（植物学专业论文）应用pcrdgge分析磁性流化床生物脱硫反应器的菌群多样性.pdf

中文摘要 控制环境污染己成为当今各级政府和学术界面临的重大课题，微生 物法去除s 0 2 是一种新型简单高效的处理方法，这种方法主要是靠脱硫系 统中生物膜上的硫酸盐还原菌菌群和无色硫细菌菌群起作用，但是硫酸 盐还原菌和无色硫细菌都包括很多的菌种，究竟该生物膜上有多少菌种， 有哪些优势菌种，这为进一步阐明微生物脱硫机理、更好的应用和推广 微生物脱硫方法提供有力的实验依据。 研究生物膜的微生物多样性，传统方法已远远不能满足。p c r d g g e 技术是以聚合酶链式反应为基础的变性梯度凝胶电泳，并且可以和传统 方法、杂交技术、克隆测序技术等结合起来，从而全面认识微生态的组 成。d g g e 主要是利用含有浓度线形递增的变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳 来分离d n a 片段，它的分辨精度比琼脂糖电泳和一般的聚丙烯酰胺凝胶 电泳更高，甚至可以检测到一个核苷酸水平的差异。 。 本研究采用c t a b 法抽提菌群的总d n a ，然后扩增1 6 sr d n a 的v 3 区， 然后进行d g g e 分离不同的菌种，进行克隆测序以及系统发育分析。 本研究首次应用p c r - d g g e 技术分析不同时期微生物烟气脱硫两个反 应器的生物膜多样性，并进一步对部分d g g e 条带进行了克隆测序，并绘 制了进化树。d g g e 结果表明在厌氧反应器的启动期含有五个菌种，负荷 运行期和稳定运行期都可观察到四个菌种，其中两个为优势种；在好氧 反应器的启动期含有八个菌种，负荷运行期和稳定运行期都可观察到六 个菌种，其中各含有两个优势种。通过对运行稳定期的条带进行回收、 克隆、测序，利用b l a s t 软件对测序结果在g e n b a n k 中进行了同源性对 比，利用c l u s t a l x l 8 3 和m e g a 软件，通过邻接法构建系统发生树。结 果表明与条带s 3 2 相近的是u n c u l t u r e db a c t e r i u mg e n e c l o n e ：b s a 2 b - 0 4 ，相似性达到9 8 8 4 ；条带$ 3 - 3 相近的是 i r o n - r e d u c i n ge n r i c h m e n tc l o n ec 1 - a 2 ，相似性达到1 0 0 ；与条带 $ 3 - 4 相近的是u n c u l t u r e db a c t e r i u mm l e l 一9 ，相似性为9 9 4 0 ；与条 带c 3 - 4 相近的是u n c u l t u r e db a c t e r i u mc l o n et c c 一1 4 ，相似性1 0 0 。 由于生物信息学是一门新生学科，它的数据库还不完普，在g e n b a n k 上 找到的这些相似性较高的菌种还不能完全确定菌种。另外本实验经d g g e 分离的两个条带c 3 - 4 和c 3 5 克隆测序后序列完全一致，其原因可能是 后续的p c r 出现个别碱基的差错。 1 6 sr d n a 的v 3 区约2 0 0 b p ，由于信息量较少还不足以完全作为分类 依据，今后实验可以对其它高变区或1 6 sr d n a 全长进行研究，综合分析， 从而得到更有力的结果。 关键词：微生物烟气脱硫，生物膜，p c r - d g g e ，克隆，进化树 a ni m p o r t a n tp r o b l e mw h a tt h eg o v e r n m e n ta n dt h ea c a d e m i am u s tb e f a c e dw i t hi sc o n t r o l l i n ge n v i r o n m e n t a lp o l l u t i o n a n d 吣i l l gm i c r o b et o 、 ，i p e o f fs 0 2i sas i m p l ea n de f f i c i e n tw a yt os o l v et h i sp r o b l e m t h i sw a ym o s t l y d e p e n d s0 1 1s u l f a t e - r e d u c i n gb a c t e r i a ( s r b ) a n dc o l o u r l e s ss u l f u rb a c t e r i a ( c s b ) o ft h eb i o m e m b r a n e ，b u ti nf a c ts r ba n dc s ba l li n c l u d el o t so f s p e c i e s t h e nh o wm a n ys p e c i e sa r et h e r eo n t h eb i o m e m b r a n e ? a n dw h i c h a r et h ed o m i n a n ts p e c i e s ? t h e s ea r ev e r yi m p o r t a n tt or e a l l yc l a r i f yt h e m e c h a n i s mo f m i c r o b ed e s u l f u r i z a t i o na n du s et h em e t h o dw i d e l y t or e s e a r c hm i c r o b i a ld i v e r s i t yo ft h eb i o m e m b r a n e ，t h et r a d “i o n a l t a x o n o m i cw a y sc a nn o tw o r ko u t p c r - d g g ei sak i n do fn e wa n de f f i c i e n t t e c h n i ca n dt h i st e c h n i cc a nf a l lt o g e t h e rw i t ht h et r a d i t i o n a lt a x o n o m i cw a y s a n do t h e rm o l e c u l a rt e c h n i cs u c h 雒h y b r i d i z i n g 、c l o n i n ga n ds e q u e n c i n g , a n d s ow ec a l lk n o wi t s c o m p o s i t i o nc o m p l e t e l y d g r g es e p a r a t i n gd n a s e g m e n td e p e n d so np o l y a c r y l a m i d eg e le l e e t r o p h o r e s i sw i t hd e n a t u r a n t i t s r e s o l v i n gp o w e ri sh i g h e rt h e na g a r o s eg e l e l e c t r o p h o r e s i sa n dp o p u l a r p o l y a e r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i s ，a n dd g g ec a ne v e nd i f f e r e n t i a t eo n l y o n en u c l c o t i d e f i r s tt o t a ld n aw a se x t r a g t e db yc t a bm e t h o di nm yr e s e a r c h t h e n t h ev 3r e g i o no f1 6 sr d n aw a sa m p l i f i e db yp c r a n dt h e nd g g eb a n d s w e r ee x c i s e da n dc l o n e d ，a n dt h ep o s i t i v ec l o n e sw e r es e q u e n c e da n db l a s ti n g e n b a n k a tl a s tp h y l o g e n e t i ca n a l y s ew a sp e r f o r m e d 啊舱r e a s e r c ha n a l y z e dt h eb i o m e m b r a n ei nt w or e a c t o r si nd i f f e r e n t p e r i o d s 嘁n gp c r 舰a n dc l o n i n gt e e n i ef o rt h ef i r s tt i m e t h er e s u l t so f d g g ei n d i c a t e dt h a tt h e r ew e r ef i v es p e c i e si np r o m o t o rp h a s ea n df o u r s p e c i e si nr u n n i n gp h a s ei n c l u d el o a d i n gp h a s ea n ds t e a d yp h a s ei na e r o b i c r e a c t o r ，a n dt h e r ew e r ee i g h ts p e c i e si np r o m o t o rp h a s ea n ds i xs p e c i e si n r u n n i n gp h a s ei n c l u d el o a d i n gp h a s ea n ds t e a d yp h a s ei na n a e r o b i cr e a c t o r t h e r ew e r et w od o m i n a n ts p e c i e sb o t hi nr u n n i n gp h a s eo fa e r o b i cr e a c t o ra n d i nr u n n i n gp h a s eo fa n a e r o b i cr e a c t o r p h y l o g e n e t i ct r e eb a s e do nt h e1 6 s r d n as e q u e n c ed i s p l a y e dh i g hi d e n t i t ya b o v e9 8 。t h e yw e r e ：u n c u l t u r e d b a c t e r i u mg e n ec l o n e ( b s a 2 b 一0 4 ) ，i r o n r e d u c i n ge n r i c h m e n tc l o n ec 1 一a 2 ， u n c u l t u r e db a c t e r i u mm l e l - 9 ，u n c u l t u r e db a c t e r i u mc l o n et c e 一1 4 i n a d d i t i o n ，t h er e s u l t so fs e q u e n c i n go f b a n dc 3 - 4a n db a n dc 3 5w h i c hc a nb e s e p a r a t e db yd g g ew e r ec o m p l e t e l ys a m e it h i n kt h er e a s o nm a y b eo n e o r t w ob a s ep a i r sh a v em i s t a k ei ns u b s e q u e n ta m p l i l y i n g t h e r ea r ea b o u t2 0 0b pi nv 3r e g i o no f1 6 sr d n a ，s ot h el e s s e r i n f o r m a t i o nc a nn o tb e c o m et h eo n l yt a x o n o m i cb a s i s s oo t h e rr e g i o n so f 1 6 sr d n ao rt h et o t a ll e n g t hw o u l db es t u d i e df o rt h ef u t u r et of i n dm o r e p o w e r f u lr e s u l t s k e yw o r d s ：b i o l o g i c a lf l u e g a s d e s u l f u r i z a t i o n ，b i o m e m b r a n e ， p c r - d g g e ，c l o n e ，p h y l o g e n e t i c 应用p c r d o g e 分析磁性流化床生物脱碗反应器的菌群多样性 a c r a 见p a m s f b a n m s f b a p b i s c t a b c s b d ( e d n t p e b e d t a f i s h f g d i p t g m s f b 0 d 0 u t p c r p v a r f l p s d s s r b s s c p t a q t e 姗! d t g g e 缩略语中英文对照 丙烯酰胺( a c r y l a m i d e ) 扩增片段长度多态性( a m p l i f i e df r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ) 好氧产硫磁性稳态流化床反应器 厌氧硫酸盐还原磁性稳态流化床反应器 过硫酸铵( a m m o n i u mp e r s u l f a t e ) 甲叉双丙烯酰胺( m e t h y l e n eb i s a c r y l a m i d e ) 十六烷基三甲基溴化铵( c e t y l t r i m e t h y l a m m o n i u mb r o m i d e ) 无色硫细菌( c o l o u r l e s ss u l f u rb a c t e r i a ) 变性梯度凝胶电泳( d e n a t u r i n gg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 脱氧核普三磷酸( d e o x y n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ) 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ) ， 乙二胺四乙酸( e t h y l e n ed i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d ) 荧光原位杂交( f l u o r e s c e n c ei ns i t uh y b r i d i z a t i o n ) 烟气脱硫技术 异丙基一b d - 硫代半乳糖苷( i s o p r o p y l 一口- d - t h i o g a l a c t o s i d e ) 磁稳流化床( m a g n e t i c a l l ys t a b i l i z e df l u i d i z e db e d s ) 光密度( o p t i c a ld e n s i t y ) 操作分类单元( o p e r a t i o n a lt a x o n o m i cu n i t ) 聚合链式反应( p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ) 聚乙烯醇( p o l y v i n y la c e t a t e ) 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t h p o l y m o r p h i s m ) 十二烷基硫酸钠( s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ) 硫酸盐还原菌( s u l f a t er e d u c i n gb a c t e r i a ) 单链构象多态性( s i n g l es t r a n dc o n f o r m a t i o np o l y m o r p h i s m ) 水生栖热菌( t h e r m u sa q u a t i c u s ) 四甲基乙二胺( t e t r a m e t h y l e t h y l e n e d i a m i n e ) 温度梯度凝胶电泳( t e m p e r a t u r eg r a d i e n tg e le l e c t r o p h o r e s i s ) 4 8 内蒙古师范大学硕士学位论文 1 引言 1 1 微生物烟气脱硫的重要意义 我国是世界上最大的煤炭生产和消费国之一，煤炭在中国能源结构中的比例高达 7 5 以上，我国排放的s o ：9 0 均来自于燃煤。据统计，全国大约有1 3 的资源煤含硫 量( 质量分数) 高于2 “。煤的大量燃烧，使全国大气呈煤烟型污染。近几年，我国 虽然采取了排污收费政策，但每年的s 0 ：排放量仍超过2 0 0 0 万吨，酸雨污染面积迅 速扩大，对我国农作物、森林和人体健康等方面造成巨大损害，也成为制约我国经济、 社会可持续发展的重要因素。1 。控制环境污染、保护尘念地球已成为当今各级政府和 学术界面临的重大课题。面对环保压力，开发和使用适合我国国情的脱硫技术以控制 和削减燃煤过程产生的s o ：污染已是刻不容缓。寻求一种经济实用的烟气脱硫技术， 对控制我国大气污染具有现实意义。 脱硫技术一般可分为燃烧前、燃烧中和燃烧后三种。其中燃烧后脱硫也就是所谓 的烟气脱硫技术( f g d ) 。烟气脱硫是应用化学或者物理的方法将烟气中的s 仉予以 固定和脱除。按照脱硫方式和产物的处理形式不同，烟气脱硫一般又可分为于法、半 干法和湿法三类。湿法烟气脱硫技术就是液体或浆状吸收剂在湿状态下脱硫和处理脱 硫产物。该法具有脱硫反应速度快、脱硫效率高等优点，但存在投资和运行维护费用 都很高，脱硫后产物处理较难，易造成二次污染，系统复杂，启停不便等问题。该法 主要适于大型燃煤电站锅炉的烟气脱硫。在湿法烟气脱硫技术中成熟的技术主要有： 石灰石一石膏洗涤法、海水脱硫法、氧化镁法、双碱法和氨吸收法等，而处于研究中 的技术有：膜法和微生物法等。膜法烟气脱硫技术主要利用多孔膜将气相和吸收液分 开，烟气中的s o s 和c 0 ：可通过微孔膜的开孔处与吸收液进行吸收传质，而其他气体 则被截留在气相中。但国产膜性能低，产值仅为世界市场的1 5 0 0 微生物法烟气脱 硫是利用微生物水溶液或悬浮乳液吸收气相中s 0 2 ，然后利用微生物脱除液相中溶解 的硫酸根。随着基因工程技术的成熟与应用，高效脱硫工程菌将使微生物烟气脱硫技 术大有作为。微生物法去除s o ：作为种新型的简单、高效的处理方法具有传统方法 所无法比拟的优点：投资和运行费用较低；s 0 2 的去除率较高：没有二次污染；生成 戍用p c r - d g g e 分析磁性流化床生物脱饿反戍嚣的菌群多样性 可利用的元素硫；生产高质量的单细胞蛋白等。但该方法的研究与应用在国内还是一 项空白，在国外也还主要处于实验室小试阶段，许多机理还有待进一步探讨，工艺方 法也需进一步改进，以扩大处理气量，提高其稳定性和可靠性，使操作条件更简单、 更易于控制。微生物法去除s q 是一项具有较高社会效益、环境效益和经济效益的工 程技术，具有非常广阔和良好的应用前景。 1 2 微生物烟气脱硫的研究进展 微生物脱硫研究起源于微生物选矿。1 9 4 7 年，c o l m e r 和h i n k l e 发现并证实化能 自养细菌( zf e r r o o x i d a n s ) 能够促进氧化并溶解煤炭中存在的黄铁矿，从而开启了生 物湿法冶金研究。1 l e a t h a n 和t e m p l e 等分别发现某些化能自养微生物与煤中f e s t 的氧化有关，并从煤矿废水中分离出氧化亚铁硫杆菌( t h y o b a c i l l v sf e r r o x i d a n s ) ”。 2 0 世纪5 0 年代后期，陆续发现了一些能脱除煤中无机硫和有机硫的细菌。到2 0 世 纪7 0 年代，日本中央电力研究所从土壤中分离出一种氧化铁硫杆菌，可有效除去煤 炭中的无机硫嘲。1 9 7 8 年，美国爱达荷国家工程实验室用氧化亚铁硫杆菌和氧化琉硫 杆菌的混合物处理煤，4 5 天内可脱除9 7 的无机硫”1 。我国这方面的研究起步较晚， 虽取得了可喜进展，但仍处于研究开发阶段。1 9 9 0 年，我国学者徐毅、钟慧芳等用 分离到的氧化亚铁硫杆菌进行煤炭脱硫试验，效果良好”1 ：杨秀山等“1 利用厌氧一缺 氧一好氧工艺处理城市废水，对其缺氧相中的脱氮硫杆菌进行了研究；左剑恶等 在微生物处理硫酸盐废水方面进行了研究；王永川等”1 在细菌湿法烟气脱硫方面进行 了初步研究。 烟气生物脱硫技术为从气体物流中净化硫开辟了一条新途径，目前世界上有许多 公司正致力于这方面的研究和开发。并取得了一定进展。荷兰p a q u e s 公司和 h o o g o v e n s 能源和环境技术服务公司共同开发了b i o s t a rt 艺“町。p a q u e s 公司开发的 另一种生物脱h ：s 工艺已在荷兰一家造纸厂实现了工业化，一套能力为0 2 0t d 的 产硫装置已投入运行，该装置可将气体物流中h 书含量从1 2 0 0 0l g g 降至4 0 1 tg g 东京n k k 公司将硫醚杆状细菌、铁氧化细菌应用于其开发的b i o - s r 工艺中，硫酸铁 溶液从气体物流中吸附h 2 s 并生成元素硫和硫酸亚铁溶液，硫经过滤后，用硫醚杆状 细菌将f e ”再生为f e “i n e h 正在开发种新工艺。该工艺用硫酸盐还原菌和洗涤烟 道气s o , 时聚集的浆状石膏在一个搅拌罐中同淀粉混合，产生h 茹。h 2 s 再被转化为元 2 内蒙古师范大学硕士学位论文 素硫，这项工作尚处于实验阶段目前国内在这一领域的研究主要集中在煤碳脱硫， 利用微生物脱除烟气s o , 即使实验室规模也还未见工艺完整运行的实验报道，仅对烟 气s 如微生物脱硫的某一环节进行了研究，对工业废气h 2 s 的治理也仅限于实验室和 半工业化试验阶段。 微生物脱硫系统都是基于自然界生物硫素循环机理1 建立的，主要包括两大类： 一类是利用微生物氧化和过渡金属离子的催化氧化机理脱硫；另一类是利用硫酸盐还 原菌和硫氧化菌协同作用将烟气s 0 2 转化为单质硫。显然，各种脱硫菌的分离、纯化 及生理生化研究至关重要。 1 3 脱硫菌研究简介 用于微生物烟气脱硫的菌种主要包括硫酸盐还原菌( s u l f a t er e d u c i n g b a c t e r i a ，s r b ) 和无色硫细菌( c o l o u r e s ss u l f u rb a c t e r i a ，c s b ) 。硫酸盐还原菌 参与硫污染物还原，以脱硫孤菌( d e s u l f o v i b r i od e s u l f u r i c a n s ) 为典型代表，能将 硫酸盐还原成也s 和硫化物：无色硫细菌以多种硫杆菌( r h i o b a c i l l u s ) 为代表，能够 氧化硫化氢、元素硫、硫代硫酸盐和连四硫酸盐等形成硫酸，并从中获取能量“” 1 3 i 硫酸盐还原菌 硫酸盐还原菌( s r b ) ，1 8 9 5 年首先由b e i j e r i n c k 发现，至今已有百年的历史， d e l d e n 于1 9 0 3 年发表了有关海水中耐盐菌种的报道，e l i o n 于1 9 2 5 年发现了一种嗜 热的硫酸盐还原菌“”。1 9 3 0 年b o a r s “”系统综述了硫酸盐还原菌，1 9 3 6 年b u n k e r “” 和1 9 4 9 年b u t l i n “”等人又对早期的研究工作进行了总结。在相当长的一段时间里， 对硫酸盐还原菌的研究进展缓慢，一直到7 0 年代前期，所确认的硫酸盐还原菌的菌 种也只有脱硫弧菌( d e s u l f o v b r l o ) 和脱硫肠菌( d e s u l f o t o m a c u l u 而、脱硫单胞菌 ( d e s u l f o m o n a s ) 等3 个属。到了7 0 年代后期，大量的关于河流和海底沉积物的研究， 又发现了许多新的s r b 。1 9 7 6 年p f e n n i n g 和b i b e l o ”发现了一种能氧化乙酸的硫酸 盐还原菌( d e s u l f u r o m o n a sa c e t o x i d a n 国，它能在氧化乙酸的同时将单质硫而不是硫 酸盐或亚硫酸盐还原为硫化物。m i d d l e t o n 和l a w r e n c e “m 于1 9 7 7 年成功地从城市污 水处理厂的厌氧污泥中分离出了可降解乙酸的硫酸盐还原菌。而最有突出贡献的是 w i d d e l 和p f e n n i n g “”在1 9 7 7 年分离到了能利用乙酸的第一个纯的硫酸盐还原菌菌种 ( d e s u l 五o t o m a c u l u m a c e t o x d a n s ) i 在此之后，很多研究者又成功分离出来可降解其 3 应用p c r - d c , g e 分析磁性流化床生物脱硫反应器的菌群多样性 他脂肪酸的硫酸盐还原菌。 s r b 是一类形态各异、营养类型多样、能利用硫酸赫或者其他氧化态硫化物作为 电子受体来异化有机物的严格厌氧菌。它既在系统发生上具有多样性和独立性的类 群，同时也与其它有机物降解微生物有许多共同的生理生态特征。根据伯杰氏细菌 鉴定手册，第8 版矧，s r b 可以分为4 大类：第一类为革兰氏阳性、产芽孢类群。 该类群只有d e s u l f o t o m a c u l u m 7 一个属，该属中既包括能完全氧化有机底物产生c 0 ： 的种，也包括不完全氧化有机底物产生乙酸盐的种。第二类为革兰氏阴性、不产芽孢、 不完全氧化有机底物产生乙酸赫的类群，该类群包括t h e r m o d e s u f o b a c t e r i u m d e s u l f o b u l u s ，d e s u l f o m i c r o b i u m ，d e s u l 而船占，d e s u l f o v i b r i o 等属。第三类为 革兰氏阴性、不产芽孢、完全氧化有机底物产生c o 。的类群，该类群包括 d e s u l 矗o b a c t e r ，d e s u l f o b a c t e r i u m ，d e s u l o c o c c u s ，d e s u l f o m o n i l e ，d e s u l f o n e m a ， d e s u l f o s a r c y n a 等属。第四类为硫还原细菌，这类细菌是利用硫作为电子受体来异 化有机物的，这类s r b 也是革兰氏阴性、不产芽孢、完全氧化有机底物产生c o ：的类 群，包括d e s u l f u r e l l a ，d e s u f u r o m o n a s 两个属。但从1 6 sr d n a 分类来看，后3 个类群均属于万一p r o t e o b a c t e r y u m , 所以有些研究者也把s r b 分为革兰氏阳性、产 芽孢的d e s u f o t o m a c u l u m 属和革兰氏阴性、不产芽孢的6 - p r o t e o b a c t e r i u m 两大类。 s r b 是严格的厌氧菌，但分布广泛，可以存在于土壤、水稻阳、海洋( 包括深海) 、 盐水、淡水、温泉水、地热地区，油井和天然气井，含硫沉积物，河底污泥、污水， 绵羊瘤胃、动物肠道等。还可以从一些受污染的环境中检测到它的存在，如厌氧的污 水处理厂废物。s r b 可以在一5 一7 5 条件下生存，并能很快适应新的温度环境，最 适温度为3 7 c 左右。某些种可以在一5 以下生长，具有芽孢的种可以耐受8 0 的高 温。在p h 为5 9 5 的范围下生存，最适p h 为7 7 8 。“。 1 3 2 无色硫细菌 自然界中能够氧化硫化物的细菌主要包括丝状硫细菌，光合硫细菌，无色硫细菌。 无色硫细菌( c o l o u r l e s ss u l f u rb a c t e r i a ，c s b ) ，是指没有光合色素，且能氧 化硫化物并从中获得能量的一个细菌类群。不同类型的无色硫细菌具有不同的生理 学、形态学特征，对环境条件的要求也有差异。大多数无色硫细菌都在p h 中性、中 温条件下生活1 。主要的c s b 如表i 1 所示； 4 内蒙古师范大学硕一t ：学位论文 硫杆菌属杆状，单鞭毛 0 4 0 。6 0 6 4 微米， 硫化叶菌属叶圆形，无鞭毛，不运动 直径0 8 1 微米， 硫小杆菌属 大单胞菌属 卵硫蔼属 硫螺苗属 轩状，o 6 1 5 2 9 9 微米，游离时- 旱- 圆形，结合 在同体物上时呈树叉状细 胞，内含硫磺滴，细胞埋在 胶质中 圆筒形到豆形，3 0 微米跃， 用一根端鞭毛运动，有时含 有硫酸钙和硫磺颗粒 圆形到椭圆形，直径5 2 5 微米，用周身鞭毛运动常带 一个巨大的空饱和硫磺内 含物 螺旋形，5 0 微米长，带有硫 磺内含物 氧化一种或多种还原或 部分还原的硫化物形成 硫酸，好气 氧化硫磺，兼性白养，好 气生长，最透7 0 7 5 c 细胞壁无肽聚糖 纯培养不生长，代澍硫化 物或硫 土壤、淡水、海水 矿泥排水道等含硫 丰富的地方 分布于含硫丰富的 热泉中和十壤中 含硫丰富的水中 纯培养不生长，代谢硫化淡水 物或硫 代谢硫或硫化物，微嗜含硫丰富的水中 氧，过氧化氢酶阴性 代谢硫或硫化物，朱得到含硫丰富的水中 纯培养 对无色硫细菌代谢途径的研究表明，碳的代谢途径较为简单和统一，即多数无色 硫细菌都通过c a l v i n 循环迸行二氧化碳的固定：但不同种类的无色硫细菌对硫的代 谢途径不同，不仅代谢所涉及的酶和电子传递系统也不尽相同，而且反应所发生的部 位也可能不相同。大多数无色硫细菌以0 2 作为电子受体，因而多数无色硫细菌是好 氧菌。但某些无色硫细菌可在厌氧条件下以n 如或n 町作为电子受体，将其还原为n ：， 如zd e n t r i f i c a n 一= 1 。多数无色硫细菌是体外排硫的。k u e n e n 。7 1 等人经研究发现， 无色硫细菌在营养物质受限制而有足够硫化物时，可在几乎无明显生长的情况下，高 5 堕旦鉴墅垡塑曼坌堑堂趣螫生蛰睨硫反成糕的菌群多样性 效地将硫化物甚至胞外的单质硫氧化。与光和硫细菌每增长l 克细菌细胞能产生卜2 克硫单质相比，无色硫细菌的氧化能力更强。每增长l 克细菌细胞至少可产生2 0 克 单质硫嗍 1 4 脱硫菌群( 生物膜) 在微生物脱硫中的应用 由于不同微生物需要的能源不同，因此用不同方法脱除无机硫选用的菌种也不同 若能将各种优势菌种混合培养，会比单独使用某菌种脱硫效果更显著汹。本实验室 开发的烟气微生物脱硫系统运行结果也说明：生物脱硫反应器采用优势菌群较单一脱 硫菌种脱硫效果更为显著。生物膜是一种生长活跃的微生物群体，它附着在一种活性 或非活性的载体上，形成于自然环境或人工环境中，可以反复、连续地使用。生物反 应器处理有机污水成败的关键是生物膜，生物膜的高效性决定于反应器中载体表面生 物膜量及其生化活性，生物膜的结构及种群构成对有机污染物的降解效率极其重要， 是反映生物膜特性的最重要指标。因此，对烟气微生物脱硫系统中的生物膜展开深入、 系统的研究，具有重要的理论意义及实践价值。 生物流化床反应器中微生物膜种群构成的差异是影响反应器效率的最重要因素。 对于混合种群的微生物膜，好氧菌群及生长快的菌群位于膜外表层，两厌氧菌群及 增长率较低的菌群集中于膜内层啪1 。生物膜作为一个功能化的有机体，生物膜的种群 分布是根据生物整体代谢功能最优化原则有机组合的。据文献报道o “，生物膜系统种 群分布具有如下特征：厌氧和兼性厌氧菌的比例高：丝状微生物数量较多：存在较高 等的微型动物；成层分布现象，即随着反应器内负荷的变化( 污染物浓度的变化) 出 现优势菌分层分布现象。生物膜系统中微生物的种群分布分析通常采用桔黄夹氮葱染 色、荧光显微镜观察法、p c r d g g e 及扫描电镜观察法。根据生态学观点，环境因子 首先影响某些敏感生物，然后通过微生物之闻的相互作用逐步传递，超过一定限度 时引起种群结构上的波动。正是因为生物流化床体系中生物相复杂、生物种类多，并 按一定的结构组成了比较稳定的微生态群落，故当系统受到负荷冲击时，环境压力 在逐级传递过程中受到削减，从而使流化床生物膜系统较活性污泥法具有明显的抗 冲击负荷能力。 生物流化床反应器的挂膜菌种大多采用生活粪便污水或生活粪便污水和活性污 泥的混合液，有时挂膜也可加入纯培养的特异菌种菌液阍，通过底物诱导，系统内混 6 内蒙古师范大学硕i ：学位论文 合菌群出现复杂的种群演替，产生分解底物的优势菌群( s u p e r o b a c t e r i a ) 即出现在 混合微生物群落中占优势的种属。控制反应器运行条件，可使某种或几种高效降解菌 ( 优势菌群) 在反应器内占优势，同时形成多种属混合菌系协同作用的稳定的生态体 系，通过高效优势降解菌与混合菌系的协同作用，迸水中的有机污染物得以高效率降 解。韦朝海等研究了多菌种、多基质条件下硝基苯的降解，从不同的菌源中筛选与 驯化获得了硝基苯的高效降解菌枯草芽孢杆菌、门多萨假单胞菌、肺炎克雷伯式菌及 人苍白杆菌等，而且各菌系之间存在协同降解作用，复合菌的降解作用明显优于单 一菌株。近年来，国际上对生物膜种群的研究已进入到微观领域，如采用氧化还原微 电极技术研究生物膜中的层化现象及其变化规律发现泓3 ，氧化还原电位随膜深度的 变化可作为衡量特定微生物过程存在的指示因子，氧化还原电位参数的变化与微生 物反应过程的更替相关联。 1 5 生物膜微生态学研究进展 众所周知，微生物以群落的形式存在于各种环境中，发挥着重要的生态功能，微 生物群落的种群结构组成决定其生态功能。生物处理过程中微生物生态特性相关信息 的缺乏是生物处理过程稳定高效运行的“瓶颈川蚓。全面了解微生物种类、数量及时 空分布变化等生态特性、种群结构和生态功能关系及系统优化调控，是确保处理系统 稳定、高效运行的关键。 1 5 1 传统微生物生态学研究的局限性 研究环境中微生物群体结构和数量组成的科学称为微生物生态学。目前深入研究 的原核生物种类已超过4 0 0 0 种，但它远远不能反映出自然生态环境中原核生物的实 际多样性所谓生物多样性，即是指在一个集合群落中，众多不同类型生物的变化及 它们之间相对的丰度嘲。传统的微生物生态学研究微生物群落结构及多样性是将微生 物进行分离纯化培养，然后通过一般的生物化学性状，或者特定的表现型来分析，局 限于从固体培养基上分离微生物。纯培养方法和原理大多从医药微生物引过来的，这 些方法对很多环境微生物研究并不很适合。传统的微生物计数方法，如平板培养法。 用于环境样品研究时存在许多的不足：一是由于许多微生物在形态以及一些简单的生 理生化特性上具有很多的相似之处，并且传统平板培养中培养基对微生物的选择性， 使得显微镜技术和纯培养技术在研究微生物群落结构方面存在很多的缺陷。研究证 7 应甩幽i - d g g e 分析磁性流化床生物脱硫反虎器的菌群多样性 明，自然界除了我们己经获得并鉴定的微生物物种以外，还存在大量未被认识的微生 物物种，包括不可培养、难培养的微生物及其自然界中环境基因组等。因此，利用传 统方法获得的关于大量微生物多样性、种群组成和结构特征的结果便显得不够完善。 根据微生物原位的、不依赖于培养的微生物系统发育学研究结果认为：自然界中，通 过实验室人工培养方法己经被分离和培养的微生物物种数量仅占估计数量的1 - 5 ， 而其余9 5 9 9 微生物种群还仍然未被分离和认识1 。二是无法充分揭示活性污泥生 物反应器的实时的、有意义的信息；三是传统的显微方法，难于获得微生物群落结构 和空间分布的有关信息，因此不利于根据微生物群落多样性的变化迅速判断环境的变 化。s c h r a m 啪3 等认为传统的显微方法难于获得微生物群落结构和空间分布的有关 信息，因而不利于根据微生物群落多样性的变化以迅速判断环境的变化。 因此，传统的微生物培养法只能反映极少数微生物的信息，不能充分了解生境中 微生物的生态功能。也无法全面地估价其中微生物群体的多样性。 1 5 2 分子生物学方法在生物膜多样性研究中的应用 微生物学家一直在寻找一种有效的方法来研究环境样品中的微生物的群落结构。 而利用分子生态学理论和技术，研究各种不同生态系统微生物物种种群组成、结构及 其演替规律，揭示自然界环境中( 尤其是极端环境) 微生物多样性的真实水平及物种 组成，既可以避免传统微生物学方法在研究微生物群落结构方面的局限性，又能够从 本质上对自然界微生物多样性、适应生存及其与环境之间的关系有系统和全面的认识叭”。 随着分子生物学技术的发展，人们探索出以1 6 sr r n a 基因为基础，结合d n a 扩 增( p c r ) 技术的一种新的研究原核微生物多样性的手段。原核微生物的核糖体有5 s r r n a 、1 g sr r n a 和2 3 sr r n a 。p a c e 等“”( 1 9 8 6 ) 首次将5 sr r n a 基因用于环境样品 中总微生物的测定，随之很快被用于微生物多样性研究领域。由于5 sr r n a 基因相对 较小( 约1 2 0 个核苷酸) ，携带信息相对较少，因而揭示微生物群落多样性的能力有限。 1 6 sr r n a 的长度在1 4 7 5 1 5 4 4 个核菅酸之间，约占细菌r n a 含量的8 0 9 6 ，分子排列顺 序有些区段变化非常缓慢。是最早作为分子钟的基因。应用也最广泛，素有“细菌化 石”之称嗍从二十世纪七十年代开始，w o e s e 和0 1 s e n 开始用i g sr r n a 寡核苷酸 技术对原核生物和真核生物进行比较分析，最终总结出原核生物系统发生的总体框架， 建立了古细菌界，提出了三界系统，即古细菌、真细菌和真核生物。相对于其它系统 学标记，1 6 sr d n a 有以下优点： 8 内蒙古师范大学硕：l ：学位论文 ( 1 ) 1 6 sr d n a 为细胞共有，既具有保守区，又具有高变区，根据其结构的变化 规律，把其全长划分为9 个高变区：v i - v 9 和期间的保守区“5 1 ( 如图1 1 ，1 2 所示) 保守性能够反映生物物种的亲缘关系，为系统发生重建提供线索；高变性则能揭示生 物物种的特征核酸序列，是属种鉴定的分子基础。 ( 2 ) 1 6 sr d n a 作为“分子钟”已进行了广泛的研究，并积累了大量的基本数据 用于比对分析。目前除从n c b i ，e m b l 和d d b j 等公用数据库可以搜索到大量物种的 1 6 sr d n a 序列外，还可以访问专门用于核糖体序列分析的r d p ( r i b o s o m a ld a t a b a s e p r o j e c t ) 数据库。 ( 3 ) 1 6 sr d n a 全长约1 5 4 0 b p ，片段长度适中，既含有足够的遗传信息以进行数 据分析又适合实验操作。 v lv 2v ，v 4 ”v 6、7v 。、f 9 _ 【：j i v 图i 11 6 sr d n a 基因结构模式 f i 9 1 1g e n e t i cs t r u c t u r a lp a t t e r no f1 6 sr d n a 图1 21 6 sr d n a 分子的二二级结构 f i g1 2s e c o n d a r ys t r u c t u r eo f 1 6 sr d n a ( 粗线：保守区：v l - v 9 ：高变区) 9 生星坚墨点垒堡坌堑堂丝逛垡盎生塑堕壅星壁壁箜堕壁童登堡 现在科学界已基本认同1 6 sr r n a r d n a 基因序列用于评价生物的遗传多态性 ( g e n e t i cd i v e r s i t y ) 和系统发生关系( p h y l o g e n e t i cr e l a t i o n s h i p ) ，在细菌分 类学中可作为一个科学可靠的指标。 近来许多研究人员从环境微生态系统中直接分离提取出1 6 sr i l n a r d n a 并进行序 列分析，研究了包括土壤微生物区系组成及种群变化，研究了活性污泥中微生物群 落“”，研究了人类和动物肠道正常微生物区系及生理学意义脚1 等。根据1 6 sr d n a 序 列和相关结构基因的分子生物学技术，为鉴别和量化环境中特定微生物的系统发育群 体提供了许多强有力的工具。用于1 6 sr d n a 序列分析和系统发生关系的技术主要有： 1 5 2 1 核酸杂交技术( n u c l e i ca c i dh y b r i d i z a t i o nt e c h n i q u e s ) 核酸分子杂交技术是2 0 世纪7 0 年代发展起来的一种崭新的分子生物学技术。它 是基于d n a 分