3 ；5 ) ( k a t a o k ae ta 1 2 0 0 4 b ) ，以及硫酸盐从液泡到细胞质 的流动( a t s u l t r 4 ；1 和a t s u l t r 4 ；2 ) ( k a t a o k ae ta 1 2 0 0 4 a ) 。用缺失硫酸盐运输能力 的酵母突变体进行异源表达，成功地确定了第一和第二亚族的功能。迄今为止， 可将所有已研究的硫酸盐转运蛋白分为两大类：h a s t ( 高亲和性硫转运蛋白) 和l a s t ( 低亲和性硫转运蛋白) ，第一亚族和第二亚族分别是h a s t 与l a s t ( s m i t he ta 1 19 9 5 ；t a k a h a s h ie t a 1 19 9 7 ；v i d m a re ta 1 2 0 0 0 ；y o s h i m o t oe ta 1 2 0 0 2 ) 。有趣的是，第三亚族虽然不能拯救酵母突变体的缺陷表型，但是a t s u l t r 3 ；5 与a t s u l t r 2 ；1 共存于根的木质部薄壁细胞和中柱鞘中，协助a t s u l t r 2 ；1 完成硫酸 盐从根到茎的转移( t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 0 ；y o s h i m o t oe ta 1 2 0 0 3 ；k a t a o k ae ta 1 2 0 0 4 b 1 。最近的研究表明，第五亚族的成员a t s u l t r 5 ；2 ，被重命名为m o t l ，是 一个高亲和性的转运体，对于植物从土壤中吸收微量的钼酸盐是必需的( t o m a t s u e ta 1 2 0 0 7 ；b a x t e re ta 1 2 0 0 8 ) 。 1 0 0 1 g t o u p 5 图1 2 水稻和拟南芥中硫酸盐转运蛋白基因家族的进化树分析 在结构方面，拓扑学预测表明，前四个亚族的硫转运蛋白家族中的成员都保 留着1 2 个m s d s ( 跨膜结构域) ，在碳端都有一个s t a s 结构域( s u l f a t et r a n s p o r t e r a n da n t i s i g m aa n t a g o n i s t ) ，分析还表明其c 端和n 端都向着膜内侧，且其蛋白的 拓扑构象在进化上呈现出高度的保守性( 图1 3 ) ；第五亚族与其他4 个亚族的 成员同源性较低，且其蛋白无s t a s 结构域。 1 4 高亲和 1 4 1 植物中的高亲和性硫转运蛋白 酵母突变体的功能互补实验是鉴别离子转运体的有效方法( f r o m m e ra n d n i n n e m a n n1 9 9 5 ；b a r b i e r - b r y g o oe ta 1 2 0 0 1 ) 。硫酸盐转运体基因的克隆就是借助 该方法，最早用来克隆硫酸盐转运体c d n a 的是缺失硫酸盐转运体的热带豆荚 s t y l o s a n t h e sh a m a t a 的酵母硒酸盐抗性突变体y s d l ( s m i t he ta 1 1 9 9 5 a ) ，克隆得到 的s h s t l 和s h s t 2 在酵母表达系统中表现出高亲和性的硫酸盐吸收活性。在硫缺 乏条件下，植物根部的s h s t l 和s h s t 2m r n a 含量增加，进一步证明了其在硫酸 盐吸收中的重要性。从大麦( s m i t he ta 1 1 9 9 7 ；v i d m a re ta 1 1 9 9 9 ) 、拟南芥 ( t a k a h a s h ie ta 1 2 0 0 0 ；v i d m a re ta 1 2 0 0 0 ；s h i b a g a k ie ta 1 2 0 0 2